Extracto
desarrollo de la glándula mamaria y el crecimiento del cáncer de mama requieren múltiples factores, tanto de origen endocrino y paracrino. Se analizaron las funciones de factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR) y de crecimiento de hepatocitos receptor del factor de (Met) en células epiteliales mamarias y células tumorales mamarias derivados de una ratones transgénicos mutadas-ErbB2. Mediante el uso de inhibidores altamente específicos de la tirosina quinasa, se encontró que las líneas celulares epiteliales mamarias MCF-10A y NMuMG son totalmente dependientes de la activación de EGFR para su crecimiento y supervivencia. Los ensayos de proliferación y 3D-morfogénesis mostró que el HGF no tenía ningún papel en el mantenimiento de la viabilidad celular mamaria, pero era la única citoquina capaz de rescatar a las células mamarias EGFR-inhibido. Similar a la Insulina factor de crecimiento I (IGF-I), básico-factor de crecimiento fibroblástico (b-FGF) y neurregulina, que son bien conocidos factores morfogénicas mamarias, no rescató la proliferación o la morfogénesis en estas líneas celulares, después de la inhibición del EGFR. Del mismo modo, las células tumorales ErbB2 guiado son EGFR-dependiente y también muestran rescate mediada por HGF. análisis Western-blot de las vías de señalización implicadas en el rescate después de la inhibición del EGFR se indica que la activación concomitante ERK1 /2 y AKT fue impulsada exclusivamente por Met, pero no por IGF-I o b-FGF. Estos resultados describen un papel único para EGFR y Met en células epiteliales mamarias, mostrando que las vías similares pueden ser utilizados por las células tumorigénicas para sostener el crecimiento y resistir a los fármacos anti-tumorigénicos EGFR dirigido
Visto:. Accornero P, Miretti S, Bersani F, e Quaglino, Martignani e, M Baratta (2012) Met receptor actúa únicamente para la Supervivencia y la morfogénesis de células epiteliales mamarias normales y el cáncer de EGFR-dependiente. PLoS ONE 7 (9): e44982. doi: 10.1371 /journal.pone.0044982
Editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Estados Unidos de América
Recibido: May 4, 2012; Aceptado: August 16, 2012; De publicación: septiembre 13 de, 2012
Copyright: © Accornero et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas nacionales del Ministerio de Instrucción, Universidad e Investigación, PRIN 2009 y por las subvenciones locales de Universidad de Turín y la Compañía de San Pablo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
hormonas circulantes como el estrógeno, la progesterona, la hormona del crecimiento y prolactina fueron de los primeros factores endocrinos que fueron identificados como necesarios para la morfogénesis de la glándula mamaria y la diferenciación durante el crecimiento, la ciclicidad reproductiva y el embarazo [1]. Aunque se conoce un papel directo para estas hormonas, evidencias recientes muestran que sus principales actividades biológicas se logran a través de la liberación de factores de crecimiento locales por las células epiteliales y del estroma mamario. Estos factores, posteriormente, se difunden y activan sus respectivos receptores en el estroma o compartimentos epiteliales que promueven una interacción epitelio-mesenquimal. Ambos compartimentos celulares de la glándula tanto, se requieren para el correcto desarrollo de este órgano [2] - [4]. Estos mecanismos de señalización indirectos aseguran que el estímulo sistémico se amplifica en el órgano diana y que los diferentes tipos de células participan en los eventos morfogenéticas de una manera coordinada y afinado de acuerdo a los requerimientos locales.
La mayoría de estas moléculas liberadas localmente actuar a través de receptores específicos de la tirosina quinasa (RTK) la promoción de varias respuestas biológicas, como la proliferación, la remodelación de la matriz extracelular y la motilidad de las células diana. Aunque algunos de estos factores tienen un papel preciso y único durante la morfogénesis o remodelación de la glándula, muchas vías de señalización corriente abajo de activado diferentes RTK son idénticos. Por lo tanto, estas vías pueden actuar como redundante cuando se activa simultáneamente en el mismo tipo de células, posiblemente el refuerzo de la cascada de fosforilación y su efecto biológico final.
