Extracto
macrófagos factor estimulante de colonias (MCSF) regula el crecimiento, la proliferación y diferenciación de células hematopoyéticas linajes. Muchos cánceres son conocidos para secretar alto nivel de MCSF, que reclutan macrófagos en el microambiente tumoral, apoyando el crecimiento del tumor. Aquí, se presenta la clonación de MCSF y la posterior generación de U87MG expresando línea celular estable MCSF (U87-MCSF). La citotoxicidad de anti-cáncer de fármaco 5-fluorouracilo (5-FU) se evaluó en ambas células U87MG y U87-MCSF. Curiosamente, la proliferación de células U87-MCSF fue menor (p & lt; 0,001) que el de las células U87MG solamente, después del tratamiento con 5-FU. disminución significativa en los niveles de expresión de ciclina E y A2 cuantificados por análisis de PCR en tiempo real corroboró reducida la proliferación de 5-FU tratada células U87-MCSF. Sin embargo, JC-1 tinción no reveló ninguna apoptosis tras el tratamiento 5-FU. Notch-1 regulación positiva inducida por una posible transición epitelio-mesenquimal de las células U87-MCSF, lo que representó un aumento de la proporción de CD24
CD44
menos pilas de gran /madre del cáncer en células U87-MCSF después de 5-FU tratamiento . La elevada resistencia de las células U87-MCSF hacia 5-FU fue debido al aumento en las expresiones (10.2 y 6 veces) de ABCB1 y MDM2, respectivamente. Además, el aumento de expresiones de ABCG1, mdm2 y CD24 también se observó en las células U87MG después de prolongados de incubación con 5-FU. Nuestros estudios proporcionan conocimientos sobre mecánica en la resistencia a fármacos de las células U87MG y también describieron el papel fundamental desempeñado por MCSF en el aumento de la resistencia de las células U87MG a 5-FU
Visto:. Chockalingam S, SS Ghosh (2013) La mejora de las Las células madre del cáncer en los macrófagos factor estimulante de colonias que expresan U87MG-humana glioblastoma sobre Terapia de 5-fluorouracilo. PLoS ONE 8 (12): e83877. doi: 10.1371 /journal.pone.0083877
Editor: Rajesh Agarwal, de la Universidad de Colorado en Denver, Estados Unidos de América
Recibido: 19 de septiembre de 2013; Aceptado: 8 de noviembre de 2013; Publicado: Diciembre 31, 2013
Derechos de Autor © 2013 Chockalingam, Ghosh. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Financiación proporcionada por el Departamento de Biotecnología Nº TC /49 /NE /TBP /2010 y TC /01 /NE /PS /08. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
macrófago factor estimulante de colonias (MCSF), también conocida como factor estimulante de colonias-1 (CSF-1), es un factor de crecimiento responsables de la supervivencia, proliferación y diferenciación de células de linajes hematopoyéticos [1]. Fuera del sistema hematopoyético, MCSF tiene un papel importante en el desarrollo y regulación de la placenta, glándula mamaria, cerebro y la fisiología ósea [2] - [4]. MCSF está codificada por un gen único, sin embargo, a través de corte y empalme alternativo del ARNm y diferenciado modificación post-traduccional, tres diferentes formas de MCSF, tales como, una glicoproteína secretada, un proteoglicano secretado y una isoforma unida a la membrana a corto se encuentran [1]. MCSF actúa a través de un tipo III tirosina quinasa receptor, factor estimulante de colonias 1 receptor (CSF1R), que es el producto de c-fms proto-oncogén.
MCSF se conoce para infiltrarse en los sitios de lesión y la inflamación con fagocitos mononucleares . mutación en homocigosis nula de CSF-1 en ratones demuestra una población de macrófagos empobrecido en el cáncer de mama, lo que resulta en la reducción de la malignidad y metástasis [5]. La presencia de monocitos y macrófagos promueve la angiogénesis y la metástasis en el tumor, aumentando el nivel de la secreción del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). MCSF actúa como un regulador transcripcional para la producción de VEGF [6]. Sin embargo, MCSF tiene un papel potencial en la provocación de la respuesta anti-tumor. Los monocitos y los macrófagos se han reportado para matar las células cancerosas por paraptosis, con la sobreexpresión de la forma de membrana de MCSF [7], [8]. La adición de MCSF purificada a las células de cáncer de ovario humano se ha documentado para inducir la inhibición del crecimiento dependiente de la concentración in vitro [9]. Por lo tanto, este tipo de informes que demuestran las actividades antitumorales de MCSF corren a mano a mano con los informes alternativos que muestran las propiedades pro-tumorales de MCSF.
