Extracto
La cabeza y el cuello carcinoma de células escamosas del transcriptoma (CECC) se ha perfilado ampliamente, sin embargo, la identificación de biomarcadores que son clínicamente relevante y por lo tanto con el beneficio de la traducción, ha sido un reto importante. El objetivo de este estudio fue utilizar un enfoque basado en el análisis de meta para catalogar biomarcadores candidatos con alto potencial para la aplicación clínica en el CECC. Los datos de la serie de microarrays a disposición del público (N = 20) perfilado utilizando Agilent (4X44K G4112F) y Affymetrix (HGU133A, U133A_2, U133Plus 2) plataformas se descargó y analizó en un chip específico manera /plataforma (GeneSpring v12.5 software, Agilent, ESTADOS UNIDOS). Director de análisis Análisis de Componentes (PCA) y la agrupación se llevó a cabo de manera iterativa para separar los valores extremos; 140 muestras normales y tumorales de 277 series 15 se incluyeron en el análisis final. Los análisis identificaron 181 genes expresados diferencialmente, concordantes y estadísticamente significativas; El análisis reveló interacciones entre CADENA 122 de ellos, con dos grandes grupos de genes conectados por múltiples nodos (MYC, FOS y hspa4). La validación de la base de datos-CECC específica (N = 528) en el Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) identificó un panel (
ECT2
,
ANO1
,
TP63
,
FADD
,
EXT1
,
NCBP2
) que fue alterado en el 30% de las muestras. Validación en el tratamiento ingenuo (Grupo I; N = 12) y el tratamiento posterior (Grupo II; N = 12) de los pacientes identificaron 8 genes asociados significativamente con la enfermedad (área bajo la curva & gt; 0,6). Correlación con recurrencia /re-recurrencia mostró
ANO1
Had más alta eficacia (sensibilidad: 0,8, especificidad: 0,6) para predecir el fallo en el Grupo I.
UBE2V2
,
PLAC8
,
FADD
y
TTK
mostró una alta sensibilidad (1,00) en el grupo I, mientras que
UBE2V2
y
CRYM
fueron altamente sensibles (& gt; 0,8) en la predicción re-recurrencia en el grupo II. Además, el análisis mostró que TCGA
ANO1
y
FADD
, localizado en 11q13, fueron co-expresada a nivel de transcripción y significativamente asociados con la supervivencia global y libre de enfermedad (
p
& lt; 0,05). El enfoque meta-análisis adoptado en este estudio se han identificado marcadores candidatos correlacionado con el resultado de la enfermedad en los CECC; una mayor validación en una cohorte más grande de pacientes va a establecer su relevancia clínica
Visto:. Reddy RB, Bhat AR, James BL, SV Govindan, Mathew R, R DR, et al. (2016) Los meta-análisis de datos de microarrays Identifica
ANO1
y
FADD
como marcadores de pronóstico de cáncer de cabeza y cuello. PLoS ONE 11 (1): e0147409. doi: 10.1371 /journal.pone.0147409
Editor: Muy-Teck Teh, Universidad Queen Mary de Londres, Reino Unido
Recibido: 8 de Octubre, 2015; Aceptado: 4 Enero de 2016; Publicado: 25 Enero 2016
Derechos de Autor © 2016 Reddy et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo a sus archivos de información de papel y
Financiación:. el proyecto fue financiado por el Consejo indio de Investigación médica, la India (No: 5/8 /10-18 (Oto) /PPC /11-ENT -1). (Http://www.icmr.nic.in/). Tal como se recibieron los fondos. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Dos de los autores están afiliados a la empresa comercial Strand Life Sciences. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Las características moleculares de los tumores, incluidos los de cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas (CECC), se ha empleado para comprender los mecanismos de la carcinogénesis, así como las razones subyacentes de la resistencia al tratamiento. El aumento de la incidencia global de la CECC, junto con la falta de mejoras significativas en la tasa de supervivencia global durante las últimas cuatro décadas, requieren nuevos enfoques para comprender los mecanismos moleculares de la enfermedad y para identificar posibles marcadores para la detección precoz, el pronóstico y como objetivos para la terapia. El perfil molecular en combinación con la validación paciente en los cánceres de próstata, ovario y de mama ha conducido a la aplicación clínica de los paneles de marcadores, tales como impresión y Mamma Oncotype Dx. [1, 2]. Intentos similares para establecer marcadores moleculares de diagnóstico o pronóstico en CECC para la aplicación clínica han sido difícil de alcanzar.
