Extracto
Al momento del diagnóstico, la mayoría de los pacientes con cáncer de páncreas se presentan con enfermedad avanzada cuando la resección curativa ya no tratamientos terapéuticos actuales son viables y en gran medida ineficaz. Una mejor comprensión de dianas moleculares para la intervención efectiva de cáncer de páncreas tanto, es urgente. La tirosina quinasa del receptor Met es un candidato implicado en el cáncer de páncreas. Cabe destacar que, durante Met se expresa hasta en el 80% de los cánceres de páncreas invasivos, pero no en las células ductales normales que correlacionan con una pobre supervivencia de los pacientes en general y el aumento de las tasas de recurrencia después de la resección quirúrgica. Sin embargo, el papel funcional de la señalización de Met en el cáncer de páncreas sigue siendo poco conocida. Aquí hemos utilizado la interferencia de ARN para examinar directamente la importancia del aumento de la señalización patobiológico Met para el cáncer de páncreas. Se demuestra que la Met caída en células tumorales pancreáticas resultados en disminución de la supervivencia celular, la invasión celular y la migración en el colágeno I
in vitro
. El uso de un modelo ortotópico de cáncer de páncreas, proporcionamos
in vivo
evidencia de que la Met caída reducción de la carga tumoral se correlaciona con una menor supervivencia celular y la angiogénesis tumoral, con un mínimo efecto sobre el crecimiento celular. En particular, nos informan de que la señalización de Met regula la secreción de la quimiocina pro-angiogénicos interleucina-8 /CXCL8. Nuestros datos muestran que los interleucina-8 receptores CXCR1 y CXCR2 no se expresan en las células tumorales pancreáticas, sugiere un mecanismo paracrino por el que la señalización de Met regula la secreción de interleucina-8 para remodelar el microambiente tumoral, un nuevo hallazgo que podría tener implicaciones clínicas importantes para mejorar la eficacia de los tratamientos para el cáncer de páncreas
Visto:. colina KS, Gaziova I, L Harrigal, Guerra YA, Qiu S, Sastry SK, et al. (2012) Met tirosina quinasa del receptor de señalización induce la secreción de la quimiocina angiogénico interleucina-8 /CXCL8 en el cáncer pancreático. PLoS ONE 7 (7): e40420. doi: 10.1371 /journal.pone.0040420
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Febrero, 2012; Aceptado: 6 Junio 2012; Publicado: 17 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Hill et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos nacionales de Salud CA-119075 de LAE, DK-052067 de CDL, y CA-118405 a SKS K.S.H. fue apoyado por la formación de subvención NIH /NCI formación multidisciplinar en Cancer Research, T32 (CA117834-03). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) es un cáncer agresivo con una supervivencia mediana de los pacientes de menos de un año, por lo que es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos [1]. La alta tasa de mortalidad de los pacientes PDAC se debe a varios factores. En ausencia de métodos eficaces de detección, el 80-85% de los pacientes presentan enfermedad avanzada que a menudo se opone a la resección curativa [2]. Por otra parte, los tratamientos estándar para la enfermedad avanzada son en gran medida ineficaces [3], [4]. Por lo tanto hay una necesidad urgente de comprender la base molecular del crecimiento PDAC para identificar objetivos de alto valor terapéutico. reciente análisis genético de los tumores pancreáticos identificado varias mutaciones genéticas comunes al 75-90% de los casos de pacientes importantes para la iniciación PDAC y posterior desarrollo de neoplasias intraepiteliales pancreáticas preinvasivas (PanINs 1-3) [5] - [7]. De acuerdo con esto, los modelos de ratón genéticamente modificados para PDAC han confirmado el papel de las mutaciones genéticas específicas en el inicio y desarrollo de la enfermedad en estadio temprano. Ejemplos son PanIN-1 (activación Kras, pérdida de Notch2) [8], [9], PanIN-2 (pérdida de mutaciones de función en p53 supresor de tumores y p16INK4a) [10] y PanIN-3 (inactivación de p53, SMAD4 /DPC4 y BRCA2) [8], [11], [12]. En contraste con estas lesiones preinvasivas etapa temprana, PDAC tiene una falta de mecanismos definidos.