En este estudio, hemos dilucidado el papel desempeñado por MCSF en el aumento de la propiedades de resistencia al fármaco de la línea celular de glioblastoma humano, U87MG. También encontramos que el mecanismo de resistencia a 5-FU en células U87MG. Nuestros resultados ilustran que la expresión de Notch-1 fue mayor en las células U87-MCSF no tratados, que indujeron a la transición epitelio-mesenquimal. Un incremento en CD24
CD44
células cancerosas altas /bajas madre y la regulación positiva de genes clave de ABC transportador (ABCG1 y ABCB1) imparten resistencia a 5-FU en células U87-MCSF. Nuestros datos proporciona evidencia para el fenotipo resistente a fármacos emergentes a través de la formación de las células madre del cáncer en MCSF expresar glioblastoma.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
ACHN, carcinoma renal humana y U87MG, las líneas celulares de glioblastoma humano obtenidos de Centro Nacional para la Ciencia de la célula, Pune se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal, penicilina (50 U /ml) -Streptomycin (50 mg /ml) a 5% de CO
2 en un incubador humidificado a 37 ° C.
el aislamiento de ARN y RT-PCR
ARN a partir de células de mamífero en cultivo se aisló mediante el uso de GenElute kit de aislamiento de ARN total de mamíferos ( sigma) según las instrucciones del fabricante. El ARN total (1 g) fue transcrito inversa utilizando el kit de síntesis de ADNc (Fermentas). La amplificación de la expresión génica se realizó con cebadores específicos de genes respectivos (Tabla S1 S1 en Archivo).
Western Blot
Las células cultivadas a 70-80% de confluencia fueron lisadas por tampón RIPA que contenía PMSF 1 mM . El contenido total de proteína en los lisados de células se cuantificó por el método de estimación de la proteína utilizando BSA como estándar de Lowry. SDS-PAGE se llevó a cabo la carga de la misma cantidad de proteína en cada pocillo. Las muestras se transfirieron a membrana de PVDF y se detectaron utilizando anticuerpos para β-actina (BD Transduction Laboratories) y MCSF (Sigma). Las transferencias fueron desarrolladas utilizando peroxidasa quimioluminiscente sustrato-1 kit (Sigma) y la imagen utilizando el sistema de documentación de geles (ChemiDoc XRS + sistema de imagen de imágenes moleculares, Bio-Rad).
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular se medido utilizando el kit de ensayo En Vitro Toxicología, XTT basa (Sigma). Las células sembradas en 96 microplacas pocillos a una densidad de 1,5 × 10
se permitió 3 células por pocillo para crecer tratado durante la noche y luego con diversas concentraciones de 5-FU para diferentes intervalos de tiempo. XTT (2, 3-bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] 2H-tetrazolio-5-carboxianilida sal interna) ensayo se realizó al final del período de tratamiento usando el protocolo del fabricante. El producto de formazán naranja soluble se midió utilizando un lector de multiplaca (Tecan, Infinito M200) a 450 nm y la medición de fondo a 690 nm. La viabilidad celular (%) se calculó con relación a las células viables sin tratar 100%.
MCSF Localisation estudio
resumen, las células se lavaron con PBS y se fijaron con solución de paraformaldehído al 3,7% (con o sin 0,1% Triton X-100) a 37 ° C durante 30 min. Después de lavar con PBS tres veces, las células se bloquearon con solución de bloqueo BSA 1% durante 30 min. Luego, las células se incubaron con anti-MCSF (Sigma) anticuerpo primario y posteriormente con FITC etiquetados anticuerpo secundario (BD Transduction Laboratories). Después de la tinción con FITC marcado anticuerpo secundario, las células se incubaron con medio que contenía 300 nM DAPI durante 3 min, finalmente se lavaron y se visualizaron bajo microscopio de fluorescencia (Nikon Eclipse T
i
-U, Japón) con un filtro de excitación de 480 /15 nm (FITC) y 360/20 nm (por DAPI).