Alto rendimiento de perfiles moleculares utilizando técnicas que catalogan las diferencias en todo el genoma, transcriptoma [3] [4] [5] y proteoma [6] niveles se han llevado a cabo en el CECC. Estos estudios han catalogado los marcadores de la progresión [7] [8] y la respuesta al tratamiento [9]. Sin embargo, la traducción de estos marcadores para el beneficio clínico no se ha logrado debido a los desafíos asociados con las técnicas de alto rendimiento en términos de selección de marcadores y la necesidad de la validación del paciente a gran escala. Estos retos se confunden aún más debido a problemas tales como la discordancia significativa entre los diferentes estudios de alto rendimiento, atribuido a diferencias en el procesamiento de la muestra, tipo de plataformas utilizadas y los algoritmos de análisis aplicado [10] [11]. Este problema se ve aumentada aún más en los estudios de transcriptómica principalmente debido a cambios en el nivel de transcripción pueden variar en función de la etapa, específica de tejido y las fluctuaciones espaciales en la expresión de varios genes.
estrategias analíticas que pueden utilizar las bases de datos existentes e identificar marcadores concordantes entre los estudios puede ser un enfoque beneficioso para reducir el número de marcadores de aumento de la confianza y la aplicabilidad clínica. Meta-análisis, en referencia al análisis de conjuntos de datos disponibles públicamente, podría por lo tanto, potencialmente permitir la identificación de la piscina clínicamente relevante de los marcadores; muchos de tales estudios han sido reportados en cánceres de diferentes sitios. enfoques basados en los meta-análisis en el cáncer de páncreas han conducido a la identificación de nuevas dianas y biomarcadores candidatos [12]. En los cánceres de próstata, marcadores causal con el proceso carcinogénico se identificaron utilizando un enfoque similar [13]. Además, los marcadores altamente relacionadas con el pronóstico y el tratamiento predicción de resultados en el cáncer de mama [14] [15] fueron también identificados a través de enfoques basados en los meta-análisis similar. El objetivo principal de este estudio fue realizar una multi-plataforma, de un estudio cruzado meta-análisis de microarrays de datos públicamente disponibles en cáncer de cabeza y cuello, identificar marcadores de relevancia biológica a través de una tubería común de análisis y, posteriormente, validarlos en muestras clínicas.
Materiales y Métodos
criterios de búsqueda y minería de datos
el análisis de los microarrays de datos públicamente disponibles se llevó a cabo de acuerdo con las directrices PRISMA [16]. Las bases de datos públicas, Gene Expression Omnibus (GEO) (NCBI-http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) y la Matriz Express (EBI) [http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress ] se buscaron la presencia de datos en bruto de los experimentos de microarrays llevadas a cabo en el cáncer de cabeza y cuello. La serie seleccionada para el análisis incluyó datos de i) los estudios realizados en pacientes con carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello ii) los estudios que incluyeron pacientes sin tratamiento previo y estudios iii) la realización mundial de perfiles de transcriptómica utilizando matrices de alta densidad. Estudios /muestras incluyendo tiroides, orofaringe y nasofaringe fueron excluidos del estudio debido a sus diversas etiologías. Las dos plataformas incluidas en el análisis fueron Affymetrix [Affymetrix Inc., California, EE.UU.] y Agilent [Agilent Technologies, California, EE.UU.]. La serie de datos en bruto perfilada por las plataformas se agruparon basa en la tecnología individual y cada tecnología (de cualquier plataforma) se incluyó en el análisis si la serie al menos 2 estaban disponibles en la base de datos. El flujo de trabajo general siguió el protocolo sugerido por etapas Ramasamy
et al
para llevar a cabo meta-análisis [17]. El algoritmo básico de trabajo se detalla en la figura 1.