Uno de los mejores describe RTK que actúan como un modulador morfogénica fundamental de la mamaria glándula es el factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR). Dentro de la glándula mamaria de roedores, anfirregulina liberan localmente, cuyo único receptor conocido es EGFR, se encontró para mediar en la señalización de estrógenos durante el desarrollo puberal mamaria. Los esteroides hormona actúa estimulando la liberación de anfirregulina por el receptor de estrógeno positivo compartimento epitelial de la glándula. Amphiregulin luego promueve la activación de EGFR en el compartimiento del estroma de la glándula de conducir la ramificación correcta de este órgano [5], [6]. A pesar de que los principales objetivos de anfirregulina son células estromales, esto no descarta que la señalización de EGFR, también tiene un papel en el epitelio. EGFR se expresa tanto en estroma y compartimentos epiteliales [7], [8], y otros ligandos de EGFR, en particular EGF, son altamente expresado en las glándulas durante el embarazo [9]. Así, nuestro primer objetivo fue evaluar si el EGFR desempeña un papel en el crecimiento de células epiteliales mamarias y la facturación. Hicimos esto apuntando este receptor con inhibidores altamente específicos. La dificultad de aclarar el papel de EGFR en el compartimiento epitelial mamaria adulto es posiblemente debido al hecho de que otros receptores, con un patrón de expresión similar, pueden sustituir a la ausencia de EGFR o sus ligandos
in vivo
. De hecho, los fibroblastos del estroma producen muchas señales a las células epiteliales vecinas. Varios factores de crecimiento, como el factor de crecimiento tipo insulina (IGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), neurregulina y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) se expresan en el estroma mamario, mientras que sus respectivos receptores se encuentran en el epitelio [1]. En concreto, el IGF-I tiene un papel importante en la morfogénesis ductal, y puede ser necesaria para las etapas posteriores del desarrollo mamario [10]. FGFR2 está involucrado en el desarrollo mamario, en particular, en la proliferación y la invasión de yemas terminales terminales, pero parece prescindible en la glándula madura [11], [12]. Neoregulina opera durante el desarrollo lobulo-alveolar en el embarazo [13], [14]. Por último, la tirosina quinasa del receptor de HGF, Met, fue encontrado a desempeñar un papel en la morfogénesis mamaria ramificación en
ex vivo
y
in vitro
experimentos [15], [16]. Met podría ser un buen candidato para el reemplazo EGFR ya que la evidencia reciente ha demostrado que este receptor y EGFR pueden actuar cooperativamente durante el desarrollo del riñón para regular yema ureteral ramificación y mediar mantenimiento de la recogida de adulto conducto normal [17]
.
este estudio se evaluó en líneas de células epiteliales mamarias si otros receptores, por lo general presentes en la glándula mamaria, podrían mantener las actividades de EGFR como similares y las vías de transducción de señales cuando la señalización de EGFR se realizó ablación mediante la administración de inhibidores altamente específicos. Por último, hemos probado si tales mecanismos compensatorios también estuvieron presentes en las células tumorales aisladas a partir de un modelo de ratón transgénico bien descrito de ErbB2 tumorigénesis mamaria.
Resultados
Las células epiteliales mamarias EGFR Express y receptores Met y responder el tratamiento a HGF o EGF con la fosforilación de sus respectivos receptores y activación de la ERK1 /2 y AKT Rutas
primer lugar, analizó la expresión de los receptores EGFR y MET y la respuesta bioquímica a sus respectivos ligandos en 3 células epiteliales mamarias líneas de diferente origen. Todas las células expresaron Met y EGFR (Fig. 1A). MCF-10A y NMuMG estimularon con HGF o EGF durante 10 min, 30 min o 60 min muestran un incremento en fosfo-EGFR, fosfo-Met, fosfato ERK1 /2 y los niveles de fosfo-AKT que volvió gradualmente cerca de los niveles basales (Fig . 1B). Datos similares han sido ya descrito para la línea celular BME-UV [18].
El análisis de Western-blot de la expresión de EGFR y Met en células MCF-10A, murino NMuMG y bovina células epiteliales mamarias BME-UV. extracto de hígado de ratón se utilizó como control positivo para ambos Met y EGFR. B. análisis Western-blot de EGFR, Met, ERK1 /2 y la fosforilación de AKT en las células MCF-10A y NMuMG cultivadas en un medio de suero de hambre y tratados con EGF o HGF (20 ng /ml) durante 10, 30 y 60 min. EGFR, Met, ERK1 /2 y AKT se utiliza para mostrar las cargas comparables entre los carriles.