El azul tripán colorante de exclusión ensayo
Las células de cada seis placa de pocillos fueron tratados con 5-FU durante 120 h. Después del tratamiento, se recogieron las células, se mezcló con un volumen igual de 0,4% de azul de tripano (Invitrogen) y se cargaron sobre una cámara de recuento. Las células sanas y viables con membrana intacta excluyen el colorante, mientras que las células comprometidas teñidos con el colorante y se contabilizaron como muertos. El porcentaje (%) de la viabilidad celular se calculó mediante el uso de contador de células automatizado condesa (Invitrogen).
CFSE la proliferación de células de ensayo
Las células (1 × 10
6 células /ml) en PBS que contenía 0,1% de BSA se incubaron con 10 l de 0,5 mM CFDA-sE a 37 ° C durante 10 min y después se lavó con 5 volúmenes de medios de comunicación en frío de hielo para apagar cualquier colorante libre. Las células se recogieron por centrifugación y se lavaron dos veces con medio fresco. Se analizaron las células teñidas inmediatamente por citómetro de flujo (punto de tiempo cero) y el resto de las células se sembraron por períodos de tiempo posteriores. Los datos obtenidos se analizaron en Cell Quest Software Pro. El tiempo de duplicación se calculó según la fórmula T
d = T /log
2 (F
0 /F
T), donde F
0 es la intensidad de fluorescencia media geométrica a 0 h y F
T es la intensidad de fluorescencia media geométrica en T h [10]. En nuestros experimentos T fue de 72 h.
Análisis del ciclo celular
Las células se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 5 × 10
4 células por pocillo. Después de la unión durante la noche, las células se trataron con diferentes concentraciones de 5-FU. Al final de las células período de tratamiento se tripsinizaron, se lavaron y se fijaron con solución de alcohol al 70% durante 15 min en hielo. Las células fijadas se tiñeron con solución de yoduro de propidio (PI) tinción (50 mg /ml PI, 0.1 mg /ml de RNasa A y 0,05% de Triton X-100) a 37 ° C durante 30 min en la oscuridad. Al menos 10000 eventos por muestra fueron adquiridas por citómetro de flujo y el porcentaje de células distribuidas en diferentes fases del ciclo celular se calculó usando el software ModFit LT.
análisis CD24 /CD44 por citometría de flujo
Células después del tratamiento se disociaron por tripsinización, se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con suero humano al 10% durante 20 min en hielo para bloquear los receptores Fc. FITC de ratón anti-CD24 humano y PE CD44 antihumano de ratón (ambos de BD Pharmingen) se añadieron anticuerpos y se incubaron durante 20 min en hielo en la oscuridad. Las células se lavaron dos veces con PBS, finalmente se resuspendieron en PBS y se analizaron mediante un citómetro de flujo (FacsCalibur, BD Biosciences, NJ).
Análisis
expresión génica mediante PCR en tiempo real
tiempo real PCR cuantitativa se llevó a cabo utilizando SYBR Green como colorante indicador (Power SYBR Green PCR master mix, Applied Biosystems) y 7500 sistema de PCR en tiempo real (Applied Biosystems). Se analizaron los datos en bruto y la eficiencia de cada reacción fue calculado por el software LinRegPCR. β-actina se utilizó como control endógeno y el cambio de veces en la expresión de genes se calculó por el método de ΔΔCt.
azul de metileno tinción
Las células tratadas con diversas concentraciones de 5-FU para el tiempo diferentes intervalos, se lavaron con PBS enfriado en hielo, se fijaron con etanol al 50% enfriado con hielo. 0,2% (W /V) de solución de azul de metileno tinción se añadió a la placa y la tinción se llevó a cabo durante 30 segundos. La solución se aspiró y las células se lavaron tres veces con agua enfriada con hielo. Las muestras se secaron al aire y se visualizaron con un microscopio óptico.
citoesqueleto de actina tinción
Las células sembradas en placas de seis pocillos fueron tratados con 5-FU. Al final del período de tratamiento, las células se lavaron con PBS y se fijaron con solución de paraformaldehído al 3,7% que contiene 0,1% de Triton X-100 a 37 ° C durante 30 min. Después de lavar con PBS tres veces, las células se bloquearon con solución de bloqueo BSA 1% durante 30 min. Luego, las células fueron incubadas con anticuerpos anti anticuerpo primario β-actina (BD Transduction Laboratories) y posteriormente con FITC etiquetados anticuerpo secundario (BD Transduction Laboratories). Después de la tinción con FITC marcado anticuerpo secundario, las células se lavaron tres veces y se incubaron con medio que contenía 300 nM para DAPI 3 min. Las células se lavan a fondo, finalmente se volvió a suspender en PBS y se visualizaron bajo microscopio de fluorescencia (Nikon Eclipse T
i
-U, Japón) con un filtro de excitación de 480/15 nm (FITC) y 360/20 nm (por DAPI).