Los datos de microarrays en bruto públicamente disponibles de serie del cuello carcinoma de células escamosas (HNSCC) de cabeza y se descargaron y se agruparon y se analizaron en el paquete estadístico Genespring. La normalización se llevó a cabo en las muestras, que a continuación se agruparon en tumor y normal antes de realizar el experimento de nivel de genes. Análisis de Componentes Principales (PCA) se realizó para eliminar las muestras discordantes. Doble cambio y
p
valor se calcularon para obtener las entidades de genes significativos. Estas entidades estadísticamente significativas se utilizaron para el análisis adicional; anotaciones de base de datos (ontología de genes, cuerda y miRWALK) y la validación del paciente (validación experimental cuantitativa por PCR en tiempo real (qPCR) y Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA)).
Análisis de datos mediante génica primavera
los archivos de datos brutos utilizados para los análisis incluyeron CEL (plataforma Affymetrix) y .txt (Agilent). El meta-análisis se llevó a cabo utilizando el software de primavera Gen (http://genespring-support.com) [v12.5, Agilent, California, EE.UU.]. Los datos brutos correspondientes a cada chip se cargan en el programa informático en el que las muestras se transformaron línea de base y normalizado por el Análisis multi-array (RMA) de Affymetrix o 75
percentil en plataformas Agilent (un solo color). Los archivos de muestra individuales se clasifican en "normal" y "tumor" y volver a analizarse como un solo experimento. se generó a nivel de genes de datos experimentales (media aritmética de todas las sondas de mapeo para el mismo ID de sonda) y el control de calidad se llevó a cabo usando el Análisis de Componentes Principales (PCA) en GeneSpring. Las muestras que fueron valores atípicos en las parcelas de PCA se retiraron y la agrupación llevaron a cabo posteriormente para garantizar una clara estratificación entre los dos tipos de muestras (normales y tumorales). El proceso se llevó a cabo con múltiples iteraciones para obtener una separación refinado. Doblar el análisis del cambio se ejecuta entonces en las muestras después de lo cual no apareado
t-test
(varianza desigual) se llevó a cabo para obtener entidades genes importantes. El
p-valor
cómputo (asintótica) y múltiples pruebas de corrección (Benjamini Hochberg FDR) se realizaron para obtener más entidades de genes con
p-valor
& lt; 0,05 y doble cambio (FC) de & gt; 2.0. análisis de la vía intrínseca se llevó a cabo utilizando la lista de genes identificados. La lista de genes importantes y las vías a través de las diferentes tecnologías de Affymetrix se compararon utilizando los nombres de símbolo de genes /vía como un identificador. La lista entidad gen individual de cada tecnología se extrajeron de software Genespring y se exportan a los archivos de Excel. Las entidades de genes concordantes, así como vías comunes fueron identificados a través de las tecnologías mediante el uso de Microsoft Access (Microsoft Inc. WA, EE.UU.). Se adoptó enfoque similar para identificar todos los genes y las vías comunes a través de las dos plataformas de Affymetrix y Agilent (figura 1).
anotación funcional con el uso de recursos Web Múltiples
La lista de genes concordantes en los diferentes plataformas se analizó en los diferentes recursos web para evaluar las clases funcionales, las interacciones proteína-proteína y miRNAs dirigidas a los genes. Gen ontología análisis se realizó utilizando (Anotación de proteínas a través de la relación evolutiva) PANTHER sistema de clasificación (http://www.pantherdb.org/) [18] para evaluar las clases funcionales de los genes. se utilizó [19] para predecir y catalogar las interacciones proteína-proteína entre los genes concordantes: la base de datos STRING (CADENA v9.1) (//string-db.orgnewstring_cgi http). El miRNAs que se dirigen a estos genes fueron investigados utilizando la base de datos miRWalk2.0 (http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/index.html) [20].