EGFR es requerido para la viabilidad de un subconjunto de líneas celulares epiteliales mamarias, mientras Met activación es prescindible
para probar si EGFR o la actividad Met modulan la viabilidad en las líneas de células mamarias que utilizamos inhibidores altamente específicos de la tirosina quinasa del receptor (RTKi; AG1478 de EGFR y PHA-665752 para Met) a concentraciones nanomolares. Nos primera prueba la especificidad de estos inhibidores mediante la estimulación de las células MCF-10A privadas de suero con HGF o EGF junto con AG1478 o PHA-665752 en 250 nM (Fig. S1). El análisis de transferencia Western mostró que AG1478 y PHA-665752 inhibieron exclusivamente la fosforilación de EGFR y Met, respectivamente.
Estos inhibidores se utilizaron entonces en un ensayo de viabilidad para poner a prueba la dependencia de diferentes líneas de células mamarias en Met o la señalización de EGFR ( Fig. 2A). Las células, cultivadas en su respectivo medio de crecimiento, se trataron con AG1478 y PHA-665752 (250 nM) y controlados por MTT a las 24 y 48 h. Todas las líneas de células epiteliales mamarias no se vieron afectados por el inhibidor de Met PHA-665752. por la inhibición del EGFR AG1478, no modificó la viabilidad BME-UV, mientras que las células MCF-10A y NMuMG viabilidad celular se deteriora en gran medida.
ensayo MTT de las células MCF-10A, y las células NMuMG BME-UV a las 0 h, 24 h y 48 h. Las células se cultivan en su medio de crecimiento (ver materiales y métodos) y, o bien se dejaron sin tratar (Ctrl) o tratados con PHA-665752 (PHA) o AG1478 (ambos 250 nM). valor MTT a 0 h se establece en 100%. Columnas, media (n = 6); bares, S.E.M. * P & lt; 0,01. B. análisis Western-blot de ERK1 /2 y la fosforilación de AKT en las células mamarias cultivadas en sus respectivos medio de crecimiento sin (Ctrl) o con los inhibidores de RTK (250 nM, 1 h) PHA-665752 (PHA) o AG1478 (AG). EGFR, Met, ERK1 /2 y AKT se utilizaron para mostrar las cargas comparables entre los carriles.
Para determinar el mecanismo de bloqueo viabilidad mediada por la inhibición del EGFR que analizaron el estado de activación de ERK1 /2 y AKT siguiente AG1478 o el tratamiento PHA-665752 en las células cultivadas en medio de proliferación (Fig. 2B). En respuesta al tratamiento con AG1478, pero no PHA-665752, las células NMuMG MCF-10A y mostraron una reducción tanto de la fosforilación de ERK1 /2 y AKT. De acuerdo con la incapacidad de los inhibidores para reducir la viabilidad, ERK1 /2 y la activación de Akt estados se inalterada en todas las condiciones en las células BME-UV.
El HGF-Met Eje Restaura proliferación, la supervivencia y morfogénesis en NMuMG y Las células MCF-10A Privadas de EGFR Actividad
a continuación examinó si la activación de Met podría rescatar células de deterioro del crecimiento después de la inhibición del EGFR. HGF actuó como un agente de recuperación en las células MCF-10A y NMuMG tratados con AG1478 (Fig. 3A). Dado que el IGF-I, b-FGF y neurregulina se han descrito como mediadores importantes de desarrollo mamario [10], [11], [14] hemos probado su efecto como posibles agentes de recuperación alternativo en las mismas líneas celulares. Ambos no aumentar la proliferación en respuesta a estos factores de crecimiento después del tratamiento AG1478 (Fig. 3A). HGF recuperación mediada en células tratadas con AG1478 era evidente como un aumento de confluencia en MCF-10A (que crecen islas como compactos; Fig. 3B paneles de la izquierda) y el aumento de la densidad celular en las células NMuMG (que crecen como células dispersas; Fig. 3B paneles de la derecha) .
