Extracto
Hay una necesidad de complementar o sustituir el herramientas de diagnóstico convencionales, a saber, la cistoscopia y la de tipo B de ultrasonido, para el cáncer de vejiga (BC). El objetivo fue identificar nuevos marcadores de metilación del ADN de BC a través de perfiles de todo el genoma de las líneas celulares de BC y la posterior PCR (MSP) de detección específica de metilación de las muestras clínicas de orina.
Diseño Experimental
El metil -ADN vinculante de dominio (MBD) técnica de captura, methylCap /ss, se llevó a cabo para detectar específica hypermethylated islas CpG en dos líneas celulares de BC (5637) y T24. Los cien primeros objetivos hypermethylated fueron seleccionados de forma secuencial por MSP en muestras de orina para reducir gradualmente el número de destino y optimizar la composición del panel de diagnóstico. El rendimiento diagnóstico del panel obtenido fue evaluado en diferentes escenarios clínicos.
Resultados
Un total de 1.627 objetivos promotor hypermethylated en las líneas celulares de BC fue identificado por secuenciación de Illumina. Las 104 principales objetivos hypermethylated se redujeron a ocho genes (VAX1, KCNV1, ECEL1, TMEM26, TAL1, PROX1, SLC6A20, y LMX1A) después de la detección de ADN de orina en un tamaño pequeño de la muestra de control normal 8 y 18 sujetos BC. Validación en una muestra independiente de 212 pacientes BC activar la optimización de los cinco objetivos de metilación, incluyendo VAX1, KCNV1, TAL1, PPOX1, y CFTR, que se obtuvo en nuestro estudio anterior, para el diagnóstico de BC con una sensibilidad y especificidad del 88,68% y 87,25 %, respectivamente. Además, se encontró que la metilación de VAX1 y LMX1A estar asociado con BC recurrencia.
Conclusiones
Hemos identificado un panel de marcadores de diagnóstico prometedora para la detección no invasiva temprana y vigilancia BC posterior.
Visto: Zhao Y, Guo S, Sun J, Huang Z, Zhu T, Zhang H, et al. (2012) Methylcap-Sec Revela Nuevos marcadores de metilación de ADN para el diagnóstico y predicción de recurrencia de cáncer de vejiga en una población china. PLoS ONE 7 (4): e35175. doi: 10.1371 /journal.pone.0035175
Editor: Angela H. Ting, Cleveland Clinic Foundation, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Enero, 2012; Aceptado: 9 Marzo 2012; Publicado: 17 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Zhao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de las becas de la fundación Nacional de Ciencia (30872963); el Laboratorio Estatal Clave de oncogenes y genes relacionados con la fundación (91-11-01); proyecto médico de guía Comisión de Ciencia y Tecnología de Shanghai (114119a4100); subvenciones Shanghai Science Foundation (09ZR1429900); y Shanghai Instituto del Cáncer, Amo & amp; bases de doctorado (SB09-07). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga (BC) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad relacionada con el cáncer y el sexto cáncer más común en el mundo [1]. En China, la incidencia de BC sigue aumentando [2]. la incidencia de CM aumenta con la edad; la edad media en el momento del diagnóstico es de aproximadamente 60 años, y es 3 veces más común en los hombres que en las mujeres [3]. El tabaquismo y la exposición a agentes cancerígenos han sido identificados como factores de riesgo [4]. Aproximadamente el 75-80% de los nuevos casos de CM se producen como superficial o carcinoma
las lesiones in situ
, mientras que el 20-25% restante presente como una enfermedad más avanzada, con un mal pronóstico. Sin embargo, incluso en los tumores superficiales, sólo el 20% son curables. Aproximadamente el 60-70% de los pacientes con recaída dentro de los 5 años, y 10-20% de los tumores progresará a una enfermedad más agresiva [5], lo que requiere una monitorización frecuente de recurrencia de la enfermedad [6]. Cistoscopia es el procedimiento BC de diagnóstico más común, y muestra una alta sensibilidad (SN) y especificidad (SP). Sin embargo, la cistoscopia requiere un dominio alto del operador, y la naturaleza invasiva de la cistoscopia reduce su valor como herramienta de detección. Se necesitan otros métodos óptimos para la detección precoz y no invasivo y vigilancia de BC.