Paciente basado Validación
la lista de genes concordantes también fue a comparación cruzada con la base de datos TCGA (http://www.cbioportal.org) [21] para su mutación, variación del número de copia (CNV) y el estado de la expresión del ARNm. El panel de genes importantes identificados también se evaluó por sus datos de co-expresión, global y la supervivencia libre de enfermedad en correlación con sus patrones de expresión en los estudios de cáncer TCGA (cabeza y el carcinoma de células del cuello escamoso, provisional; N = 528 muestras)
La validación de genes seleccionados también se llevó a cabo en pacientes HNSCC utilizando PCR cuantitativa en tiempo real. El estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional Narayana Hrudayalaya Hospitales [NH /IRB-CL-2012-058]. muestras quirúrgicas de los pacientes fueron seleccionados de la bio depositario de la Cabeza y Cuello departamento de Oncología, Mazumdar Shaw Medical Center, Bangalore. Todas las muestras se recogieron tras el consentimiento informado por escrito. Pacientes no tratados previamente y recurrentes diagnosticados con CECC de todos los sitios (con exclusión de la tiroides, orofaringe y nasofaringe) y las etapas durante el período de marzo de 2010 hasta 2014, con datos de seguimiento, fueron incluidos en el estudio. Las muestras de tejido normal se obtuvieron de voluntarios sanos durante la extracción dental tras el consentimiento informado por escrito. Los datos demográficos, clínicos y patológicos de los pacientes se obtuvieron de los registros médicos electrónicos y los pacientes fueron seguidos durante un período de 2 años.
Los pacientes se clasificaron en función de sus virus del papiloma humano (VPH) condición identificado por inmunohistoquímica p16 usando protocolos establecidos. embebidos en parafina secciones fijas con formalina de los pacientes se obtuvieron de la departamento de patología en el centro. Brevemente, las secciones del tumor (5 micras) se de-paraffinised y se trataron con peróxido de hidrógeno al 3% para detener la actividad de la peroxidasa endógena. Las secciones se incubaron con el anticuerpo primario (anti-p16, BioGenex, Fremont, CA, EE.UU.) y posterior detección se llevó a cabo usando el sistema de peroxidasa de rábano picante (HRP) según las instrucciones del fabricante (Dako real
™ EnVision
Sistema de Detección ™, Dinamarca). Secciones procesan de manera similar pero sin el anticuerpo primario se tomaron como controles negativos. La puntuación de los portaobjetos teñidos era como por los estudios establecidos [22]. Las diapositivas fueron evaluados mediante microscopía de luz y puntuaron en una escala de 0-3 teniendo en cuenta el porcentaje de positividad y la intensidad de la tinción; 0 (ausencia completa de la tinción de tumor), 1 (débil tinción de las células tumorales), 2 (& lt; 50% de células tumorales teñidas con intensidad moderada) y 3 (& gt; tinción tumor 50% con tinción intensa /moderada)
.
marcador de perfiles para la validación cuantitativa por PCR en tiempo real (qPCR)
se extrajo ARN de las muestras, archivado en el ARN Más tarde (Ambion, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE.UU.), utilizando el reactivo Trizol (Sigma Aldrich , MO, EE.UU.) y se trató con DNasa (Fermentas, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE.UU.) y se evaluó la contaminación por Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La integridad y la calidad del ARN se determinó mediante electroforesis en gel y la relación de 260/280. 1 g de RNA (260/280: 1,8 a 2,0) se convirtió en ADN complementario por el kit High Capacity ADNc de conversión (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los marcadores seleccionados fueron perfilados usando cebadores específicos enumerados en la Tabla S1 y se evaluaron todos los cebadores para la especificidad usando básica herramienta de alineación de búsqueda local (BLAST) Análisis (Centro Nacional de Información Biológica, NLM, Estados Unidos). La eficiencia qPCR se evaluó mediante la pendiente del modelo de regresión lineal según protocolos estándar. El PP se midió a través de múltiples diluciones seriadas de cada ADNc para obtener la curva estándar y la pendiente correspondiente. El rendimiento se calcula utilizando la fórmula, Eficiencia = 10
(- 1 /pendiente). Todo el tiempo real las reacciones de PCR se realizaron por triplicado utilizando el 480 sistema de Roche Light Cycler PCR en tiempo real (Roche Diagnostics, Alemania) o el ABI Primer Paso Tiempo real de la máquina (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) utilizando el Kapa SYBR Green PCR Master Mix ( Kapa Biosystems, MA, EE.UU.). Las condiciones de ciclado térmico fueron 50 ° C durante 2 min seguido de una etapa inicial de desnaturalización a 95 ° C durante 10 min, 45 ciclos a 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado para cada punto de datos. El punto de cruce (Cp) y el posterior análisis se llevó a cabo utilizando el segundo método max derivado en el software (Roche Diagnostics, Basel, Suiza). Todas las reacciones se confirmaron por su especificidad por la fusión de análisis de la curva de la muestra y el control sin diana (NTC). Un conjunto (N = 4) de los genes de referencia [(gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (
GAPDH
), 60S ácida proteína ribosomal P0 (
RPLP0
), 18S ribosomal ácido ribonucleico (
18SRNA
) y β-glucuronidasa (
GUS
)] fueron evaluados utilizando la RefFinder [23] en un subgrupo de la cohorte de pacientes (N = 26) y dos de los mejores genes de referencia (CCAA) fueron seleccionados para su posterior análisis. se evaluó el cambio relativo en la expresión utilizando la media geométrica de los genes de referencia seleccionados [24]. la expresión en las muestras normales sirvió como el calibrador.