Varias vías de señalización es probable que participan en la PDAC. Uno de los candidatos es la Met /Factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el eje de señalización. En condiciones fisiológicas, la Met de la tirosina quinasa del receptor y su ligando HGF se expresan en niveles bajos en las células acinares pancreáticas y el compartimiento del estroma, respectivamente [13] - [15]. paracrina unión de HGF a los resultados se reunieron en la fosforilación del receptor conduce a un aumento de la supervivencia celular y la motilidad [16], [17]. En contraste con los pulmones y adenocarcinomas gástricos en el que la activación de mutaciones prolongan Met señalización, tales mutaciones Met ganancia de función aún no se han identificado en PDAC. conductos pancreáticos normales expresan niveles bajos Met. Por el contrario Met se sobreexpresa en el 80% de los casos PDAC [18], es un fuerte indicador de un aumento de las tasas de recurrencia y en general pobre supervivencia de los pacientes PDAC [13], [19] - [22]. expresión de Met está presente en hasta 29 líneas de células pancreáticas tumorigénicos con diferentes antecedentes genéticos, incluyendo ASPC-1, Panc-1, BxPC-3 y células Traje-2 [13], [23]. Una excepción es la línea celular MIA Paca-2 pobremente diferenciado, que no expresa endógena Met [13], [23]. Recientemente, se informó que la pequeña molécula inhibidor SGX523 Met para reducir el crecimiento y la infiltración de los tumores pancreáticos subcutáneo [24] despertar el interés en Met como una posible diana terapéutica para la enfermedad avanzada. Sin embargo, el papel preciso de Met señalización para PDAC sigue sin resolverse.
En este estudio, hemos utilizado la interferencia de ARN para reducir Met señalización en xenoinjertos de páncreas humano usando un
in vivo
modelo de ratón ortotópico. Met desmontables células (MetKD) se mantuvo competente para la formación de tumores de páncreas ortotópico
in vivo
; Sin embargo, los xenoinjertos MetKD resultantes fueron significativamente inhibido el crecimiento en relación con los tumores resultantes del control de las células que expresan un no focalización (NT) shRNA. El análisis inmunohistoquímico de xenoinjertos MetKD indicaron un aumento en la apoptosis celular acompañada por una proliferación celular reducida y densidad de los vasos significa (MVD en la periferia de xenoinjertos MetKD. De acuerdo con este escenario, se muestra que Met caída reduce la secreción de interleucina-8 /CXCL8 (IL-8) , una quimiocina pro-angiogénico potente que funciona como un regulador de paracrina de la proliferación de células endoteliales, un activador de los neutrófilos y un quimioatrayente para los fibroblastos y otras células inmunes [25]. Nuestro hallazgo de que Met es un regulador aguas arriba de IL-8 secreción es significativa y sugiere un mecanismo por el cual la señalización Met podría regular el cáncer de páncreas
in vivo
, un hallazgo novedoso que pueden ofrecer oportunidades únicas para la intervención clínica.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los animales se cuidaron de acuerdo con la Oficina de Protección de Riesgos de Investigación (OPRR) y las directrices de la Ley de Protección de los animales en virtud de un animal protocolo aprobado por la Universidad de Texas MD Anderson Institucional Cuidado de animales y el empleo. Este estudio fue aprobado por la Universidad de Texas MD Anderson Institucional Cuidado de Animales y el empleo.
Los anticuerpos, líneas celulares, y mantenimiento
Un anticuerpo contra el C-terminal de Met (C-28 ) se adquirió de Santa Cruz Biotechnology. Un anticuerpo monoclonal de ratón contra β-actina se adquirió de Sigma. Los anticuerpos anti-fosfato tirosina específicos del sitio para Met Y1234 /1235 eran de Upstate. Un anticuerpo específico para el dominio extracelular de Met (anti-hHGFR) se adquirió de amp I +; D Systems, Inc. Los anticuerpos contra Ki67 fueron adquiridos de Abcam, escinde la caspasa-3, ERK1 /2, y fosfato ERK1 /2 T202 /Y204 ( perk) anticuerpos, AKT y fosfo AKT (S473) eran de Señalización celular. anticuerpos CD31 se adquirieron de PharMingen y humana recombinante y murina HGF de PeproTech. células ASPC-1, BxPC-3 y MIA Paca-2 se adquirieron de ATCC y las huellas dactilares de ADN para cada línea verificada mediante PCR específica de sitio (Seqwright). BxPC-3 células se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Gibco) con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1 × penicilina /estreptomicina. células ASPC-1 se mantuvieron en medio de Dulbecco modificado Eagles (DMEM: Gibco) con 10% de FBS y 1 × penicilina /estreptomicina. MIA Paca-2 células que expresan establemente tipo salvaje exógena Met se han descrito en otra parte [23]. 