Extracto
Sin lugar a dudas el cáncer de ovario es una enfermedad incurable molesto para los pacientes con cáncer recurrente y las opciones terapéuticas son limitadas. Aunque el gen del grupo Polycomb,
Bmi-1 Windows que regula la autorrenovación de las células madre y progenitoras normales ha sido implicado en la patogénesis de muchos tumores malignos humanos, sin embargo, un papel para el IMC-1 para influir en respuesta a la quimioterapia tiene no se ha abordado antes. Aquí demostramos que el silenciamiento Bmi-1 reduce los niveles de GSH intracelular y por lo tanto sensibiliza a las células de cáncer de ovario quimiorresistentes a agentes quimioterapéuticos, tales como cisplatino. Al exacerbar la producción de ROS en respuesta a cisplatino, Bmi-1 activa el silenciamiento de PARP vía de respuesta a daño en el ADN, las caspasas y escinde dando como resultado la inducción de apoptosis en células de cáncer de ovario. En un
in vivo
modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario quimioresistente, desmontables de Bmi-1 por la entrega nanoliposomal inhibe significativamente el crecimiento del tumor. Mientras cisplatino en monoterapia fue inactivo, combinación de Bmi-1 silenciamiento junto con cisplatino abrogó casi por completo el crecimiento del tumor de ovario. En conjunto, estos hallazgos establecen Bmi-1 como un nuevo objetivo importante para la terapia en el cáncer de ovario quimioresistente
Visto:. Wang E, S Bhattacharyya, Szabolcs A, Rodríguez-Aguayo C, Jennings NB, López-Berestein G, et Alabama. (2011) Mejora de respuesta a la quimioterapia con Bmi-1 silenciamiento del cáncer de ovario. PLoS ONE 6 (3): e17918. doi: 10.1371 /journal.pone.0017918
Editor: Sujit Basu, de la Universidad Estatal de Ohio, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Enero, 2011; Aceptado: 15 Febrero 2011; Publicado: 21 Marzo 2011
Derechos de Autor © 2011 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por un Premio Marsha Rivkin piloto (RB), CA136494, CA135011 (PM) y P50 CA083639, CA151668 U54 (AS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario tiene la tasa de mortalidad más alta entre todos los tumores malignos ginecológicos [1]. A pesar de la respuesta inicial a una cirugía de citorreducción y quimioterapia de primera línea de platino /taxano, la mayoría de los tumores se desarrollan con el tiempo una recaída resistente a los medicamentos [2], [3]. La evidencia sugiere que la resistencia a cisplatino podría ser el resultado de un programa de apoptosis defectuosa. En este caso, serían necesarios mayores niveles de daño en el ADN para inducir la apoptosis señal de iniciación [4], [5].
Bmi-1 |, un gen del grupo Polycomb, regula la proliferación actividad de las células madre y progenitoras normales [6]. También es indispensable para la auto-renovación de los nervios [7], [8] y las células madre hematopoyéticas [9]. Bmi-1 es con frecuencia aumentada en una variedad de cánceres incluyendo el cáncer de ovario y su correlación con el grado /estadio clínico, metástasis en los ganglios linfáticos y el mal pronóstico [10], [11], [12], [13], [14 ha sido reportado ], [15], [16], [17], [18], [19].
Bmi-1 ¿Qué causa la transformación neoplásica de linfocitos y coopera con H-Ras dando lugar a cáncer de mama metastásico en ratones [20], [21], [22], todo lo que sugiere fuertemente un papel oncogénico en el epitelio tumores malignos. Además, las células madre aisladas de cáncer de ovario presentan mucho más altas Bmi-1 los niveles en comparación con las células del tumor mayor diferenciadas o parentales y han aumentado la resistencia a cisplatino y paclitaxel en comparación con las células tumorales [23]. También el aumento de expresión de Bmi-1 fue uno de los factores reguladores clave que determinan un fenotipo celular capturado por la expresión de una firma de muerte de cáncer en un amplio espectro de tumores malignos clínicamente letales resistentes a la terapia [24]. A pesar de esta gran cantidad de información posible papel de Bmi-1 para influir en respuesta a la quimioterapia no ha sido abordado antes. En este contexto, la determinación del mecanismo por el cual el IMC-1 silenciamiento sensibiliza las células cancerosas al cisplatino sería importante para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para combatir el cáncer de ovario.