Métodos estadísticos
el análisis estadístico se realizó mediante STATA11.1 (College Station, TX, EE.UU.). receptor análisis característico (ROC) curva de funcionamiento, se utilizó para evaluar el poder predictivo de cada uno de los biomarcadores, el punto de corte óptimo que produjo la máxima sensibilidad y la especificidad del determinado para cada biomarcador. curvas ROC fueron luego trazan sobre la base del conjunto de valores de sensibilidad y especificidad óptimas. Área bajo la curva (AUC) se calculó mediante la integración numérica de las curvas ROC. El biomarcador que tiene el área más grande bajo la curva ROC fue identificado como que tiene la asociación más fuerte con la presencia de tumor de cabeza y cuello. La sensibilidad y la especificidad de la asociación de los marcadores con recurrencia /re-recurrencia se analizó usando la calculadora clínica (http://vassarstats.net/clin1.html~~number=plural).
Resultados
Data Mining
sobre la base de los criterios de búsqueda, minería de datos de las diferentes bases de datos identificaron un total de 42 series [plataforma Affymetrix: N = 32, Agilent: N = 10]. Después de una filtración adicional de los datos basados en los criterios de inclusión y exclusión, 18 series de Affymetrix y dos de Agilent fueron incluidos en el estudio (Tabla 1). La tecnología y chips que eran incompatibles con el gasoducto analítica y en la que sólo una serie estaba disponible fueron excluidos del estudio. El número total de muestras analizadas fueron 667 y 271 tumores normal. La plataforma Affymetrix incluyó un total de 246 normal y 629 tumores (U133 Plus 2.0: N = 207, T = 419; chip de U133A: N = 19, T = 147; U133A_2: N = 20, T = 63) mientras que la plataforma Agilent (4X44K G4112F) incluyó 25 normal (N) y 38 tumor (T). Los sub sitios investigados en las series seleccionadas fueron mucosa bucal, la lengua, la laringe, la faringe y alvéolos y trígono retro-molar. Las muestras fueron normales desde el sitio gingivobucal en toda la serie. La serie de cada chip dentro de cada plataforma se analizaron por separado usando un software de análisis de genes y la primavera como por la tubería de análisis para identificar los genes concordantes listas de entidades.
Análisis a través de una única plataforma.
en la plataforma Affymetrix, se analizaron 18 series, que incluyó estudios realizados sobre U133 plus 2 (N = 13), U133 A_2 (N = 2) y U133A (N = 4) fichas; en una de las series, los datos se analizaron mediante dos chips diferentes (Tabla 1). Cinco series de U133 más 2 fueron excluidos ya que las muestras eran valores atípicos durante la PCA y la agrupación; un total de 373 muestras se incluyeron en el análisis final (N = 122, T = 251). Se utilizó 0,05 para su posterior análisis; la lista de genes estadísticamente significativa con un FC & gt; 2,0 y un
p-valor de
& lt. Se identificaron un total de 12.079 genes después de los análisis de U133 más 2,0, mientras que 4134 se identificaron a partir U133A y 3438 genes de genes de U133A_2. análisis de acceso Microsoft a través de estas listas de genes reveló una lista de 965 entidades de genes de los cuales 64.46% (N = 622) entidades son concordantes en todos los 3 chips (585 hasta reguladas y 37 hacia abajo regulado) (S1A de archivos) y 35.54% (N = 343 ) de los genes mostraron tendencias coincidentes de regulación. Del mismo modo, una evaluación de la concordancia y discordancia en la regulación llevada a cabo a través de las tecnologías mostró diferentes tendencias (U133 Plus 2 Vs U133A Concordancia = 76,53%; U133 Plus 2 Vs U133A_2 Concordancia = 58,27%; U133A Vs U133A_2 Concordancia = 86,11%).