293FT células (Invitrogen) fueron co-transfectadas con el sobre lentiviral (pMD2G), el embalaje (psPAX2), y los plásmidos shRNA dirigidos contra Met humano (Sigma) para producir lentivirus que codifican el shRNA construye. El uso de citometría de flujo que exhibió cuatro plásmidos lentiviral que codificaban secuencias únicas shRNA dirigidos contra la región de codificación o el 3'UTR de Met humano y examinaron su capacidad para derribar la expresión de Met. Se identificaron dos virus shRNA (# 2, Sigma NM_000245.2-3702s1c1 y#5, Sigma NM_000245.2-4462s1c1) que habitualmente dio lugar a la reducción de expresión Met (no mostrados). BxPC-3 y las células ASPC-1 en placas sobre placas de cultivo de tejidos se infectaron con diluciones seriadas de codificación lentivirus MetKD shRNA-2 (5'-CCGGAGACTCATAATCCAACTGTAACTCGAGTTACAGTTGGATTATGAGT CTTTTTTG-3 '), MetKD shRNA-5 (5'-CCGGGCACTATTATAGGACTTGTATCTCGAGATACAAGTCTTATAATAGTGCTTTG-3') o control de NT shRNA (5'-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG-3 '), en presencia de 8 mg /ml de bromuro de hexadimetrina antes de la selección con 5 mg /ml de puromicina durante 7 días, y las colonias se mantuvieron en medios que contenían 2,5 mg /ml de puromicina para 2 meses. plásmidos que codifican pcDNA CXCR1 y CXCR2 fueron una especie de regalo de Xavier Navarro, UTMB Galveston.
Citometría de Flujo
1-2 × 10
6 células fueron sembradas en placas de cultivo de tejidos de 10 cm y después de la adhesión fueron suero de hambre durante la noche. La citometría de flujo para la superficie manchada Met se realizó a través de una matriz de BD FACS como se describe anteriormente [23].
Anchorage ensayos de crecimiento independientes
Una capa inferior de agarosa al 1% diluida en medio que contenía FBS al 1% con o sin 100 ng /ml de HGF (PeproTech) se depositó sobre 4 placas de cultivo de tejidos. Después de que la capa inferior solidificó a temperatura ambiente durante 30 min, 5 × 10
3 células se resuspendieron en medio que contiene 1% de FBS con o sin 100 ng /ml de HGF y una concentración final de 0,4% de agarosa. La célula y la mezcla de agarosa se sobrepuso en las placas de cultivo de tejidos que contienen 1% de agarosa y se dejó solidificar a 4 ° C durante 10 min. Una vez solidificado, se añadió medio que contenía 1% de FBS con o sin HGF y las células se cultivaron durante 6 semanas en una incubadora a 37ºC con 5% de CO
2. Medios suplementados con HGF se cambió cada 2-3 días.
invasión celular y Ensayos de Migración
Se llevaron a cabo los ensayos de migración celular y la invasión como se describe anteriormente [26]. Los ensayos de curación de heridas se realizaron como se describe anteriormente [23]. Las imágenes fueron capturadas usando un microscopio invertido ECLIPSE TE2000-U (Nikon) y se analizaron usando MetaMorph v7.3.1. (Molecular Devices). Para la migración de células vivas en el colágeno I, las células fueron suero empobrecido durante la noche (1% de FBS) y después se sembraron en placas de cultivo de tejidos de fondo de vidrio 35 mm pre-recubierto con 15 mg /ml de colágeno de cola de rata I (BD Bioscience) durante la noche a 4 ° DO. Las células se dejaron adherir durante 1 hora antes del tratamiento con medios que contienen 1% de FBS solo o con 100 ng /ml HGF. Las placas se colocaron en un sistema de células vivas BioStation Imaging (Nikon) y se dejó que la temperatura de la cámara que se equilibre durante 20 min, después de lo cual las imágenes de cada campo se recogieron cada 2 min durante al menos 2 hr. La migración celular se evaluó como la longitud total de la ruta en micrómetros viajado y velocidad de la célula (micras /min) se determinó usando NIS elementos de software (AR3.10).