Los agentes quimioterapéuticos más activos para el cáncer de ovario son el platino análogos, cisplatino y carboplatino. La actividad antitumoral del cisplatino (cis-diaminodicloroplatino (II) fue descubierto por Rosenberg y sus colegas en 1961 [25]. El cisplatino ha sido el fármaco más activo para el tratamiento de cáncer de ovario para las últimas 4 décadas y el pronóstico para las mujeres con cáncer de ovario puede ser definido por la respuesta del tumor a cisplatino [26]. Aunque la mayoría de los pacientes con cáncer de ovario responder a la primera línea combinación de platino quimioterapia la mayoría desarrollará la enfermedad que se vuelve resistente a cisplatino y en última instancia sucumbir a la enfermedad [26]. Así, los métodos para prevenir o superar la resistencia al cisplatino podría tener un impacto importante en la lucha contra esta enfermedad.
Aquí demostramos que
Bmi-1 | desempeña un papel importante en la sensibilización de cáncer de ovario quimioresistente células a cisplatino. también muestran que esta sensibilización es a través de una nueva vía modulada por Bmi-1, a saber, las especies reactivas de oxígeno (ROS) inducción causando el acoplamiento de la respuesta al daño del ADN (DDR) vía que conduce a la apoptosis. También establecemos Bmi-1 como diana terapéutica válida
in vivo
utilizando una metodología de fácil traducible de la entrega de siRNA nanoliposomal en un modelo ortotópico murino de cáncer de ovario.
Resultados
Desmontables de Bmi-1 mejora la sensibilidad a cisplatino in vitro
Hemos demostrado anteriormente que la reducción de los niveles de proteína Bmi-1 en células de cáncer de ovario usando microARN 15a /16 disminuye el crecimiento y la proliferación [27] clonal. Aquí, hemos querido poner a prueba si desmontables de Bmi-1 mediada por la apoptosis en las células cisplatino afectados de cáncer de ovario. knockdown eficiente de Bmi-1 en A-2780 y células CP-70 se confirmó mediante la comparación con las células de control transfectadas codificados después de 48 h (Fig. 1). Las células siRNA transfectadas se trataron con cisplatino durante 48 h y apoptosis determinados por el método Anexina /FITC. La apoptosis en las células quimiosensible A-2780 siRNA de control transfectadas fue ~ 35 y 55% cuando se tratan con 5 o 10 uM cisplatino solo, respectivamente. Por el contrario, la apoptosis en la quimiorresistente CP-70 fue ~ 17 y 40% cuando se trata con 10 o 20 uM cisplatino solo, respectivamente indicando la resistencia de estas células hacia cisplatino inducida por apoptosis (Fig. 1). Es importante destacar que el tratamiento de las células silenciadas Bmi-1 con cisplatino mejorado consistentemente la apoptosis tanto en las líneas de células por ~15-20% (Fig. 1). Por tanto las líneas celulares, el nivel basal de la apoptosis determinado sin ningún tratamiento fue ~ 10%. Apoptosis experimentos con tres líneas celulares adicionales, tales como OVCAR-5, OV-202 y OV-167 dieron resultados similares (datos no mostrados). Estos datos confirman que desmontables de Bmi-1 podría sensibilizar a las células de cáncer de ovario a cisplatino muerte celular inducida.
El panel superior demuestra caída eficiente de Bmi-1 de siRNA en las líneas celulares de cáncer de ovario (SC = revueltos control de siRNA ) como se determina por transferencia de Western. El panel inferior demuestra la apoptosis por ciento según lo determinado por la anexina /PI tinción con FITC. Las células de cáncer de ovario transfectadas con control mezclado o Bmi-1 siRNA fueron tratados con o sin cisplatino durante 48 h. NAC pre-tratamiento se llevó a cabo durante 1 h antes de la adición de cisplatino.