las vías comunes a través de las tecnologías fueron identificados por comparación de sus listas individuales de la vía. A continuación, se ordena la lista de (N = 54) en función del porcentaje de entidades que coinciden con respecto al número total de entidades de la vía. Veintiún vías se identificaron con un 30% o más entidades compensadas de todas las 3 tecnologías, entre las que la mayoría de ellos están relacionados con las vías del ciclo celular (S1B archivo).
En la plataforma (G4112F 4x44k) de Agilent, 2 serie, de la que un total de 44 muestras (N = 18, T = 26) fueron incluidos en el análisis final se identificaron un total de 8493 genes (arriba y abajo regulado) a partir del análisis (FC & gt; 2,0;
p
& lt; 0,05); 338 de ellas es altamente significativa (
p Hotel & lt; 0,001), con diferencias de cambio alta de plegado (FC & gt; 25 veces). La aplicación de un punto de corte de 50% de entidades que coinciden desde el número total de entidades, se identificaron 43 vías. Las vías más significativas (& gt; 65% de entidades que coinciden) identificados fueron la respuesta inflamatoria y la organización de la matriz extracelular (ECM) (S1C y S1D Archivo) Análisis
Multiplataforma
La lista.. de los genes identificados conjuntamente entre las dos plataformas reveló un total de 402 genes (
p Hotel & lt; 0,05 y FC & gt; 2,0) de los cuales 181 (45.03%; 13 abajo reguladas y 168 hasta regulado) fueron concordantes y 221 (54.97%) discordante en la tendencia de la regulación. La lista concordantes de 181 genes que se proporciona en el archivo S2A. análisis de la ontología de genes lleva a cabo para esta lista de genes en la base de datos PANTHER para la clasificación de los genes, indicó que en las funciones moleculares, la categoría de unión (GO: 0005488) demostraron máxima representación (28,5%; n = 49) con la proteína y nucleico ácido moléculas que son los componentes principales de unión. Del mismo modo, en los procesos biológicos, el celular (GO: 0009987; 20,10%; N = 75) y el proceso metabólico (GO: 0008152; 18,8%; n = 70) eran una mayoría. 24,40% de los componentes celulares eran partes de la célula (GO: 0043226) y regiones extracelulares (GO: 0005576). La mayoría de las clases de proteínas identificadas fueron los transportadores (PC00227) (9,30%; N = 21) y los receptores (PC00197) (8,40%; N = 8) (Figura S1 A)
Las vías comunes (n. = 16) fueron identificados a través de las dos plataformas de acceso con MS. Las vías más importantes identificados fueron los asociados con el comportamiento del citoesqueleto, la biosíntesis de colesterol y el transporte IGF (& gt; 70% entidades que coinciden través de las plataformas). Oncostatina M y la señalización de adhesión focal fueron las otras vías importantes que se dysregulated (& gt; 25% entidades que coinciden a través de las plataformas). (S2 B) guía de archivos
Base de datos STRING análisis identificó una red de interacciones entre los 122 genes de la lista concordante . La red de interacción más grande consistía en dos grandes grupos interconectados con FBJ murino Osteosarcoma Viral Oncogene Homólogo (FOS), fibronectina 1 (FN1), quinasa dependiente de ciclina 1 (CDK1), proteína de choque térmico 70 kDa 4 (hspa4) y V-Myc aviar mielocitomatosis (MYC) siendo los nodos de conexión (Fig 2). La lista concordante cuando se analizaron además para identificar los genes diana validada experimentalmente para la expresión de los genes miARN de la base de datos miRWalk2.0, dos grandes familias de genes miARN [
vamos gratis (N = 17) y
mir gratis ( N = 47)] fueron identificados, que dirige más de 5 genes de la lista (archivo S3).