Ratones y estudios de tumores ortotópico
ASPC -1 (5 × 10
5) o BxPC-3 (1 × 10
6) NT, MetKD-2 o MetKD-5 líneas celulares que expresan niveles equivalentes de luciferasa de luciérnaga, se inyectaron en 50 l de PBS en el cuerpo del páncreas de 5-6 semanas de edad ratones desnudos atímicos macho (NCI-Charles River) como se describe anteriormente [26]. Imágenes de bioluminiscencia se llevó a cabo cada 10 días utilizando un sistema de imagen enfriados criogénicamente IVIS 100 acoplado a una imagen de software de adquisición de datos del ordenador en marcha de la vivienda (Xenogen Corp.) como se describe anteriormente [26]. Cada animal se normalizó a su intensidad de la señal en el día 10 para ajustar las variaciones en la siembra inicial del tumor y se informa como el pliegue-aumento en el volumen del tumor medido como el número de fotones emitidos por el tumor por segundo por cm
2. En la necropsia, los tumores primarios se retiraron quirúrgicamente y se pesaron, y los tejidos o bien se fijaron con formalina para evaluación histológica o Flash congelado para su posterior análisis.
cuantitativa transcripción inversa PCR
Flash xenoinjertos congelados fueron homogeneizados en Trizol reactivo (Invitrogen) y el ARN total aislado de acuerdo con fabrica direcciones. 500 ng de ARN se convirtió en ADNc utilizando la síntesis de ADNc iScript (BioRad) con cebadores hexámeros aleatorios. 2 l del cDNA se utilizó como molde para la relación cuantitativa en tiempo real PCR utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). SYBR verde incorporación se midió durante 40 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 min utilizando secuencias de cebadores para Met (hacia delante 5 'TAAGTGCCCGAAGTGTAAGC 3' y revertir 5'CTTGCCATCATTGTCCAACAAAGTCCC -3 ') y GAPDH (adelante 5'-CAATGACCCCTTCATTGACCTC-3' y revertir 5'-AGCATCGCCCCACTTGATT-3 '). El nivel de Met ARNm se determinó mediante la normalización de la C
valor de T a la C
T de GAPDH humano utilizando el comparativo C
T (ΔΔ
C
T) como método descrito por los fabricantes (Applied Biosystems). Para los estudios que utilizan líneas celulares, se sintetizó ADNc a partir de ARN total usando Accuscript (Stratagene) y PCR a cabo usando AmpliTaq Gold PCR master mix (Applied Biosystems) usando los siguientes conjuntos de cebadores para CXCR1 humano, 5'-TGGGAAATGACACAGCAAAA-3 '(hacia adelante) y 5'-AGTGTACGCAGGGTGAATCC-3 '(hacia atrás), CXCR2 humano, 5'-ACTTTTCCGAAGGACCGTCT-3' (hacia delante) y 5'-GTAACAGCATCCGCCAGTTT-3 '(hacia atrás), GAPDH humano, 5'-ACGCATTTGGTCGTATTGGG-3' (hacia adelante) y se utilizaron 5 'TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3' (hacia atrás). Los productos amplificados se resolvieron en geles de agarosa al 2% que contiene bromuro de etidio y la imagen usando un sistema de documentación de geles AlphaInnotech (AlphaInnotech).
La inmunohistoquímica.
ortotópico tumores se procesaron para inmunohistoquímica, como se describe anteriormente [26] , [27] utilizando anticuerpos contra Met (C-28), Ki67 o troceados caspasa-3. Todas las diapositivas se counterstained con hematoxilina, y cegados por lo que la puntuación se llevó a cabo de una manera imparcial. La proliferación y la apoptosis se cuantificó mediante la determinación del porcentaje de células que fueron positivas para Ki67 y escinde la caspasa-3, respectivamente. Tres campos al azar por sección tumor donde imágenes utilizando un objetivo de 40 × 200 en un microscopio Zeiss Axiovert con una cámara de color Zeiss MRC5. El número de manchado positivamente (C
P) y negativos células no teñidas (C
N) se contaron usando MetaMorph v7.3.1 (Molecular Devices). El porcentaje de tinción positiva (% P) de las células se determinó utilizando la siguiente ecuación:% P = (C
P /(C
P + C
N)) * 100. El porcentaje de necrosis (% N) se determinó en H & amp; muestras de tumores de xenoinjertos manchado E imágenes utilizando un 5 × objetivo y se analizaron usando MetaMorph v7.3.1. El porcentaje de necrosis (% N) para cada muestra de tumor se calculó usando la siguiente ecuación% N = (A
N /A
T) * 100, donde A
N y A
T representan la necrótico y las áreas totales, respectivamente. CD31 /plaquetas molécula de adhesión de células endoteliales 1 tinción (PECAM-1) se evaluó en tejidos pancreáticos congelados que se seccionaron (8-10 micras), montado en portaobjetos cargados positivamente y se secó al aire durante 30 min y se tiñeron usando anticuerpos CD31 como se describió anteriormente [28]. Las muestras de control expuestas a un anticuerpo secundario solo no mostraron tinción específica. Para la cuantificación de densidad media recipiente (MVD) en las secciones se tiñeron para CD31, 3 campos por sección tumor se obtuvieron imágenes utilizando un objetivo de 20 × 200 en un microscopio Zeiss Axiovert y el número de vasos positivos a CD31 discretas por campo se anotó.