Donde
Recientemente, se ha informado que las neuronas, timocitos y células de médula ósea aisladas de Bmi-1 nulo ratones han aumentado los niveles de ROS apropiadas que sus homólogos de tipo salvaje [28], [29]. Además, los estudios han informado de la implicación de la generación de ROS en cisplatino mediada por apoptosis [30], [31]. Por lo tanto, para determinar cómo silenciamiento de Bmi-1 sensibiliza a las células de cáncer de ovario resistentes a los medicamentos a cisplatino inducida por la apoptosis, se investigó la posible implicación de los ROS. Por lo tanto, Bmi-1 o de control de revueltos siRNA transfectaron células de cáncer de ovario se pre-trataron con N-acetil cisteína (NAC) en 1 mg /ml durante 1 h, seguido de tratamiento con cisplatino durante 48 h. Se observó una inhibición significativa de la apoptosis mediada por cisplatino en ambos desmontables células Bmi-1 de control y en presencia de ROS scavenger NAC (Fig. 1). Estos datos indican que la apoptosis aumentada observada en el cisplatino células tratadas Bmi-1 fue silenciado debido a la implicación de los ROS y nos llevó a determinar la producción de ROS como un siguiente paso lógico.
Desmontables de Bmi-1 aumenta cisplatino ROS mediada por la producción
Se determinó la próxima producción de ROS en el control revueltos o Bmi-1 en las células transfectadas con siRNA tratados con o sin cisplatino mediante la medición de fluorescencia utilizando DCFDA. el tratamiento con cisplatino solo aumentó significativamente la generación de ROS en 10 uM en A-2780 y células a las 10 y 20 uM en las células CP-70. En ambas líneas celulares, desmontables de Bmi-1 seguido de cualquier tratamiento con cisplatino aumentó significativamente la generación de ROS (Fig. 2). Estos datos corroboran nuestras observaciones anteriores sobre la apoptosis y postula ROS como la razón principal para una mayor sensibilización de las células de cáncer de ovario a cisplatino. Con el fin de determinar la causa de la apoptosis mediada por ROS exacerbado observamos a fin de determinar los niveles totales próxima glutatión celular (GSH).
células de cáncer ovárico transfectadas con siRNA de control revueltos o Bmi-1 fueron tratados con cisplatino o sin 24 marido. Posteriormente, las células se incubaron con 5 M carboxi-H2DCFDA en HBSS fresco durante 30 min a 37 ° C. Las células se recogieron con tripsina y de fluorescencia de las células marcadas se midió a una longitud de onda de excitación de 485 nm y de emisión de longitud de onda de 530 nm mediante el uso de Fluorolog 3 (Jobin-Yvon Horiba). Relación entre la intensidad media de fluorescencia (IMF) con respecto a los no tratados de control se representa revueltos.
Bmi-1 regula la producción de GSH
Reducción de GSH es un componente crítico de la red de antioxidantes de la célula , siendo directamente involucrados en los basureros ROS y en el mantenimiento de las proteínas tiol en su estado reducido [32], [33], [34]. Por lo tanto para determinar una causa para el aumento de la apoptosis mediada por ROS observado en el IMC-1 en las células silenciadas, se determinó el próximo niveles totales de GSH intracelular. Los lisados se prepararon a partir de células transfectadas de control o revueltos Bmi-1 siRNA tratados con o sin cisplatino. Desmontables de Bmi-1 disminuyó significativamente los niveles solos celulares de GSH (~ 30% en A-2780 y ~ 40% en el CP-70) y esto se redujo aún más cuando se combina con el tratamiento con cisplatino (~ 45% en A-2780 y ~56% en CP-70) (Fig. 3). tratamiento cisplatino solo sin embargo no tuvo efecto sobre los niveles de GSH. Estos datos sugieren que al menos algunos de la tensión oxidativa mediada por los efectos observados en las células del cáncer ovárico desmontables Bmi-1 se debe a la disminución de los niveles de GSH intracelular.