El análisis estadístico
Los valores para todos los experimentos se expresaron como media ± SEM de tres o más experimentos individuales. Los datos se analizaron mediante la prueba t de Student o ANOVA por el que sea aplicable, utilizando GraphPad Prism 5.01. Estadísticamente valores significativos se indican mediante * (p & lt; 0,05), ** (p & lt; 0,01) y *** (p & lt; 0,001).
Resultados
Generación de células U87-MCSF y sensibilidad hacia 5-FU
la figura 1A representa la estrategia para la generación de U87-MCSF línea celular estable. El 0.771 kb PCR gen amplificado correspondiente a membrana isoforma unida de MCSF se clonó en vectores secuencialmente pGEMT fáciles y pEGFP-N1. Los clones se comprobaron por análisis de restricción en la Figura 1B (carril 2 y 4). Una línea celular estable (U87-MCSF), que sobreexpresan MCSF se estableció mediante la transfección de células U87MG con pEGFP-N1-MCSF. Una población mixta de clones de U87-MCSF fue seleccionado con G418 (400 mg /ml) para excluir el papel potencial de cualquier otro proceso compensatorio que surja de la transfección en una sola población clonal. La expresión de MCSF transgén fue confirmada por semi-cuantitativos de RT-PCR (Figura 1C). La sobreexpresión de la proteína MCSF se confirmó mediante transferencia de Western usando anticuerpo anti-MCSF por que, un aumento de 1,8 veces en la expresión MCSF se observó en las células U87-MCSF (Figura 1D). Una disminución en la expresión del receptor MCSF, CSF1R se observó en las células U87-MCSF (0,16 expresión veces en las células U87-MCSF en comparación con las células U87MG) (Figura 1C).
A. Esquema para la generación de la línea celular U87-MCSF. B. Confirmación de clones por digestión de restricción Lanes 1 y 3: escalera de ADN 1 kb, carril 2: pGEMT-MCSF digerido con EcoR I, carril 4: pEGFP-N1-MCSF digerido con EcoR I y Apa IC RT-PCR análisis para la expresión de MCSF y CSF1R en U87MG y células U87-MCSF. El análisis de transferencia Western de la proteína D. MCSF. A 28 kD banda confirmó la sobreexpresión de membrana MCSF ligada en células U87-MCSF.
sensibilidad de las células U87-MCSF se comprobó mediante el ensayo de XTT después del tratamiento con diversas concentraciones de 5-FU que van a partir de 5- 100 mM, durante 72 h. La proliferación de las células U87-MCSF se redujo significativamente con 5-FU de por encima de 10 mM como se desprende de los valores de absorbancia reducidas (Figura 2A). La reducción de crecimiento similar no se observó en la línea celular U87-GFP con tratamiento con 5-FU, en donde la proliferación era casi similar a la de las células U87MG tratados. Además, hay indicios de la apoptosis se observó en las células U87MG tratada o U87-MCSF tratados después de JC-1 tinción (Figura S1 en el archivo S1). Los resultados se corroboraron con tripano cuantitativa ensayo de exclusión con azul que mostró poblaciones de células sanas con membrana celular intacta después de 120 h de tratamiento (Figura 2B). Se investigó la expresión de algunos de los genes pro-apoptóticos y anti-apoptóticas como la caspasa-3, Bax y Bcl-xL. Como se muestra en la Figura S2 en File S1, la expresión de genes pro-apoptóticos, Bax se aumentó en las muestras tratadas tanto de U87MG (1,90 veces) y las células U87-MCSF (1,29 veces). La expresión de genes anti-apoptóticos, Bcl-xL también se incrementó en U87MG células tratadas y U87-MCSF tratados. Sin embargo, el aumento de la expresión de Bcl-xL fue 2,11 veces en las células U87-MCSF tratados en comparación con el aumento de 1,25 veces en las células U87MG tratados. Caspasa-3 de expresión se mantuvo sin cambios en las muestras tratadas de U87MG y U87-MCSF.
A. Efecto de 5-FU en el crecimiento y la viabilidad de U87MG, U87-MCSF y las células U87-GFP calculados por el ensayo de XTT después de 72 h de tratamiento con 5-FU. ensayo de exclusión del colorante azul de tripano mostró B. poblaciones sanas después de 120 h de tratamiento con 5-FU. La significación estadística se indica por * (p & lt; 0,05), ** (p & lt; 0,01) y *** (p & lt; 0,001).