angiogénesis Arrays y ELISA
3 × 10
6 células fueron sembradas en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm y se dejó que las células se adhieran durante la noche a en un incubador humidificado 37 ° C con 5% de CO
2. Se lavaron las células en medios con FBS al 1% y suero empobrecido durante la noche antes del tratamiento con DMEM que contenía FBS al 1% solo (sin ligando) o con 100 ng /ml de HGF durante 48 horas. Se recogió medio acondicionado y se centrifugó para eliminar los residuos de células antes del análisis. La angiogénesis humana matrices, VEGF (I + amp; D Systems, Inc) e IL-8 ELISA humanos (BD Biosciences) se realizaron en medios acondicionados como se describe por el fabricante. Para cuantificar VEGF tumor y IL-8 niveles, encajen muestras tumorales congeladas se procesaron tal como se describe anteriormente [29]. ELISA se realizó usando proteína de 10 g diluida en 100 l con tampón RIPA (NaCl 150 mM, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,1% de SDS, 1% NP-40 (Igepal), 0,5% de ácido desoxicólico) que contiene proteasa (2 mg /ml de aprotinina, inhibidores de 2 mg /ml de pepstatina A, y 2 mg /ml de leupeptina) y fosfatasa (mM NaF 10, 2 mM Na
3Vo
4). Los niveles de VEGF y de la proteína IL-8 detectadas en xenoinjertos por ELISA se presentan como pg de IL-8 o VEGF por lisado g de proteína (BCA, Pierce).
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos fueron realizaron utilizando el software GraphPad Prism (v4), utilizando un uno o de dos vías de análisis de varianza (ANOVA) con un Bonferroni post-hoc de análisis para determinar la significación estadística entre los grupos.
Resultados
Estable desmontables de Met
inhibidores farmacológicos apoyan un papel oncogénico de una mayor Met señalización en varios tumores sólidos. Sin embargo, la evidencia directa el apoyo a la significación patológica del aumento de los niveles de Met PDAC sigue sin resolverse. De acuerdo con ello, se utilizó la interferencia de ARN para derribar Met en las líneas de células de páncreas humano BxPC-3 y ASPC-1, ya que se derivan de los cánceres pancreáticos humanos primarios y expresar altos niveles de tipo salvaje Met. Mientras que BxPC-3 son células de tipo salvaje de Kras y p53 mutante expresa, las células ASPC-1 son mutantes para Kras y p53, las mutaciones claves importantes para la transformación celular y el inicio de la enfermedad en estadio temprano [30]. Dos poblaciones policlonales de células Met desmontables (MetKD) que expresan diferentes shRNA secuencias específicas Met (MetKD-2 y MetKD-5) se establecieron utilizando lentivirus recombinantes. poblaciones policlonales de células ASPC-1 o BxPC-3 que expresan un NT shRNA se utilizaron como controles. El análisis de Western confirmó caída estable del total Met y HGF activado Met en BxPC-3 y MetKD-2 y MetKD-5 células ASPC-1 con relación a las células NT. Perk sólo se detectó en las células BxPC-3 tratadas con HGF, en consonancia con el tipo silvestre del estado de KRAS de estas células. Como se esperaba, se detectaron niveles más bajos de pERK estimulada por HGF en BxPC-3 células MetKD en comparación con NT expresando células (Figura 1A). Por el contrario, el análisis de Western detectado altos niveles de pERK en HGF tratados y no tratados ASPC-1 células Met KD y NT consistente con el estado de Kras oncogénico de estas líneas celulares (Figura 1B). niveles comparables pAKT se detectaron de forma rutinaria en respuesta a HGF en células MetKD y NT. La citometría de flujo análisis confirmó expresión reducida de la superficie celular se reunió en la células ASPC-1 MetKD BxPC-3 y en comparación con las células control (Figura 1C NT & amp; 1D).