recuento de células viables mediante tinción de exclusión con azul de tripano a las 48 h de MCF-10A (panel izquierdo) y NMuMG (panel derecho) células cultivadas en su respectivo medio de crecimiento y tratados con los factores indicados (HGF 10 ng /ml (H), IGF-I 100 ng /ml (I), b-FGF 20 ng /ml (F), neurregulina 20 ng /ml (n); AG1478 250 nM (A)). Control sin tratar (Ctrl) se fijó a 100%. Columnas, media (n = 6); bares, S.E.M. * P & lt; 0,05. células B. MCF-10A (paneles de la izquierda; compuestos de 9 campos) y células NMuMG (paneles de la derecha) cultivadas en sus respectivos medio de crecimiento durante 24 h con los factores indicados (HGF 10 ng /ml; AG1478 250 nM). Bar = 1,000 m. C. muerte Extended imagen compuesta de campo obtenido a partir de varias imágenes de apilamiento de Z de las células MCF-10A (paneles de la izquierda) y células NMuMG (paneles de la derecha) obtenidas en el colágeno durante 4 días con los factores indicados (HGF 10 ng /ml; 250 AG1478 Nuevo Méjico). Bar = 500 micras. células y NMuMG (paneles de la derecha; 16 h); D. de distribución del ciclo celular examinado por tinción con yoduro de propidio y análisis FACS de las células MCF-10A (8 h paneles de la izquierda) se cultivan en medio de crecimiento y tratados con los factores indicados (HGF 10 ng /ml, AG1478 250 nM).
NMuMG y líneas celulares MCF-10A poseen capacidades morfogénicas cuando se volvió a suspender y se cultivaron en una matriz de 3-D como el colágeno [16], [19]. AG1478 tenía un efecto dramático en 3D-morfogénesis de las dos líneas celulares, induciendo la muerte de todas las células (Fig. 3C, AG y vídeo S1). HGF fue el factor de crecimiento solamente probado capaz de recuperar las células de la inhibición del EGFR (Fig. 3C, AG + HGF y Vídeo S2). EGF, IGF-I, b-FGF y neurregulina no fueron capaces de recuperar la muerte celular después del tratamiento AG1478 (no mostrado). especificidad se reunieron para la recuperación de HGF en células MCF-10A NMuMG y se confirmó usando el inhibidor Met PHA-665752 a 250 nm junto con AG y HGF altamente específico. En presencia de este RTKi, HGF perdió su capacidad para recuperar las células mamarias de la inhibición del EGFR (Fig. S2, A + P + H). Análisis
Células ciclo por FACS mostró que la inhibición de EGFR condujo a un aumento de la el porcentaje de células en G0 /G1 fase (Fig 3D;. AG). tratamiento HGF invierte el porcentaje de células en fase G0 /G1 a los valores de control (figura 3D;. AG + HGF).
HGF es un factor de supervivencia en las células tumorales mamarias derivado de un activada constitutivamente ratones transgénicos ErbB2
Hemos probado si los efectos descubiertos en las células mamarias normales podrían aplicarse a las células aisladas a partir de un modelo bien descrito de ratones transgénicos mutado-ErbB2 (MMTV-neu; [20]). En primer lugar, visualizamos, por análisis de western-blot, la presencia de ErbB2, EGFR y Met en lisados tumorales mamarias obtenidos de diferentes ratones (Fig. 4A). Las células primarias obtenidas a partir de estos tumores fueron sometidos a la muerte celular después de 72 h de tratamiento con AG1478 (250 nM), mientras que PHA-665752 (250 nM) no tuvo ningún efecto (Fig. 4B). Con el fin de probar si la muerte celular inducida por AG1478 podía ser recuperado por la activación de Met, las células tratadas con AG1478 fueron suplementados con HGF. La viabilidad celular volvió a los valores de control, mientras que la suplementación de IGF-I, b-FGF y neurregulina no tuvo ningún efecto (Fig. 4C). Análisis del ciclo celular por tinción con yoduro de propidio-y de flujo mostró citometría de un aumento de células en la fase G0 /G1 después de AG1478 adición (Fig. 4D, AG). Después de celdas de tratamiento de HGF revertidas a valores similares a las células no tratadas (Fig 4D;. AG + HGF). Para confirmar la contribución satisfecha hasta el mecanismo de recuperación se utilizó PHA-665752, junto con AG y HGF. Se encontró que en presencia de este Met TKi, HGF perdió su capacidad para recuperar las células tumorales ErbB2 de EGFR inactivación (Figura S3 A;. A + P + H). Para confirmar aún más la especificidad de AG1478, se trataron estas células con otros dos inhibidores de EGFR se utilizan en protocolos clínicos (Iressa y Tarceva; 1 mM). HGF retiene la capacidad de recuperar las células tumorales ErbB2 tratados con Iressa y Tarceva (Fig. 4E y la Fig. S3B). las células tumorales ErbB2 Por lo tanto obtenidos de este modelo transgénico dependen de EGFR activado para el crecimiento y la supervivencia y puede ser rescatada por la activación de Met.