La faceta epigenética del genoma conecta el genotipo de un individuo a las influencias ambientales que conforman el patrón de transcripción de genes hereditarios y por lo tanto, influir en el fenotipo de la célula [7]. Reglamento a nivel epigenético es crítica para el desarrollo de eucariotas superiores [8], y la regulación aberrante puede influir directamente y /o indirectamente la integridad y la expresión génica patrón genético de las células, lo que resulta en el desarrollo de varios tipos de trastornos, incluyendo el cáncer [ ,,,0],9]. La hipermetilación local de los genes supresores de tumores [10] y de la hipometilación global del ADN genómico [11], [12], [13] a menudo se producen en los cánceres humanos [14], [15]. Los avances recientes han demostrado que la hipermetilación anormal de genes supresores de tumores es un biomarcador emergente para el diagnóstico del cáncer y el pronóstico. En BC, varios genes metilados han sido identificados, y su papel como marcadores urinarios también se ha evaluado [16]. Estos estudios han demostrado claramente las ventajas de utilizar múltiples hipermetilación análisis de genes en muestras de tejido y orina para obtener información de diagnóstico y de pronóstico. Por ejemplo, en nuestro estudio anterior, hemos identificado un panel de 11 genes metilados que podrían ser utilizados como marcadores a base de orina para la detección de BC; Sin embargo, este panel tenía limitaciones. El número de genes en el panel era demasiado grande para los ensayos clínicos conveniente, y la especificidad fue insuficiente [17]. Para mejorar la eficiencia del diagnóstico y de identificar objetivos de genes que pueden predecir la recurrencia o progresión, es necesario encontrar nuevas dianas y validar su valor clínico en una gran cohorte. Sin embargo, hasta el momento, son pocos los estudios de BC han utilizado un enfoque de alto rendimiento genómica a gran escala para la detección de genes diferencialmente metiladas [18], [19]
MethylCap-ss es una técnica recientemente desarrollada para el todo el genoma de perfiles de metilación del ADN; Esta técnica consiste en la captura de los fragmentos de ADN metilado por sus dominios de unión a metil-CpG (CMBD) y la profunda posterior secuenciación de ADN eluido. Una elución con gradiente de sal clasifica el genoma en fracciones con diferentes estados de metilación. Los perfiles obtenidos de esta manera proporcionan un mapa detallado de todo el genoma de las regiones metiladas y no permiten la detección de la metilación del ADN en diferentes regiones del genoma [20].
El contexto genómico se define como las que se encuentran en la base de datos UCSC. La región de metilación diferencial ofrecido (DMR) de distribución en los CBC y evacuaciones: (A) la distribución general; (B) de distribución en refGene; (C) la distribución tanto en refGene y CGI.
En este estudio, hemos empleado por primera vez MBD MethylCap-ss para obtener un perfil de metilación global de líneas celulares de BC (CCB), que creíamos que proporcionen información en relación con la metilación aberrante-BC específica. Posteriormente, el ADN de la orina de pacientes con CM se proyectó para las 100 principales objetivos hypermethylated de los CBC para identificar los sitios de metilación-BC específica. Este número se redujo gradualmente, y la calidad marcador mejoró durante los pasos del proceso de selección. Por último, hemos adquirido un nuevo conjunto de marcadores de metilación del ADN de diagnóstico que puede utilizarse para la detección precoz y no invasivo y vigilancia de BC.