BxPC-3 (A) o ASPC- 1 células (B) infectadas con lentivirus recombinante que expresa Met desmontables shRNA (2 o 5) o un no focalización (NT) shRNA fueron tratados sin (-) o con (+) HGF y se examinó mediante análisis Western para pMET (Y1234 /1235) , Met, pErk1 /2, Erk1 /2, pAKT, AKT y los niveles de beta-actina (n = 3). De flujo la expresión en superficie Met reducido detectado citometría en BxPC-3 (C) y ASPC-1 (D) células en relación a las células NT MetKD. Los valores se expresan como la media +/- SEM modo (*** p & lt; 0,001; ANOVA, n = 3). Reducción del crecimiento de anclaje independiente de BxPC-3 (E) y células ASPC-1 (F) MetKD en suave relativa agar a las células NT (*** p & lt; 0,001; ANOVA, n = 3). knockdown Met tuvo un efecto mínimo sobre el crecimiento de BxPC-3 (G) y las células-1 ASPC (H) MetKD relación con las células NT.
Para evaluar si la señalización de Met afecta el potencial tumorigénico de BxPC- 3 y ASPC-1 en las células, se realizaron ensayos de crecimiento independiente de anclaje en agar blando. células NT y MetKD fueron sembradas en 0,4% de agarosa en presencia o ausencia de HGF y el número de colonias resultantes, tal como se define como un grupo de tres o más células se anotó. En las líneas celulares NT, el tratamiento HGF resultó en un aumento significativo en el número de colonias presentes en agar blando consistente con un papel para el Met de señalización en el crecimiento celular independiente del anclaje. Por el contrario, las células tratadas con HGF MetKD mostraron una capacidad reducida para crecer de una manera independiente del anclaje en agar blando (Figura 1E & amp; 1F). A continuación examinó el efecto de Met caída sobre la proliferación celular inducida por HGF. Curiosamente, la proliferación inducida por HGF no se vio afectada por Met caída en BxPC-3 y las células (Figura 1G & amp; 1H) 1 ASPC.
El efecto de Met caída sobre la migración celular inducida por HGF se examinó utilizando una herida ensayo de curación. Como se muestra en las figuras 2A & amp; B (información de apoyo S1), las células MetKD consistentemente demostraron una reducción de la motilidad inducida por HGF en comparación con las células NT. El uso de un ensayo de invasión basado en matrigel, también muestran que la pérdida de Met señalización redujo significativamente el fenotipo invasivo de BxPC-3 células MetKD (Figura 2C). PDAC se caracteriza por un estroma desmoplásico abundante que está altamente enriquecido en componentes de la matriz extracelular incluyendo el colágeno I. Como resultado, hemos realizado estudios de imágenes de células vivas para medir las diferencias en la migración inducida por HGF de líneas de células ASPC-1 NT y MetKD sembradas en colágeno I (Figura 2D). Las células se dejaron adherir durante 1 hr en colágeno I antes del tratamiento con HGF, después de lo cual viven la migración celular se examinó midiendo la longitud total de la ruta de migración de las células en un período de 2 hr. En ausencia de HGF, se detectaron longitudes de trayectoria migratorias comparables para ASPC-1 MetKD y las células NT (NT: 87,2 micras +/- 12,0; MetKD-2: 112,1 micras +/- 12,3; MetKD-5: 76,5 micras +/- 7.0) (Figura 2D). El tratamiento con HGF aumentó la longitud de la trayectoria de las células APSC-1 NT (216,7 micras +/- 13.1), en correlación con el aumento de velocidad de la célula (datos no mostrados). Por el contrario, el tratamiento de HGF MetKD-2 y MetKD-5 células no dio como resultado un aumento de la longitud de la trayectoria (Película S1, S2 de la película, la película S3). En consecuencia, se reunió desmontables resultados en la disminución de la ASPC-1 sobre la migración de células de colágeno I.
El suero empobrecido, confluentes NT o MetKD BxPC-3 (A) o ASPC-1 células (B) fueron heridos con un rasguño, seis regiones marcadas, y la imagen de inmediato (0 h) antes del tratamiento con HGF. regiones idénticas a lo largo del cero se obtuvieron imágenes después de 3, 9, 18, y 24 horas, y los valores se normalizaron con el tamaño inicial de la cero a 0 h. La migración celular se expresa como el cierre% de diferencia en cada punto de tiempo (*** p & lt; 0,001; ANOVA, n = 3). MetKD reduce BxPC-3 invasión celular en respuesta a HGF en relación con las células de control (C). Los valores representan las veces el cambio en el número de células /campo y se presentan como la media +/- SEM (*** p & lt; 0,001; ANOVA, n = 3). imágenes de células vivas de ASPC-1 en las células MetKD chapada en colágeno I-revestido de vidrio de fondo placas de cultivo celular muestran disminución de la migración celular en respuesta a 100 ng /ml de HGF (D). Las imágenes se recogieron cada 2 min durante un total de 120 min y los datos se expresa como la longitud de la trayectoria media +/- SEM por condición (*** p & lt; 0,001; ANOVA, n & gt; 30 células).