análisis Western-blot de ErbB2, EGFR y Met expresión en tumores de mama obtenidos de tres separado ratones mutados transgénico ErbB2 (ver materiales y métodos). Tubulina se utilizó como control interno de carga. imágenes de contraste de fase de células B. primarios de tumores de mama ErbB2 (barra = 500 micras). Las células se cultivaron en medio de proliferación y, o bien se dejaron sin tratar (Ctrl) o tratados con AG1478 (250 nM) o PHA-665752 (250 nM) durante 96 h. C. recuento de células viables mediante tinción de exclusión del azul tripán a las 48 h, de las células tumorales ErbB2 inmortalizadas tratados con los factores indicados (HGF 10 ng /ml (H), IGF-I 100 ng /ml (I), b-FGF 20 ng /ml (F), neurregulina 20 ng /ml (N); AG1478 250 nM (A)). Control sin tratar (Ctrl) se fijó a 100%. Columnas, media (n = 6); bares, S.E.M. * P & lt; 0,05. distribución D. ciclo de células examinadas mediante tinción con yoduro de propidio y análisis FACS de las células de tumor mamario de ErbB2 se cultivan en medio de crecimiento y tratados con los factores indicados para 16 h (HGF 10 ng /ml, AG1478 250 nM). células E. inmortalizadas ErbB2 tumorales cultivadas en sus respectivos medio de crecimiento durante 48 h con los factores indicados (HGF 10 ng /ml; AG1478 250 nM; IRESSA 1 M; TARCEVA 1 M). Barra = 500 micras
Met fosforilación activa simultáneamente ERK1 /2 y AKT cuando se inhibe la señalización del EGFR:. Importancia relativa de las ERK1 /2 y Akt Caminos para la proliferación y morfogénesis 3D
para comprender el mecanismo de recuperación mediada por HGF, se realizó un análisis Western-blot del EGFR fosforilado, Met y sus efectores aguas abajo ERK1 /2 y AKT (Fig. 5A). Para este propósito las células MCF-10A y NMuMG privadas de suero se trataron con EGF (10 ng /ml), HGF (20 ng /ml) o IGF-I (100 ng /ml) en ausencia o presencia de AG1478.
análisis Western-blot de la EGFR, Met, ERK1 /2 y AKT estado de fosforilación en las células MCF-10A y NMuMG y células tumorales ErbB2 cultivadas en un medio de hambre durante 16 h y después se trató con la RTK inhibidores AG1478 (250 nM , 1 h) antes de la adición de las citocinas indicadas (10 min; EGF 10 ng /ml, HGF 10 ng /ml, IGF-I 100 ng /ml). B. recuento de células viables mediante tinción de exclusión con azul de tripano a las 48 h de células NMuMG cultivadas en medio de cultivo y los inhibidores indicados (AG /A = 250 nM AG1478; UO /T = UO126 15 M; HIERBA /W = wortmanina 100 nM) en presencia o ausencia de HGF 10 ng /ml (H). Control sin tratar (Ctrl) se fijó a 100%. %. Columnas, media (n = 6); bares, S.E.M. * P & lt; 0,05. C. imágenes representativas de las células cultivadas en NMuMG geles de colágeno durante 4 días en medio de cultivo con los factores indicados (concentraciones como en B; bar = 250 m).
Todos los factores de crecimiento activan tanto la ERK1 /2 y las vías de Akt en la ausencia de inhibición de EGFR (Fig. 5A, carriles 3, 5, 7). Después del tratamiento AG1478, HGF seguía siendo la única citoquina capaz de mantener ambas vías activas simultáneamente, de acuerdo con el hecho de que fosfo-Met está todavía presente en las células EGFR inhibidos (Fig. 5A, carril 6). Aunque los niveles de fosfo-AKT activado-IGF-I no fueron afectados por AG1478, fosfato ERK1 /2 niveles fueron abolidas por la inhibición del EGFR (Figura 5A, carril 8;. Véase el debate). rescate Por lo tanto mediada por HGF de la proliferación y la morfogénesis de las células mamarias posiblemente necesita reactivación simultánea tanto de las ERK1 /2 y AKT vías.
Los análisis de inmunotransferencia de tipo Western similares realizados en células tumorales ErbB2 privadas de suero mostró basal fosfo-EGFR, los niveles de fosfo-AKT que fueron abolidos por el tratamiento AG1478 fosfato ERK1 /2 y. Análogamente a las células mamarias normales, HGF sólo tenía la capacidad de restaurar simultáneamente ERK1 /2 y AKT fosforilación en presencia de la inhibición del EGFR. Por lo tanto las células tumorales ErbB2 impulsada posiblemente utilizan un mecanismo de recuperación comparable a la encontrada en NMuMG no malignas y células MCF-10A (Fig. 5A, ErbB2). Para confirmar aún más la especificidad del AG1478, los experimentos de Western-blot se repitieron utilizando Iressa (1 M) en NMuMG y células ErbB2-accionado, con resultados comparables (Fig. S4A).