El panel superior representa el total de celulares de GSH medidos (Materiales y métodos) en células de cáncer de ovario transfectadas con control mezclado o Bmi-1 siRNA tratada con o sin cisplatino para 24 h. El panel inferior representa el cambio en la expresión génica (normalizada con la actina beta y comparación con el control codificado) veces como se determina por RT-PCR cuantitativa de las células de cáncer de ovario transfectadas con control mezclado o Bmi-1 siRNA para 48 h.
a fin de investigar la causa de la reducción del contenido de GSH en el IMC-1 en las células silenciadas a continuación se determinó si fueron alterados los niveles de expresión de las enzimas clave implicados en la ruta de biosíntesis de GSH. Se realizó RT-PCR cuantitativa para determinar el nivel de expresión del gen de ligasa glutamato-cisteína (GCLM) y glutatión sintetasa (GSS), en las líneas celulares de cáncer de ovario transfectadas Bmi-1 siRNA. El glutamato-cisteína ligasa (GCLM) es la primera enzima limitante de la velocidad de la ruta de biosíntesis de glutatión [35]. En el segundo paso, el glutatión sintetasa (GSS), convierte gamma-L-glutamil-L-cisteína a glutatión [35]. Mientras que la expresión de ARNm de Bmi-1 se redujo como se esperaba en Bmi-1 células silenciadas, de manera interesante la expresión de ARNm de GCLM disminuyó significativamente mientras que la de GSS aumentó (Fig. 3). La tendencia fue similar en ambas líneas celulares de cáncer de ovario. Estos resultados sugieren que la perturbación de GCLM, la enzima limitante de la velocidad es suficiente para reducir los niveles de GSH celulares totales y veces de incremento posterior en los niveles de ARNm de GSS probablemente representan un mecanismo de defensa para las células que intentan aliviar el estrés oxidativo.
Bmi -1 modula la vía DDR
para investigar más a fondo el mecanismo de la apoptosis mediada por ROS por el cisplatino mejora en el IMC-1 en las células de cáncer de ovario silenciadas que queríamos probar la participación de los daños del ADN y la reparación de la vía (DDR). Estudios previos han informado que el estrés oxidativo puede desencadenar la activación de la vía de DDR [36]. Con el fin de probar esta determinamos los niveles de fosforilación de H2AX Chk2 y dos biomarcadores importantes para el daño del ADN y la activación de la vía de DDR [37]. tratamiento cisplatino solo indujo la fosforilación de H2AX Chk2 y de una manera dependiente de la concentración y desmontables de Bmi-1 agrava aún más este efecto (Fig. 4A). En corroboración, la formación de focos nucleares aumento se observó en un 53 BP1 inmunofluorescencia en células CP-70 Bmi-1 desmontables tratados con cisplatino (Fig. 4B). Estos resultados indican que los niveles sostenidos de ROS generados en Bmi-1 desmontables junto con el tratamiento con cisplatino son suficientes para dañar directamente el ADN y comprometer la vía DDR. Una gran cantidad de literatura que apoya el daño del ADN puede conducir a la apoptosis a través de la activación de las caspasas [38], [39]. Por lo tanto, la próxima procedió a determinar la activación de caspasas en células de cáncer de ovario Bmi-1 silenciados tratados con o sin cisplatino.
(A) células de cáncer de ovario transfectadas con siRNA de control revueltos o Bmi-1 se trataron con o sin cisplatino por 48 h. Western blot se realizó para fosfo Chk-2, el total de Chk-2, fosfo-H2AX, H2AX total y actina beta usando anticuerpos respectivos. (B) de control o revueltos Bmi-1 siRNA transfectadas las células CP-70 se sometieron a microscopía confocal utilizando anticuerpos 53BP1 (rojo) y DAPI (azul tinción nuclear) para demostrar la formación de focos nucleares.
del IMC 1 regula efectores de la apoptosis
mediadores de la apoptosis de la empresa incluyen las caspasas [40]. A continuación se determinó la escisión de la caspasa 8 y caspasa 9 en control revueltos o Bmi-1 siRNA células transfectadas tratadas con o sin cisplatino. tratamiento cisplatino solo causó la escisión de la caspasa 8, pero no caspasa 9. Es plausible que con concentraciones más altas de cisplatino de escisión de la caspasa 9 se pudo observar. sin embargo importante, la combinación de Bmi-1 desmontables y cisplatino tratamiento de manera significativa y dependiente de la dosis el aumento de escisión de caspasa 8 y caspasa 9, tanto en las líneas de células (Fig. 5).
células de cáncer de ovario transfectadas con control mezclado o Bmi -1 siRNA se trataron con o sin cisplatino para 48 h. Western blot se realizó para la caspasa-8, caspasa-9 y PARP usando anticuerpos respectivos.