Efecto de 5-FU en el ciclo celular y las ciclinas
El ciclo celular tras el tratamiento con 5-FU se estudió mediante tinción con yoduro de propidio usando un citómetro de flujo. Inicialmente, ambas células U87MG y U87-MCSF fueron sincronizados en la fase G0 /G1 por privación de suero durante 48 h y luego se observó el patrón del ciclo celular en medio completo que contenía suero a intervalos de tiempo regulares. La tasa de progresión de ciclo celular entre dos líneas celulares era mismo (Figura S3 en File S1). Esto también fue confirmado por el ensayo de proliferación de células CFSE (Figura 3A) mediante la cual se encontró que el tiempo de duplicación de las dos líneas celulares a ser 12 h.
A. ensayo de proliferación de células CFSE mostró que la tasa de proliferación de las células U87MG y U87-MCSF sin tratar se mantuvo inalterada. Análisis del ciclo celular B. de U87MG y células U87-MCSF después del tratamiento con 5-FU durante 24 h. La mayoría de las células se acumularon en la fase G0 /G1 en la población tratada de células U87-MCSF. La significación estadística se indica por * (p & lt; 0,05), ** (p & lt; 0,01) y *** (p & lt; 0,001).
A continuación, las células pre-sincronizados se trataron con 25 mM 5 -FU en medio que contenía suero durante 24 h. El patrón de distribución del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo mostró porcentaje significativamente mayor (90%) de células U87-MCSF tratados en la fase G0 /G1 a la de U87MG tratado (69%) de las células (Figura 3B). Esto fue acompañado por una disminución correspondiente en la proporción de células en S y G2 /M fases. Comparativamente, 75% de las células U87-GFP se acumula en la fase G0 /G1 tras el tratamiento 5-FU (datos no mostrados).
Las ciclinas implicados en la transición de fase G1 y G1-S se examinaron por PCR cuantitativa en tiempo real análisis después de tratar células sincronizadas (en la fase G0 /G1) con 5-FU durante 18 h. Del mismo modo, las ciclinas que participan en fase tardía S y G2 /M fase se cuantificaron después de 24 h de tratamiento con 5-FU. la expresión de ciclina D1 se mantuvo inalterada entre U87MG células tratadas y U87-MCSF tratados. Después de 18 h de tratamiento con 5-FU, la expresión de ciclina E se redujo significativamente en las células U87-MCSF tratadas pero no en células U87MG tratados (Figura 4). Sin embargo, después de 24 h de tratamiento con 5-FU, en la regulación de la expresión de la ciclina E se observó en las muestras tratadas tanto de células U87-MCSF (Figura S4 en S1 Archivo) y U87MG. Esto indica que la respuesta de las células U87-MCSF al tratamiento 5-FU fue más rápido que las células U87MG. Una ligera disminución en la expresión de la ciclina A2 también se observó en 5-FU tratada células U87-MCSF en comparación con 5-FU tratada células U87MG después de 24 h de tratamiento con 5-FU. Las expresiones de ciclina B2 B1 y ciclina eran menos en ambas muestras tratadas, en correlación con el menor número de células progresaron a la fase G2 /M. La expresión de p21, un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina, se aumentó en las muestras tratadas de ambas células U87MG y U87-MCSF. Por lo tanto, la expresión diferencial de las ciclinas y el inhibidor de CDK, p21 en diversas fases de ciclo celular corroborados con el retraso del crecimiento celular en 5-FU tratada células U87-MCSF.
Una disminución significativa en la expresión de la ciclina E y se observó una ligera disminución en la expresión de la ciclina A2 en las células U87-MCSF tratados, que se correlacionaban con la elevada acumulación de G0 /G1 de las células observadas en el análisis del ciclo celular. La expresión de p21, el inhibidor de quinasa dependiente de ciclina se aumentó en las muestras tratadas de ambas células U87MG y U87-MCSF. La significación estadística se denota por * (p & lt; 0,05), ** (p & lt; 0,01) y *** (p & lt; 0,001).