Desde EGFR y Met parecen actuar a través de los efectores similares, hemos probado si EGF y HGF tratamiento simultáneo podría aumentar el crecimiento de células mamarias, la dispersión y la morfogénesis. Las células tratadas simultáneamente con las dos citoquinas muestran un aumento en el porcentaje de confluencia (células MCF-10A; vídeo S3 y Fig S4B.), La dispersión y la morfogénesis (NMuMG células; Figura S4C). Relativa a EGF células sólo o HGF tratados sólo
finalmente se analizó la importancia relativa de los /2 y AKT vías ERK1 durante la proliferación y morfogénesis en EGFR células mamarias inhibidos (Fig. 5B). Para ello se inhibió selectivamente /2 y /o AKT vías ERK1 con UO126 15 micras y wortmanina 100 nM respectivamente. Tales inhibidores se acoplaron con el tratamiento AG1478 con el fin de comprender si HGF retiene la capacidad de recuperar el crecimiento en las células mamarias que carecen de estas vías. La inhibición de la vías PI3K-AKT ERK1 /2 y, por separado y junto con el bloqueo de EGFR, conducen a una disminución en la viabilidad celular. Curiosamente, en todas las condiciones inhibitorias, HGF aumentó el número de células, aunque con diferentes eficiencias de acuerdo con el tratamiento. Este comportamiento indica que en ausencia de cualquier combinación de la señalización de EGFR /ERK1-2 /AKT, Met todavía aumenta la proliferación en células cultivadas 2D (Fig. 5B panel superior y la Fig. S5) probablemente la activación de vías de señalización alternativas.
Un análisis realizado en células NMuMG cultivadas en 3D-colágeno suspensiones nos dio resultados diferentes y demostró que ERK1 /2 señalización era siempre necesaria para mantener la viabilidad (figura 5B panel inferior.): la administración de suplementos de HGF no podía restablecer la viabilidad en UO126 células tratadas (UO ; UO + HGF, AG + UO; AG + UO + HGF). Por otro lado, la inhibición de la vía de señalización de PI3K-AKT detuvo alargamiento ductal pero no mató a las células (hierba). Además HGF restauración del crecimiento y la morfogénesis (hierba + HGF) en Wortmannina células tratadas. Curiosamente, cuando las células inhibidas EGFR fueron tratados simultáneamente con wortmanina, HGF podría no actuar como un agente de recuperación (AG + Wort y A + W + HGF). Estos datos indican que en ausencia de señalización EGFR la ERK1 /2 y las vías PI3K-AKT son ambos independientemente necesaria para el crecimiento en una matriz de 3 dimensiones, pero no en un ensayo de proliferación 2D.
Discusión
crecimiento de los órganos, la homeostasis de los tejidos normales y el desarrollo de tumores puede compartir las vías biológicas comunes. En este estudio hemos abordado la relación entre EGFR y MET vías de señalización en las células epiteliales mamarias normales, así como en células derivadas de un modelo transgénico bien descrita de la tumorigénesis mamaria. Se encontró que 2 de cada 3 ensayaron líneas de células epiteliales mamarias, la murino NMuMG y las líneas celulares MCF-10A humanos, dependen de la actividad de EGFR con el fin de crecer en un ensayo de proliferación 2D y sobrevivir en un ensayo de 3D-morfogénesis. Un papel fundamental para el receptor de EGF en la morfogénesis de la glándula mamaria se ha encontrado durante el crecimiento prepuberal en el compartimiento del estroma de este órgano [5], [21], pero, a partir de ahora, no hay ninguna función conocida para este receptor en el compartimiento epitelial de la glándula mamaria de adultos. Aquí describimos que EGFR es fundamental para el crecimiento y la viabilidad en las líneas celulares mamarias no tumorigénicas específicas que se han obtenido a partir de tejidos mamarios adultos. Deterioro del EGFR, pero no trato de economía de señalización en estas líneas celulares interrumpido la morfogénesis y la muerte celular inducida por completo. MCF-10A dependencia de EGFR puede ser debido a que estas células que se cultivan en un medio que contenía EGF. Una posible explicación para la adicción de EGFR en las células NMuMG es que esta línea celular produce sus propios ligandos de EGFR. De hecho hemos encontrado altos niveles de expresión de ARNm en las células anfirregulina NMuMG (datos no mostrados) posiblemente conducir la proliferación por