Met Derribo deteriora
in vivo
crecimiento tumoral
Hemos tratado de examinar las consecuencias de la interrupción se reunió el crecimiento del tumor
in vivo
, utilizando un modelo de ratón ortotópico de cáncer de páncreas . Dado que las especies cruzadas diferencias en la interacción de HGF murino con Met humano ha sido reportado [31], que utilizó por primera análisis Western para confirmar la activación de Met humano murino por HGF en células ASPC-1 BxPC-3 y. Usando las condiciones que dan lugar a la fosforilación de Met máxima por HGF humano, se muestra que Met humano fue activado por el ligando murino y humano utilizando anticuerpos sitio de fosfo-tirosina específicos anti-Met y análisis Western (Figura 3A & amp; 3B). En estas condiciones HGF humano era 3-5 veces más eficaz que murino HGF en la inducción de la fosforilación de Met, consistente con informes anteriores que murino HGF es funcionalmente activa hacia el receptor humano
aunque
con una afinidad más baja [32], [ ,,,0],33].
El análisis de Western confirmó que murino (mHGF) y HGF humano (HGF-h) activar Met humano en BxPC-3 (a) y ASPC-1 (B) líneas celulares NT. No activación de Met se observó en ausencia de ligando. Los valores se expresan como media densidad relativa de pMET /Met +/- SEM (** p & lt; 0,01 *** p & lt; 0,001; ANOVA, dos experimentos separados). El tamaño del tumor se midió cada 10 días utilizando
in vivo
bioluminiscente de imágenes para BxPC-3 (C) o ASPC-1 células (D) después de la inyección y se presentan como tamaño tumoral medio en fotones /s /cm
2 (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01; ANOVA). imágenes bioluminiscentes representativos se muestran inmediatamente antes de la necropsia a los 30 días (BxPC-3) o 45 días (ASPC-1). El peso y la incidencia global (%) de BxPC-3 tumores primarios (E) y la ASPC-1 (F) se enumeran los tumores primarios y metastásicos. caída estable de Met mRNA en BxPC-3 (G) y ASPC-1 (H) MetKD xenoinjertos se confirmó usando QRT-PCR. Los datos se normalizaron a GAPDH y se presentan en relación con el respectivo control de NT (** & lt; P0.01; *** p & lt; 0,001; ANOVA, n = 2).
Para examinar el efecto de Met caída en el crecimiento PDAC, se utilizó BxPC-3 y ASPC-1 en las células pre-marcadas con luciferasa de luciérnaga para seguir la carga tumoral no invasiva [26]. Igual número de MetKD y control de las células NT fueron inyectados en el cuerpo del páncreas de ratones desnudos atímicos y la carga tumoral cuantificarán mediante
in vivo
bioluminiscencia [26]. el crecimiento del tumor fuerte se detectó en los ratones inyectados con células de control que expresan el NT shRNA (Figura 3C & amp; 3D). Por el contrario, la incidencia de tumores y la carga se redujo significativamente en los ratones inyectados con células MetKD BxPC-3 o ASPC-1. En la necropsia (40 y 45 días para BxPC-3 y ASPC-1 inyectaron ratones, respectivamente), los tumores pequeños masas se detectaron fácilmente en los páncreas inyectados con células BxPC-3 MetKD-2, pero no con MetKD-5 células BxPC-3 (Figura 3C y 3E). Esto no se debió a problemas con la diseminación de tumores, como campos de tumores pequeños se detectaron fácilmente al microscopio en H & amp; E manchadas secciones de tumores MetKD consistente con los datos de bioluminiscencia (información de apoyo S2). En los ratones inyectados con células ASPC-1, las células MetKD muestran una reducción de tamaño del tumor primario en el modelo ortotópico en comparación con los ratones inyectados con células NT (Figura 3D), se correlaciona con menor incidencia de local (hígado) y distante (pulmón) la metástasis tumoral (Figura 3F). QRT-PCR confirmó reduce los niveles de ARNm de Met en tumores MetKD en comparación con los tumores NT (Figura 3G & amp; 3H). Por lo tanto, la pérdida de Met señalización en BxPC-3 y células ASPC-1 que dañen la carga tumoral
en Bligoo.