epitelio-mesenquimal transición (EMT) de las células U87-MCSF
Aparte de retraso en el crecimiento celular, los cambios morfológicos fueron visibles en azul de metileno células U87-MCSF manchadas tratados con dosis bajas incluso de 5-FU. Apariencia de la morfología en forma alargada, de husillo con procesos largos se observó en las células U87-MCSF con 25 tratamiento mu M 5-FU durante 72 h, pero no en las células U87MG (Figura 5A). Sin embargo, la morfología alargada se observó tanto en las células con 50 tratamiento mu M 5-FU. Además, la tinción del citoesqueleto de las muestras sin tratar y tratadas de U87MG y células U87-MCSF se realizó usando anticuerpo anti β-actina (Figura 5B). Los resultados obtenidos refuerzan los cambios morfológicos observados en la tinción de azul de metileno. No se observaron células alargadas y mesenquimales en 25 mM de 5-FU trataron células U87-MCSF pero no en 25 mM de 5-FU trataron células U87MG después del tratamiento 72 h. Pero, se observaron células alargadas en ambas células U87MG y U87-MCSF cuando se tratan con 50 mM 5-FU para 72 h. Además, el examen microscópico de DAPI células teñidas con 25 y 50 mM de 5-FU tratamiento después de 120 h mostraron núcleos intactos, y la calceinAM células teñidas en las mismas condiciones, confiere forma de huso morfologías alargadas (Figura S5 en S1 File), que fue similar a la observación en la tinción de azul de metileno. La expresión del marcador de diferenciación de los astrocitos, proteína ácida fibrilar glial (GFAP) estaba ausente y la expresión de hTERT se redujo significativamente en ambas células U87MG y U87-MCSF después del tratamiento 5-FU, lo que justifica la supresión de la proliferación celular (Figura 6C).
A. Tinción con azul de metileno para la detección de la morfología celular después de tratamiento con 5-FU. B. La actina tinción del citoesqueleto de las células tratadas utilizando anticuerpo anti β-actina. Las imágenes morfológicas mostraron la presencia de células alargadas y mesenquimales en células U87-MCSF tratados con 25 mM 5-FU, pero no en las células U87MG tratados con 25 mM 5-FU. Tras 50 tratamiento mu M 5-FU, se observaron células alargadas en tanto U87MG tratados y tratados células U87-MCSF. Barra de escala:. 50 micras
A. Morfología de las células U87MG y U87-MCSF no tratados. Las células U87-MCSF mostraron en forma de huso, células mesenquimales como (indicado por las flechas). B. Estudios microscópicos utilizando anticuerpo anti-MCSF revelaron la ubicación citoplásmica de MCSF. Triton X-100 se utiliza como membrana de agente de perforación en solución de fijación. Núcleo teñido con DAPI se muestra también. C. Semi cuantitativa análisis RT-PCR de hTERT, GFAP, N-cadherina, vimentina, fibronectina y Notch-1. La expresión de marcadores de células mesenquimales, N-cadherina, vimentina y Notch-1 aumenta en las células U87-MCSF. Barra de escala: 50 micras
La presencia de forma más mesenquimales células que aparecen en las células U87-MCSF no tratados (Figura 6A) husillo indica la posible aparición de la transición epitelio-mesenquimal.. La expresión de marcadores de células epiteliales E-cadherina y mesenquimales marcadores de células vimentina, N-cadherina, fibronectina se analizó por semi-cuantitativos RT-PCR. la expresión de E-cadherina no se observó en las células no tratadas y tratadas de ambas células U87MG y U87-MCSF (datos no mostrados). Sin embargo, hubo un aumento sustancial en la expresión de marcadores de células mesenquimales vimentina (~ 2 veces en ambas muestras tratadas y no tratadas) y N-cadherina (1,98 y 3,32 pliegues en las muestras no tratadas y tratadas, respectivamente) en las células U87-MCSF (Figura 6C). El nivel de expresión de la fibronectina no fue modificado en ambos tipos de células tratadas. Por otra parte la expresión de Notch-1, el inductor de la transición epitelial-mesenquimal (EMT), se encontró que se upregulated significativamente (2,14 veces) en células U87-MCSF. El examen microscópico de las células U87-MCSF, después de la fijación con solución de paraformaldehído al 3,7% que contenía Triton X-100, reveló la localización citoplasmática de MCSF (Figura 6B). Sin embargo, en ausencia de Triton X-100 en la solución de fijación no se observó fluorescencia (datos no mostrados) indica la ausencia de MCSF en la membrana celular.