PARP es uno de los principales objetivos de escisión de las caspasas activadas y se escindió PARP facilita el desmontaje celular y sirve como un marcador de las células sometidas a apoptosis [40]. En desmontables células Bmi-1, se observó clara división de PARP en una manera dependiente de la dosis de cisplatino (Fig. 5). Todos estos
in vitro
datos indican que el tratamiento con cisplatino desmontables células de Bmi-1 promueve la apoptosis mediante el aumento de la producción de ROS, haciendo que el compromiso de la vía de activación de las caspasas DDR y. Seguidamente, se procedió a determinar la eficacia terapéutica de silenciar Bmi-1 en un modelo ortotópico quimioresistente ratón de cáncer de ovario.
Desmontables de Bmi-1 aumenta la sensibilidad a cisplatino in vivo
A continuación, el potencial terapéutico de Bmi-1 fue probado por
in vivo
entrega de bmi-1 siRNA utilizando DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina) nanoliposomas en el modelo de ratón ortotópico CP-20. Este método de entrega se ha caracterizado extensivamente previamente para la duración de la caída y se ha demostrado que carecen de las respuestas inflamatorias no específicas [41], [42]. Para simular el tratamiento de la enfermedad de pequeño volumen avanzada, la terapia se inició 1 semana después de la inyección de células tumorales. Los ratones se dividieron en los siguientes cuatro grupos (n = 10 ratones por grupo): (a) el control de siRNA-DOPC (150 mg /kg ip dos veces por semana), (b) el control de siRNA-DOPC + cisplatino (160 mg /IP ratón dosis semanal), (c) Bmi-1 siRNA-DOPC (150 mg /kg ip dos veces por semana), y (d) Bmi-1 siRNA-DOPC + cisplatino (mismos como tratamientos individuales). Todos los animales se sacrificaron después de 4 semanas de terapia. knockdown eficiente de Bmi-1 (~ 85%) se confirmó primero por RT-PCR (Fig. 6A). El tratamiento con Bmi-1 siRNA solo resultó en una reducción significativa (~ 60%) en peso del tumor en comparación con el grupo de control siRNA. La terapia de combinación con Bmi-1 siRNA y cisplatino resultó en una reducción aún mayor (~ 80%) en peso del tumor en comparación con el grupo tratado sólo con cisplatino (Fig. 6B). A fin de evaluar este efecto, el número de nódulos tumorales formados en cada grupo fue determinada. Una vez más la terapia de combinación mostró mayor efecto con ~ 70% menos de nódulos tumorales en comparación con el cisplatino grupo tratado solamente (Fig. 6B). No hay toxicidad, recordado en los animales durante los experimentos de terapia según la evaluación de los cambios en el comportamiento, hábitos de alimentación, y la movilidad. La media del peso corporal también fue similar entre los grupos de tratamiento (datos no mostrados).
Para evaluar los efectos del tratamiento con siRNA en el crecimiento del tumor, el tratamiento se inició después de 1 semana por vía intraperitoneal inyección (1,0 × 10
6 CP20) de las células tumorales. Los ratones se dividieron en cuatro grupos (n = 10 ratones por grupo): (a) controlar siRNA-DOPC (150 mg /kg ip dos veces por semana), (b) controlar siRNA-DOPC + cisplatino (160 mg /ratón ip semanal), (dosis mismos como tratamientos individuales) (c) Bmi-1 siRNA-DOPC (150 mg /kg ip dos veces por semana), y (d) Bmi-1 siRNA-DOPC + cisplatino. El tratamiento se continuó hasta 4 semanas después de la inoculación del tumor antes del sacrificio. (A) ARN total fue aislado de una parte de los tejidos tumorales y se sometió a RT-PCR utilizando cebadores para Bmi-1 y beta actina. El método C
t comparativo se utilizó para calcular la abundancia relativa de ARNm en comparación con el de la expresión de beta actina. El experimento se realizó por triplicado y la significación determinada usando la prueba t de Student de dos caras, P & lt; 0,05 fue considerado significativo. (B) Mouse y los pesos del tumor y (C) el número de nódulos tumorales para cada grupo se compararon mediante la prueba t de Student (para la comparación de dos grupos). Un P £ 0,05 de dos colas se consideró estadísticamente significativo.