Materiales y Métodos COLECCIÓN
Paciente y la muestra de control
con el consentimiento informado y la aprobación del médico Junta Institucional de Zhongshan hospital de la Universidad de Fudan de la opinión, las muestras de orina se recogieron de 212 pacientes con un diagnóstico antes de Cristo confirmada, 41 pacientes con lesiones urinarias no cancerosos hospitalizados durante el mismo período de tiempo, y 149 controles normales. Un grupo de muestras de orina espontánea pareadas Además, se obtuvo a partir de los 21 pacientes con CM antes y después de la cirugía que incluyen la resección transuretral de cáncer de vejiga más quimioterapia intravesical (TURBC + IC). Además, se recogió otro grupo de 48 muestras de orina de pacientes fuertemente sospechosos de tener un tumor maligno de la vejiga. Todos los pacientes con CM y controles procedían de dos hospitales: el Servicio de Urología del Hospital Zhongshan, Shanghai, China y el Centro de Salud Nº 2 Shimen Comunidad Street, Jingan District, Shanghai. Las muestras fueron recogidas entre 2006 y 2009. El tumor-nódulo-metástasis (TNM) /clasificación de las muestras de los pacientes antes de Cristo se determinó de acuerdo con la American Joint Committee on Cancer directrices [21] (Tabla 1). Las muestras (50 ml de orina fresca) se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se decantó, y el sedimento se lavó una vez con 1 x solución salina tampón fosfato (PBS) y se congeló inmediatamente a -80 ° C.
La imagen de la peluca desde la base de datos UCSC está en la izquierda, y el resultado BSP, donde al menos 5 clones fueron secuenciados para cada locus está a la derecha. El círculo negro indica metilado C en el contexto de CpG; el círculo blanco indica C no metilado CpG en el contexto
Líneas celulares y el tejido normal de la mucosa de la vejiga
Dos CCB, T24 (ATCC nº HTB-4). y 5637 (ATCC n : HTB-9), fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se cultivaron hasta que llegaron a la fase de registro en medio DMEM L que contenía 10% de suero fetal bovino (FBS) a 37 ° C en un 5 % de CO
2 incubadora humidificada. Las células se recogieron por raspado, y los sedimentos celulares se lavaron dos veces con 1 x PBS. Dos tejidos de la mucosa de la vejiga normales (BM1 y BM2) se obtuvieron de donantes de órganos sanos. Por razones económicas, los dos CCB se combinaron para construir la biblioteca de BCC, así como las dos muestras de BM. De esta manera, podríamos adquirir la totalidad de la información de la metilación de cada una de las 2 muestras.
Información MBD methylCap-SEC se utilizó para seleccionar los genes diferencialmente hypermethylated en el cáncer de vejiga. El número de muestra en el gráfico se refiere a la del proceso de selección. El estado de metilación del gen diana se proyectó en muestras con diferentes tamaños. En esta fase, el número de muestras aumenta progresivamente, mientras que el número de genes disminuyó progresivamente.
MBD-methylCap-secuenciación
Una preparación de ADN a partir de tejidos congelados y líneas celulares se generó el uso de un método de extracción convencional de proteinasa K /orgánico como se describe anteriormente [22]. Se combinaron cantidades iguales de ADN de las células 5637 y T24 para formar la biblioteca de BCC, y se combinaron cantidades iguales de ADN de las células BM1 y BM2 para formar la biblioteca de BM. En 1,5 mL tubos de centrífuga, 1,5 g de las muestras de ADN combinados (BCC o BM) en 100 l de tampón TE se sometieron a ultrasonidos para dar el intervalo de tamaño deseado (200-300 pb). Se llevaron a cabo al final de reparación, adición de bases adenosina y la ligadura de adaptador de pasos como se describe anteriormente [23].