Análisis de la interacción proteína-proteína mediante red de cuerdas identificó dos grupos principales de interconexión con interacciones de alto grado entre los genes ( N = 122). Estas 2 grandes grupos estaban vinculados entre sí por los nodos MYC, FN1, FOS y hspa4. El número de líneas representan los niveles de evidencia como se indica en la leyenda de colores. Los diferentes tamaños de nodo se basan en la medida de información estructural de proteínas disponible para cada gen, mientras que los colores de la nodo son una ayuda visual utilizado para una mejor representación. Los marcadores de este análisis seleccionados para la validación del paciente están rodeados.
TCGA base de datos y validación experimental de los genes en pacientes HNSCC
La lista de 181 genes fue cruzada en comparación con la base de datos TCGA ( http://www.cbioportal.org) para evaluar la mutación, número de copias y la expresión de ARNm de estado en la cohorte de cabeza y cuello (N = 300). Un total de 59 genes fueron alterados en al menos el 10% de los pacientes, mientras que un sub-conjunto de genes [6 (La transformación de células epiteliales de genes 2 (
ECT2)
, Anoctamin 1
(ANO1)
tumoral La proteína p63
(TP63)
, Fas -asociado Via dominio de muerte
(FADD)
, Exostosin-1
(EXT1)
y Cap Nuclear Binding Protein Subunidad 2
(NCBP2
)] fueron alterados en al menos el 30% de las muestras en los niveles de mutación /CNV y de ARNm (S3 archivos y S1B FIG). los 20 genes basados en las alteraciones porcentuales en TCGA se enumeran en Tabla 2.
validación experimental utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) se llevó a cabo en un total de 34 muestras, como tumores no tratados primarios (Grupo I; N = 12), las muestras recurrentes (Grupo II; . N = 12) y controles normales sanos (N = 10) de la mayoría de las muestras en la cohorte de pacientes (N = 24) eran de sexo masculino (75%; N = 18) y desde el sitio sub cavidad oral (83,3%; N = 20) con cánceres avanzados en estadio IV (62,5%;. N = 15) la mayoría de los pacientes eran mayores de 40 años (95,8%; N = 23) y el 79,2% eran fumadores, consumidores de alcohol o masticadores (N = 19). Los pacientes de la cohorte primaria o bien la radiación se sometieron después de la cirugía o no tenían tratamiento adyuvante. Cinco de estos pacientes desarrollaron recurrencia durante el seguimiento, mientras que tres estaban libres de enfermedad (Cuatro pacientes se perdieron durante el seguimiento) (Tabla S2). En la cohorte recurrente, los pacientes fueron sometidos a quimioterapia y radiación antes del tratamiento quirúrgico
Los genes para la validación fueron seleccionados de la lista de 181 genes en base a varios criterios.; las reguladas más de 5 veces en 2 tecnologías [Placenta-Específica 8 (
PLAC8
) y Crystallin, Mu (
CRYM
)], los nodos dentro de la base de datos String (
FOS
,
enzima TTK
, conjugación a ubiquitina E2 variante 2 (
UBE2V2)
y proteína centrosomales 55 kDa (
CEP55
)] y el subconjunto de genes con alteraciones en al menos el 30% de los pacientes (mutación, la CNV y expresión) (
ECT2
,
ANO1
,
FADD
) en la base de datos del TCGA. Todos los cebadores, cuando se validó mostraron una eficiencia que van desde 1,9 a 2,1 con la eficiencia porcentaje de un 93% a 110% (Fig S2). el análisis por RefFinder indicó que entre los genes de referencia evaluados,
RPLP0
y
18SRNA
fueron evaluados como los más estables ( media geométrica de los valores mejores resultados:
RPLP0
: 1,19,
18SRNA
: 1,41,
GAPDH
: 3,0 y
GUS
: 4,00) tras el análisis de múltiples software (Delta CT, geNorm, NormFinder y BestKeeper) (S3 Fig). validación qPCR de los genes seleccionados (N = 9) y luego se llevó a cabo utilizando el método de cuantificación relativa utilizando la media geométrica de los dos genes de referencia.