aparición del cáncer vástago población celular y la regulación positiva de los transportadores ABC
la proliferación reducida, el cambio en la morfología celular y las indicaciones de la presencia de EMT sugirió la posible inducción de células madre de cáncer en las células U87-MCSF tras el tratamiento con 5-FU. Se analizó la expresión de marcadores de células madre del cáncer, CD24 y CD44 por citometría de flujo y la PCR en tiempo real. Citometría de flujo El análisis mostró que la expresión de CD24 se incrementó en 6,93% y 33,37% en las células U87MG y células U87-MCSF respectivamente, cuando se tratan con 25 mM 5-FU (Figura 7A). No hay un aumento en la expresión de CD44 se observó en las muestras tratadas de ambas células U87MG y U87-MCSF. Análisis de la expresión cuantitativa por PCR en tiempo real también reveló el aumento de la expresión de CD24 en alrededor de 4 veces en las células U87-MCSF tratados, mientras que sólo 2 veces de incremento en la expresión de CD24 se observó en las células U87MG tratados. la expresión de CD44 se mantuvo sin cambios en las células tratadas tanto U87MG y U87-MCSF (Figura 7B).
A. Citometría de flujo El análisis de la expresión de CD24 y CD44 en las células tratadas. B. Análisis en tiempo real PCR de la expresión de CD44, CD24, ABCB1, MDM2, ABCG1 y ABCG2. Los datos se representan como la relación de la expresión génica en la muestra tratada con la muestra sin tratar para las células respectivas. La significación estadística se indica por * (p & lt; 0,05), ** (p & lt; 0,01) y *** (p & lt; 0,001).
Los genes transportadores ABC se han asociado con la expulsión de los medicamentos en muchos tipos de cánceres. Se analizó la expresión de ABCG1, ABCG2 y ABCB1 por PCR cuantitativa en tiempo real. La figura 6B muestra que la expresión de ABCB1 ABCG1 y se incrementó tanto en U87MG tratado y tratado células U87-MCSF. Sin embargo, la expresión de ABCB1 se aumentó en 10,2 veces en las células U87-MCSF tratados en comparación con el aumento de 2 veces en las células U87MG tratados. Del mismo modo, la expresión de oncogén MDM2 también se incrementó en 6 veces en las células U87-MCSF tratados en comparación con el 3,3 veces mayor que se encuentra en las células U87MG tratados. También se examinó el nivel de expresión de RALBP1gene, un transportador ABC no asociado con MDR (resistencia a múltiples fármacos). Hemos encontrado un aumento marginal en la expresión de RALBP1 en células U87-MCSF no tratados (1,29 veces) en comparación con las células U87MG no tratados (Figura S6 en File S1). Sin embargo, tras el tratamiento con 5-FU, ninguna regulación al alza en RALBP1 se observó en las muestras tratadas con respecto a su correspondiente muestras no tratadas.
Discusión
El glioblastoma sigue siendo uno de los tumores malignos más frecuentes con mala terapéutico la respuesta [11]. La expresión de varias proteínas resistentes a múltiples fármacos ha contribuido principalmente a la capacidad de las células de glioma de desarrollar fenotipo quimioresistente [12], [13]. En el presente estudio, las células de glioblastoma U87MG expresando MCSF exhibieron reducción del crecimiento y retraso significativo en la proliferación celular, sin someterse a la apoptosis después de la administración de 5-FU. Un equilibrio en la expresión de genes pro y anti-apoptóticos determinar el destino de las células para entrar en la vía apoptótica [14]. Análisis de la expresión de genes pro y anti-apoptóticas reveló que la regulación positiva de la expresión de genes pro-apoptóticos, Bax es contraproducente equilibrada por la regulación al alza en la expresión de anti-apoptótica Bcl-xL en tanto U87MG tratada y tratada células U87-MCSF . Sin embargo, las células U87-MCSF tratados tenían menor expresión del gen de pro-apoptótica Bax y mayor expresión de anti-apoptótica Bcl-xL en comparación con células U87MG tratados. Nuestros resultados mostraron que aunque las muestras tratadas de ambas células U87MG y U87-MCSF no fueron sometidos a apoptosis, 5-FU tratada células U87-MCSF tenían más resistencia a la apoptosis de 5-FU tratada células U87MG.