efecto del IMC-1 desmontables sobre la proliferación y la apoptosis in vivo
Para corroborar nuestra
in vitro
datos que examinó el efecto de Bmi-1 desmontables en
in vivo
proliferación de células tumorales y la apoptosis mediante el uso de Ki67 y la tinción de TUNEL. La terapia de combinación con Bmi-1 siRNA y cisplatino mostró el mayor efecto con disminución ~ 50% en la proliferación en comparación con el grupo no tratado de control (Fig. 7). Del mismo modo, se observó un aumento de aproximadamente 80% en la apoptosis en el grupo de terapia de combinación en comparación con el grupo tratado de control (Fig. 7). Por lo tanto se demuestra que el silenciamiento de Bmi-1 en células de cáncer de ovario si
in vitro
o
in vivo
aumenta la apoptosis en respuesta a cisplatino.
(A) tinción inmunohistoquímica para Ki67 y TUNEL (B) se llevó a cabo para evaluar la proliferación celular y la apoptosis. 200X ampliación original. La cuantificación se muestra gráficamente a la derecha. grupos de tratamiento se compararon mediante la prueba t de Student y P ≤ 0,05 se consideró estadísticamente significativa.
Discusión
Sin lugar a dudas el cáncer de ovario es una enfermedad incurable molesto para los pacientes con cáncer recurrente y las opciones terapéuticas se limitan [1], [43]. Aquí demostramos Bmi-1 silenciamiento de genes como una opción efectiva, que en combinación con cisplatino mejora la eficacia terapéutica aún más. Por otra parte en que se delimiten el mecanismo de aumento de la sensibilidad a ser principalmente a través de la producción de ROS. la quimioterapia de primera línea para el cáncer de ovario implica el uso del régimen de platino /taxano, que son conocidos por inducir la producción de ROS. Postulamos que desmontables de Bmi-1 resultará eficaz en la terapia de combinación con este régimen. En este contexto, un informe reciente ha demostrado Bmi-1 a ser reclutado temprano al sitio de doble filamento romper a la radiación ionizante daños [44]. Nuestros resultados corroboran y amplían esta idea y demuestran
in vitro
y
in vivo Windows que Bmi-1 silenciamiento sinergia con aumento del estrés oxidativo que conduce a la acumulación de daño en el ADN y la apoptosis.
Al menos dos publicaciones anteriores demostraron un aumento en los niveles de ROS neuronas, timocitos y células de médula ósea aisladas de Bmi-1 nulo ratones [28], [29]. Sin embargo, la causa de esta producción de ROS ha sido diversamente atribuido a la represión dependiente e independiente de p53 de la expresión génica antioxidante o con impedimentos energética mitocondrial [28], [29]. Mostramos aquí que, además de estas vías Bmi-1 controla también los niveles celulares de GSH por regulación de la transcripción de las enzimas implicadas en la ruta de biosíntesis de GSH. Cabe destacar que la transcripción de GCLM está regulada positivamente por factores de transcripción tales como NRF-1 y NFkB. En el contexto de Bmi-1 caída, ambos de estos factores de transcripción son downregulated en las neuronas y las células de glioma, respectivamente [28], [45]. Por lo tanto es posible que Bmi-1 silenciamiento conduce a regulación a la baja de NRF-1 y NFkB o en las células de cáncer de ovario, disminuyendo de ese modo la transcripción de GCLM que resulta en la síntesis de GSH reducida. Es importante destacar que aquí se muestra que Bmi-1 mediante la regulación de los niveles de ROS y GSH protege las células de cáncer de ovario de los insultos quimioterapéuticos.