los marcadores mostraron tendencias regulatorias, tanto en los grupos similares a los obtenidos en el meta-análisis (figura 3A-3D). Seis de los genes mostraron validación más de 70% en las muestras evaluadas;
PLAC8 gratis (91,67),
UBE2V2 gratis (87,5%),
ECT2 gratis (72,2%),
FADD gratis (69,5%),
CEP55 gratis (69,5%) y
TTK gratis (76,2%). Evaluación del estado de validación en las dos cohortes indicó que si bien todos los genes fueron validados por encima del 60% en el grupo I, sólo 4 genes mostraron una validación similar en el grupo II (
PLAC8
,
CRYM
,
ECT2
y
UBE2V2
). ROC análisis de los marcadores en la cohorte 1 indicó que
PLAC8 gratis (AUC: 0,89),
FOS
(AUC 0,82),
ANO1 gratis (AUC: 0,81) y
UBE2V2
(AUC: 0,82) tenía la mayor asociación con la enfermedad (Fig 3E-3H)
Quantitative perfiles de expresión génica de los marcadores seleccionados se llevó a cabo en el Grupo I (primaria; a). y el Grupo II (recurrente; B) cohorte.
PLAC8
y
UBE2V2
fueron validados en todas las muestras (100%) del Grupo I con respecto a las tendencias de regulación, mientras que otros genes mostraron tendencia similar en & gt; 60% de las muestras. En el Grupo II, & gt; 60% de los pacientes mostró tendencias de regulación concordantes de cuatro genes. Con base en el seguimiento de los pacientes, el Grupo I fue sub-clasificarse en no recurrente (C) y recurrente (D) y se evaluó la expresión. análisis de la curva ROC en los pacientes del grupo I mostró que
PLAC8 gratis (E),
FOS
(F),
ANO1 gratis (G) y
UBE2V2
(H) tuvo mayor asociación con la enfermedad (AUC & gt; 0,8). Barra representa la mediana del cambio pliegue de las normales.
Evaluación del estado de VPH, el uso de p16 como marcador sustituto, se indica que entre la cohorte de pacientes con muestras disponibles (n = 20), 12 pacientes tenían débil o sin manchas, mientras que el resto tenía una fuerte tinción moderada /de p16 (N = 8) (S4A-S4D figura). Correlación de los genes con el estado de HPV (VPH con las puntuaciones de 2-3 tomada como positiva), indicó que el patrón de expresión global de los marcadores no muestra ninguna asociación con el estado de VPH. análisis individuales indica que entre los marcadores, sólo el
FADD
mostró una asociación con la positividad del VPH; aumento del porcentaje de pacientes (83%) con una débil o ninguna tinción de VPH mostró una elevada expresión de
FADD
en comparación con los pacientes positivos para el VPH. (57%; p = 0,03) (Fig S4E)
Correlación del perfil de marcador con el resultado de tratamiento
los marcadores fueron correlacionados con los resultados del tratamiento (recurrencia en el Grupo I y volver a la recurrencia en el Grupo II).
ANO1
mostró la mejor eficacia (sensibilidad: 0,83, especificidad: 0,67) para la detección de pacientes que fallan al tratamiento en la cohorte 1.
ANO1
también mostró un aumento de 3 veces en el incremento medio de la expresión en el cohorte recurrente (4/5) del grupo I en comparación con la cohorte no recurrente.
ECT2 gratis (0,83),
FADD
y
UBE2V2 gratis (1) también mostró una alta sensibilidad en el Grupo I. En el Grupo II 7/9 (
UBE2V2
,
CRYM
,
FADD
,
CEP55
,
PLAC8
,
TTK
y
FOS)
mostraron una alta sensibilidad (0,67 a 1) en la detección de fracaso del tratamiento. Los otros marcadores mostraron baja sensibilidad y especificidad (S3 Tabla) en ambos grupos.
positividad HPV fue un buen pronosticador en la cohorte total con 37% (3/8) que muestra el fracaso del tratamiento en comparación con 63% ( 7/11) en pacientes negativos. Sin embargo, en combinación con FADD, el único marcador que mostró una asociación significativa con la condición de VPH, FADD
pacientes de alto /VPH mostraron un alto porcentaje de fracaso del tratamiento (60%, 6/10) en comparación con FADD
baja /VPH + pacientes (33%, 1/3).
Entre estos genes, sólo el
ANO1
y
FADD
mostró una asociación significativa con la supervivencia global (SG) y libre de enfermedad