El MethylMiner ™ metilado ADN Enriquecimiento kit comercial (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, EE.UU.) se utilizó para seleccionar metilado ADN para la secuenciación. Para cada grupo, 1,2 g de la ADN tratado fue tratado según el protocolo del fabricante. Después de una elución en gradiente de NaCl, se recogieron las dos últimas fracciones de ADN altamente metilado, que correspondía a 1 M y 2 M de NaCl concentraciones. El control de ADN espiga-en suministrada por el kit se utilizó para confirmar la exactitud del ensayo. El ADN recuperado (en el rango de nanogramos) se cuantificó por Qubit ™ (Invitrogen), y se realizaron 12 ciclos de amplificación por PCR para obtener suficiente material (en el intervalo de microgramos) para secuenciación profunda. Finalmente, 1 g de producto de la PCR se aplicó a la Genome Analyzer II (Illumina, Inc., San Diego, CA) para generar 75 pb de longitud no apareado lee. duplicados de PCR fueron retirados del análisis. Utilizamos herramientas de alineación BWA con la configuración predeterminada para asignar estas lecturas a la asamblea hg19 humana genoma de referencia (UCSC) [24]. A continuación, se identificaron los picos (regiones) hypermethylated utilizando MACS de software [25], y las islas CpG humanos (CGIs) fueron descargados de la UCSC base de datos. El perfil de metilación genómica generada fue subido a una base de datos pública (Expresión Génica Omnibus: 33839 GSE) guía empresas
MSP y BSP
conversión de bisulfito y el análisis de PCR se realizaron como se describe anteriormente [22] . La secuenciación de bisulfito de PCR (BSP) y pares de cebadores PCR específica de metilación (MSP) fueron diseñados con la ayuda de software en línea adecuada (http://www.urogene.org/methprimer/index1.html; Tabla S1, Tabla S2). Los productos MSP se clonaron y se verificaron por secuenciación. Se obtuvo el
in vitro
ADN metilado de las células 5637 y T24 con el CpG metiltransferasa M. Sss I (NEB) y se utilizó como control positivo. El agua se utiliza como un control sin plantilla. secuenciación de bisulfito se realizó como se describe anteriormente [17], y los amplicones de PCR se purificó en gel y se clonó en un vector pBS-T II (Tiangen Incl., Beijing, China). Al menos 5 clones se secuenciaron individualmente para determinar los patrones de metilación del locus diana. El porcentaje de metilación BSP se calculó como el número de citosinas metiladas dividido por el número total de citosinas en todos los amplicones analizados.
Estadísticas
Los principales criterios de valoración estadística en este estudio consistió en comparar la metilación estados de los genes que se consideran relacionados con BC y sus variables clínicas relevantes en los pacientes del grupo control y el cáncer. Se evaluó la presencia o ausencia de metilación utilizando MSP para determinar las asociaciones entre el estado de metilación y el cáncer o sus variables clínicas utilizando las tabulaciones cruzadas y el chi
2 o exactas pruebas t de Fisher apropiado. La asociación de BC recurrencia con la metilación de genes y las variables clínicas se evaluó mediante análisis de regresión logística uni y multivariante. El resultado seleccionado para el análisis de seguimiento fue el riesgo acumulado de recurrencia, que se define como el tiempo desde el diagnóstico antes de Cristo hasta la fecha de la recurrencia del tumor. modelos uni y multivariante de riesgos proporcionales de Cox se utilizaron para evaluar los efectos de la metilación de genes y otras variables clínicas de la recurrencia de la enfermedad. La curva de riesgo de recurrencia acumulada fue generada por el método de Kaplan-Meier y se verificó mediante la prueba de log-rank. Todos los cálculos estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Dos caras valores de p inferior a 0,05 se consideraron significativos.
Una regresión logística univariante múltiple se realizó con el uso de los datos de metilación de los genes 9 para evaluar la relación entre la metilación de genes y las características clinicopatológicas de BC. Los detalles se describen en el texto. * P & lt;. 0,05
Resultados
Genómica perfiles de metilación de las bibliotecas BCC y BM revelaron patrones de metilación característicos en BC
perfilan la genome- estado de metilación del ADN amplia de las bibliotecas BCC y BM mediante la generación de bibliotecas de ADN enriquecidos-MBD-methylCap. Las fracciones enriquecidas en MBD se sometieron a secuenciación de alto rendimiento utilizando un Illumina Genome Analyzer II para obtener mapas completos de metilación. Conceptualmente, los fragmentos de ADN hypermethylated se enriquecieron durante el proceso de construcción de la biblioteca; Por lo tanto, la secuencia adquirida lee corresponden con las regiones hypermethylated en el genoma. secuenciación profunda de las bibliotecas de BCC y BM preparados produjo aproximadamente 6.000.000 lee (75 bases /leer) para cada biblioteca, que se deriva de aproximadamente 470 millones de bases (Tabla S3). Esta cantidad de bases de secuenciación podría cubrir el CGI genómica en aproximadamente 10 veces la profundidad. Por lo tanto, los conjuntos de datos proporcionado con éxito la información de todo el genoma.