Hemos observado que MCSF se encuentra en el citoplasma y no en la membrana celular. Por otra parte, la expresión del receptor para MCSF, CSF1R estaba regulada en células U87-MCSF, que estaba de acuerdo con el informe anterior [15] sobre la regulación a la baja de ARNm de CSF1R por MCSF en macrófagos primarios. CSF1R fue pensado para funcionar en la membrana plasmática, pero la evidencia reciente mostró la presencia de receptor funcional para MCSF en la envoltura nuclear de diversas células de cáncer y macrófagos [16]. Esto plantea la posibilidad de que los efectos observados de MCSF en células U87-MCSF por tratamiento 5-FU podría ser mediada a través del receptor situado en la envoltura nuclear.
EMT es un proceso celular transdiferenciación conservada que confiere las características de mesenquimales las células más de las células epiteliales basales, lo que aumenta sus propiedades invasivas y la metástasis [17], [18]. expresión MCSF en células U87MG como resultado la aparición de forma de huso, las células de tipo más mesenquimales que indica la ocurrencia de EMT. Una regulación por incremento correspondiente en la expresión de marcadores mesenquimales como N-cadherina y vimentina (1,98 y 2,18 veces, respectivamente) también se observó en células U87-MCSF. la expresión de E-cadherina se encontró que era ausente en todas las muestras analizadas (datos no mostrados) que se correlaciona con el anteriormente presentado datos que muestran la falta de expresión de E-cadherina en glioblastoma [19]. Por otra parte, se observó un aumento en la expresión de Notch-1 en las células U87-MCSF. Upregulation de Notch-1 está implicada en la inducción epitelial-mesenquimal transición (EMT), que se ha informado anteriormente para aumentar las propiedades invasivas de las células de cáncer de páncreas [20].
Con 5-FU tratamiento, la expresión de el marcador mesenquimal, N-cadherina se incrementó aún más en las células U87-MCSF tratados por 3,32 veces, mientras que la expresión de vimentina se mantuvo sin cambios. En las células U87MG tratados, se observó sólo un aumento marginal en la expresión de N-cadherina y vimentina (1,26 y 1,41 veces, respectivamente). propiedades mesenquimales inducidas 5-FU de tratamiento en ambas células U87MG y U87-MCSF como se ve en la Figura 5 y la Figura 6. Sin embargo, la concentración de 5-FU requerida para inducir estos cambios variaron entre U87MG y células U87-MCSF. Mientras que se observaron células mesenquimales alargados y en forma de huso en tratados U87-MCSF cuando se tratan con 25 mM 5-FU durante 72 h, la morfología mesenquimales se puede ver en las células U87MG tratados solamente cuando son tratados con 50 mM 5-FU para 72 h. Pero cuando el tratamiento con 25 mM de 5-FU se prolongó durante 120 horas, se observaron células de tipo mesenquimal alargadas en las muestras tratadas de ambas células U87MG y U87-MCSF (Figura S5 en S1 Archivo).
Informes recientes establecieron que EMT podría desencadenar la adquisición de propiedades madre-como en las células tumorales [21]. Una población sub de células dentro de varios tumores exhiben propiedades de células madre de cáncer (CSC) con velocidad extremadamente lenta de la proliferación, aumento de la expresión de genes de resistencia a múltiples fármacos y se considera que es la razón principal de la recaída del tumor después del tratamiento [22], [ ,,,0],23]. Retraso en la proliferación, la aparición de EMT y la resistencia al tratamiento farmacológico sugirió la presencia de células madre cancerosas o sus precursores en las poblaciones de células tratadas. El análisis de marcadores de superficie-stemness asociado, CD24 y CD44 en las células tratadas por citometría de flujo representa un aumento de CD24
alta /CD44
baja población de células en ambos tratados y U87MG células U87-MCSF tratados. Sin embargo, las células U87-MCSF tratados mostraron mayor porcentaje (33,37%) de CD24
alta /CD44
células bajas en comparación con 6,93% en las células U87MG tratados. Además, el análisis de expresión cuantitativa por PCR en tiempo real reveló que la expresión de CD44 fue uniforme en 5-FU muestras tratadas de ambas células, pero la expresión de CD24 era considerablemente mayor en las células U87-MCSF tratados. Los informes previos demostraron que células madre cancerosas aisladas de cáncer de mama fueron predominantemente CD44
/CD24
células baja alta [21]. En contraste con esto, las células de cáncer de mama con CD44
baja /CD24
alta fenotipo también se informó de que un mal pronóstico con el tratamiento [24]. Figura S1. Figura S2. Figura S3. Figura S4. Figura S5. Barra de escala: 50 micras. Figura S6.