La vía de respuesta al daño de ADN se puede activar por el estrés genotóxico, tales como las causadas por agentes quimioterapéuticos y daño oxidativo del ADN . De hecho la activación de DDR puede conducir a una pausa en la progresión del ciclo celular, la senescencia o apoptosis. De acuerdo nos encontramos con que la doble insulto del daño oxidativo causado por el IMC-1 desmontables y tratamiento con cisplatino, que se sabe que causa roturas de doble cadena en el ADN junto con ROS puntas de producción del umbral para las células del cáncer de ovario hacia la apoptosis mediante la inducción de la fosforilación de i ) Chk2 y H2AX, ii) provocar la formación de focos nucleares por 53BP1 y la escisión de los marcadores apoptóticos como iii) caspasas y PARP.
como hemos demostrado en nuestros
in vivo
experimentos, desmontables de Bmi-1 podría ser útil en la práctica clínica debido a las siguientes razones; a) regulación a la baja de Bmi-1 potencia la apoptosis inducida por cisplatino en las células de cáncer de ovario. b) Bmi-1 es necesario para la auto-renovación y mantenimiento de las células madre incluidas las células madre del cáncer de ovario que por definición son resistentes a la quimioterapia [23]. c) Bmi-1 regula múltiples vías, más prominente de los cuales es la inducción de la telomerasa que conduce a la inmortalización de las células epiteliales mamarias [46]. d) La regulación por disminución del IMC-1 conduce a la remoción de la represión de INK4a, que codifica los supresores de tumores y p16Ink p19ARF que regulan la senescencia y la apoptosis [47]. La activación de estas vías han sido invocada como una importante barrera supresor de tumor, ya que estas vías actúan como potentes inhibidores de la proliferación o la propagación de las células dañadas. e) Además postulamos que el cisplatino y el IMC-1 actúan en vías similares que afectan a la función mitocondrial y /o mediante el aumento de daño en el ADN ROS generación causas que conducen a la inducción de la apoptosis eficiente. Los niveles elevados de daño en el ADN y luego aumentan la señal de inicio de la apoptosis. Por lo tanto, el IMC-1 es una nueva diana importante para la terapia no sólo en el cáncer de ovario quimioresistente sino también para otros tumores malignos caracterizados por la sobreexpresión de Bmi-1.
Materiales y Métodos
Reactivos
Bmi-1 anticuerpo fue de Zymed, CA, EE.UU.. siRNA Bmi-1 y revueltos de control fueron de Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Fosfo-H2AX, fosfo-Chk-2, 53 BP1 caspasa-8, caspasa-9 y PARP anticuerpos fueron escindidos de Señalización Celular Technologies Inc., MA. Anexina /kit de la apoptosis FITC-PI era de Biovision Inc.
Cell Cultura y
A-2780 y CP-70 células fueron cultivadas en RPMI con 10% de SFB y el 1% de antibiótico (penicilina /estreptomicina ) de acuerdo con la recomendación del proveedor. Las líneas de células CP-20 se cultivaron de acuerdo con nuestros procedimientos publicados previamente [48].
siRNA transfección
La células de ovario A2780 o CP-70 se cultivaron en medio de su respectiva para un día antes de la transfección. Usando oligofectamine las células fueron transfectadas con 25 nM revueltos control o Bmi-1 siRNA. Después de 48 h las células fueron procesadas para la mancha o la apoptosis ensayos occidentales [49].
Western Blot
células de cáncer de ovario cosechados, tratados y no tratados, se lavaron en PBS y se lisaron en tampón (RIPA) radioinmunoprecipitación enfriado con hielo con recién añadido cóctel de 0,01% de inhibidor de proteasa (Sigma) y se incubaron en hielo durante 30 min. Los restos celulares se descartó por centrifugación a 13.000 rpm durante 10 min a 4 ° C y el sobrenadante (30 a 50 g de proteína) se ha ejecutado en un SDS-Page [49].
ensayo ROS
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