un bucle autocrino. Otras células epiteliales mamarias se han demostrado para producir y liberar ligandos de EGFR [22], por lo tanto, este mecanismo de crecimiento puede ser común a las células epiteliales, incluso en la glándula mamaria de un adulto. El hecho de que las células mamarias bovinas BME-UV no respondieron a la inhibición del EGFR se debe probablemente al hecho de que esta línea celular mantiene las vías de ERK1 /2 y AKT activos bajo tratamiento AG1478. Una posible explicación es que, durante el proceso de inmortalización, la inactivación de supresores de tumor importantes (como PTEN) han traído células BME-UV para activar constitutivamente estas vías de señalización fundamentales. Otra hipótesis es que especulativo en bovinos, que no son propensos a desarrollar cánceres de mama, estas vías tienen niveles de fosforilación constitutivamente altos incluso en las líneas celulares no tumorigénicas. La diferencia en la sensibilidad a EGFR encontrado en líneas celulares, plantea la cuestión de si algunas células mamarias que pertenecen a diferentes compartimentos de la glándula (basal, por ejemplo, o luminal) pueden tener diferentes requisitos de crecimiento. La expansión de nuestra investigación con otras células mamarias líneas de diferente origen puede aclarar esta duda. Este hecho también es importante porque los tumores que surgen a partir de células de un compartimiento particular, pueden mostrar diferentes respuestas a inhibidores específicos
.
Aunque Met era prescindible para el crecimiento en todas las líneas celulares ensayadas, el HGF fue la única citoquina capaz de recuperar la proliferación y morfogénesis en EGFR células inhibidas. Algunos autores han descrito un papel directo de HGF en la glándula mamaria [23], [24], pero los datos completa que aclarar el papel que desempeña la del receptor Met
in vivo
todavía son insuficientes. Nuestro laboratorio está evaluando el papel de Met por la orientación de genes con promotores específicos mamarias (MMTV-cre y Wap-CRE), pero de manera coherente con los
in vitro
los datos aquí presentados, todavía no hemos encontrado un papel para el receptor de HGF en estos modelos transgénicos (manuscrito en preparación). Curiosamente, otros factores de crecimiento (IGF-I, b-FGF y neurregulina), que han sido descritas como importantes mediadores de la morfogénesis mamaria [10] - [14], [25], no fueron capaces de actuar como agentes de recuperación en estas células. No podemos excluir que estos factores pueden desempeñar un papel importante en las células derivadas de diferentes subpoblaciones de la glándula o cánceres de mama mamaria. La evidencia reciente muestra que el EGFR puede jugar un papel importante en algunas de las respuestas biológicas mediadas HGF /Met de tumor mamario y células epiteliales. En esta inhibición del sistema de la EGFR quinasa con gefitinib o erlotinib abolido la proliferación inducida por HGF y la motilidad de algunas células de carcinoma de [26]. Por el contrario en nuestros parámetros experimentales Met era capaz de actuar como un agente de recuperación en células inhibidas de EGFR y fosfo-Met y fosfo-EGFR parecía ser activado, por lo menos en parte, por separado. Aunque no podemos descartar un cierto grado de Met-EGFR transactivación en nuestro sistema, la mayor parte de la señalización aguas abajo es evocado por una, mecanismo impulsado por el Met EGFR impulsada o independiente. La diferencia en los resultados puede depender de las diferentes líneas de células que, cuando se utiliza o su condición de cultivo (que utilizamos siempre medio de crecimiento completo con suero y factores de crecimiento para la mayoría de los experimentos). Este resultado indica cómo dos vías específicas que se originan de diferentes receptores pueden conducir respuestas celulares similares (por ejemplo, la viabilidad o la proliferación) de forma independiente el uno del otro.
También encontramos que la activación sincrónica de EGFR y Met aumentó el crecimiento, dispersión y morfogénesis en células NMuMG y MCF-10A. Este efecto, en la que dos receptores de tirosina quinasa separadas pueden actuar de una manera redundante y aditivo para promover el crecimiento celular, no es única para las células mamarias.