Met señalización remodela la vasculatura tumoral
ortotópico ASPC-1 tumores in vivo se retiraron y se procesaron para análisis adicional. Inmunoprecipitación y análisis de Western de Met humano en los tumores ortotópico confirmaron la activación de Met humano murino por HGF
in vivo gratis (Figura 4A), consistente con nuestros estudios anteriores que muestran la activación de Met humano por HGF recombinante de ratón (Consulte la figura 3A & amp; 3B). Como se ha detectado que se esperan menores niveles de fosfo-Met en los tumores Met KD relación con xenoinjertos NT (Figura 4A). Curiosamente, los tumores producidos por las células ASPC-1 MetKD contenían rutinariamente regiones extensas de necrosis central (Figura 4B) en comparación con los tumores más grandes que resultan de células ASPC-1 NT. Cuantificación detecta un aumento de 5 veces en áreas de necrosis en los tumores más pequeños derivados de MetKD-2 y MetKD-5 células en comparación con los tumores de control NT (Figura 4B). El aumento de la necrosis del tumor observado en MetKD ASPC-1 xenoinjertos podría ser debido a un rápido crecimiento del tumor que excede la vasculatura del tumor, aumento de la apoptosis de las células tumorales o disminución de la angiogénesis tumoral. Para distinguir entre estas posibilidades, hemos manchado las secciones del tumor ASPC-1 MetKD y NT para Ki67 o exfoliados caspasa-3 para evaluar el nivel de la proliferación celular y la apoptosis, respectivamente. El análisis morfométrico de la tinción de Ki67 de tumores secciones resultantes de células MetKD reveló un menor número de células Ki67 positivas por campo en comparación con los tumores NT (Figura 4C). secciones de tumor de examen por exfoliados caspasa-3 tinción reveló un mayor número de caspasa-3 células positivas escindidos en los tumores MetKD relativos a los tumores NT (Figura 4D), lo que indica que la pérdida de la señalización de Met podría resultar en una mayor susceptibilidad a la apoptosis. El aumento de la apoptosis y la necrosis observado en tumores MetKD se podrían atribuir a la disminución de la angiogénesis tumoral. Para probar esto, se determinó la densidad de los vasos media (MVD) en NT y MetKD-tumores por tinción inmunohistoquímica utilizando anticuerpos contra CD31, un marcador de las células endoteliales [28]. De acuerdo con nuestros datos que muestran el aumento necrosis en MetKD-2 y MetKD-5 tumores, MVD se redujo significativamente en la periferia de los tumores en comparación con los xenoinjertos MetKD pancreáticas derivadas de NT (Figura 4E). No se detectó señal dentro de la masa central de los tejidos de xenoinjerto, en consonancia con los informes en los modelos humanos y de ratón de cáncer de páncreas [34]. Por lo tanto la pérdida de Met señalización en las células ASPC-1 reduce la carga tumoral en un modelo ortotópico de ratón, probablemente como resultado de la disminución de la supervivencia celular y la angiogénesis tumoral.
inmunoprecipitación y análisis de Western detectado fuerte Met fosforilada (PMET) en NT tumores relativos a bajos niveles en los tumores PMET MetKD (a). Las secciones seriadas de tumores incluidas en parafina fueron bien H & amp; E manchadas (B) o transformados para Ki67 (C), activa la caspasa-3 (D) y las secciones congeladas para CD31 (E) tinción. Análisis morfométrico indica un aumento significativo en la necrosis y se escindió la tinción de caspasa-3 con una disminución correspondiente en Ki67 y CD31 tinción por campo de alta potencia (HPF) en tumores MetKD relativa a los tumores NT (** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001 ; ANOVA). se muestran imágenes representativas de campo.
Met señalización promueve la secreción de factores angiogénicos
de señalización
Met se ha demostrado para promover la remodelación de la vasculatura tumoral en tumores de mama y de útero a través de la regulación al alza de VEGF y la regulación hacia abajo de la trombospondina-1 (TSP-1) [35]. VEGF es un potente agonista de la angiogénesis que activa tanto de la proliferación de células endoteliales y la migración. En oposición, TSP-1 suprime la angiogénesis mediante la inhibición de proliferación de células endoteliales y la inducción de apoptosis de células endoteliales.