In vivo
, durante la morfogénesis del riñón, tejido Met específicos agujeros ciegos han reducido el número de nefronas final. Cruzando estos ratones con-2 onduladas mutantes espontáneos, llevando un único punto de mutación que reduce la actividad de la quinasa EGFR, afecta yema ureteral de ramificación así como el número glomerular final [17]. Recientemente, hemos mostrado que un mecanismo similar de EGFR /Met redundancia sucede también en la glándula mamaria [27].
ErbB2 es un iniciador importante de la tumorigénesis mamaria con cánceres de mama humano más del 30% que presenta la amplificación y sobreexpresión de ErbB2 [ ,,,0],28]. EGFR es a menudo un socio de dimerización para ErbB2 tanto fisiológica, durante el desarrollo de la glándula mamaria [13], [29], y los tumores patológicamente en ErbB2 impulsados [30]. por tanto, se evaluaron los efectos de la inactivación del EGFR en un modelo transgénico bien descrita de la tumorigénesis mamaria. Esta línea transgénica expresa un promotor impulsado MMTV rata-ErbB2 con una mutación que obliga a la activación constitutiva del receptor [20]. Todos los tumores obtenidos de ratones mutado ErbB2 mostraron EGFR, ErbB2 y expresión Met. la inhibición del EGFR causó la muerte de las células primarias y inmortalizadas aisladas de este tumor. Dado que la inhibición de EGFR por AG1478 a la concentración utilizada en nuestros ensayos es selectiva (IC50 3 nM; ErbB2 IC50 es & gt; 100 mM) la mutación ErbB2 posiblemente activa EGFR a través de hetero-dimerización. De hecho se observó una disminución tanto de fosfo-EGFR y fosfo-ErbB2 (no mostrado) en las células tumorales ErbB2 tras el tratamiento con AG1478. Por lo tanto, se encontró que en este modelo transgénico, la activación de ErbB2 que impulsa el crecimiento del tumor se acopla a la actividad quinasa de EGFR, que es fundamental para la viabilidad celular. tratamiento HGF rescató células tumorales inhibidas de EGFR, lo que indica que las vías similares a las presentes en las células mamarias NMuMG y MCF-10A también pueden ser utilizados por las células de cáncer para sostener su crecimiento. El hecho de que las células tumorales responden a HGF con el aumento de la proliferación y la supervivencia después de la inhibición del EGFR también se ha tratado en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Un subgrupo de pacientes con CPNM que desarrollan resistencia a los inhibidores de EGFR presentaron aumento de los niveles de HGF que apoyan un papel para los derivados del estroma HGF en la promoción de resistencia a los medicamentos [31], [32]. Este tipo de resistencia, en el que los niveles de receptor normales están acompañados por una expresión más elevada de su respectivo factor de crecimiento en el estroma circundante, puede por lo tanto representar un mecanismo utilizado por las células tumorales para escapar de tratamiento RTKi. Nuestros hallazgos sobre la recuperación mediada por HGF, se extienden los resultados publicados con anterioridad a las células epiteliales mamarias y células tumorales de mama ErbB2, haciendo hincapié en el hecho de que los eventos moleculares presentes en células no tumorigénicas podrían ser retenidos durante el crecimiento del tumor y se convierten en la base para la resistencia a los medicamentos.
Uno de los posibles mecanismos de recuperación de células mamarias subyacente por HGF tratamiento tras la inactivación del EGFR fue la capacidad de esta citocina para activar tanto las /2 y la AKT vías ERK1. Por lo tanto se investigó la importancia relativa de estas dos vías en la conducción de la resistencia a la inhibición del EGFR. Nuestros resultados muestran que el HGF era la única citoquina con la capacidad de activar las vías de la AKT independientemente de la señalización de EGFR ERK1 /2 y. Confirmando las observaciones realizadas por otros autores [33] - [35], quienes demostraron que la caída o el bloqueo de EGFR bloquearon la MAPK inducida por IGF-I (lo que sugiere que el receptor del IGF-I puede actuar aguas arriba de EGFR), se encontró que el IGF-I no pudo rescatar a la vía ERK1 /2, pero podría rescatar a la ruta AKT en todas las líneas celulares inhibe EGFR. En línea con su incapacidad para rescatar células inhibidas EGFR, básico-FGF fue incapaz de activar ni la ERK1 /2 ni la vía PI3K-AKT en las líneas celulares NMuMG y MCF-10A (datos no mostrados). Por otra parte, tanto estas líneas celulares no aumentaron la proliferación después de b-FGF o tratamiento neurregulina. %.