Cuando estas lecturas fueron mapeados en el genoma, la distribución desigual formó picos que representan las regiones del genoma hypermethylated. En total, se obtuvieron 210,051 picos (longitud media de los picos: 778 pb) en los BCC y 229,538 picos (longitud media de los picos: 659 pb) en las evacuaciones intestinales (
P Hotel & lt; 0,001, MACS2.0; Tabla S3).
Para obtener la información relativa metilación, se compararon los picos entre los BCC y las evacuaciones. Casi dos tercios de los picos totales eran comunes entre las dos bibliotecas, y que no les hizo caso de este análisis. El tercio restante de los picos eran exclusivas de cualquiera de los BCC o las evacuaciones, lo que hemos llamado las regiones metilado diferencialmente (DMR) que representan el estado relativamente alto de metilación de las regiones genómicas en comparación con su contraparte. Se obtuvieron 70,432 y 83,690 DMR en los CBC y las evacuaciones, respectivamente (Tabla S3, Figura 1 A). Esta gran cantidad de DMR se dispersó en diferentes contextos genómicas, y se analizó la asociación del DMR con los diferentes contextos genómicas. El DMR-relacionados refGene era 55.237 y 45.522 en los CBC y las evacuaciones, respectivamente, lo que indica una distribución más o menos equilibrado en ambas bibliotecas (Tabla S3, la Figura 1 B). Sin embargo, cuando se investigaron los DMR dentro del CGI, se encontró que los BCC retenidos 21.179 DMR, mientras que el evacuaciones solamente 1.945 retenido; esto representa una diferencia de diez veces. Cuando se estudiaron los DMR que se produjeron dentro de la CGI del refGene, los BCC y las evacuaciones contenían 4,256 y 201 DMR para cada biblioteca, respectivamente. Por último, cuando se calculó la participación promotor, 1.627 y 66 DMR se asociaron en esta región en los CBC y las evacuaciones, respectivamente (Tabla S3, la Figura 1 C). En su conjunto, la hipermetilación aberrante fue más frecuente en las regiones promotoras de los BCC y los CGI. Los siguientes estudios de la selección de marcadores de metilación se centró en promotores del BCC.
Validación del perfil de metilación BCC diferenciado utilizando la secuenciación de bisulfito
Para confirmar que la biblioteca refleja con precisión el estado real de la metilación del material estudiado , se seleccionaron 24 hypermethylated objetivos diferentes para la verificación de la secuenciación de bisulfito. De estos, 22 fueron dispersados objetivos dentro de los 1.627 DMR relacionados con el promotor en los BCC, entre ellos 17 de las 100 principales objetivos y 5 de la 100 a 1.627 gama; los otros 2 eran objetivos de los 66 DMR en la PMB. Resulta alentador que, entre las 24 dianas en proceso de verificación, los resultados BSP de 23 genes fueron muy coherentes con la información de metilación adquirida en la biblioteca (un resultado representativo se muestra en la Figura 2, Tabla S4), lo que sugiere que las bibliotecas BCC y BM fueron altamente fiable para obtener información de metilación. Para evaluar el potencial de la biblioteca para sugerir objetivos de diagnóstico clínico, se realizaron búsquedas en la información de metilación de los objetivos identificados en nuestro trabajo previo en estas dos bibliotecas [17]. Un total de 90% (19/21) de dichos objetivos se hypermethylated en la biblioteca BCC (datos no mostrados). Además, también se investigó los marcadores-BC específica reportados por otros [19], [26]. Ocho de los 9 objetivos estaban situados en nuestra biblioteca BCC como loci hipermetilación. Tomados en conjunto, los presentes bibliotecas BCC y BM proporcionaron información hipermetilación de sonido con respecto al estado antes de Cristo.
detección MSP en una pequeña cohorte de muestras de orina para detectar biomarcadores potenciales generados 8 dianas génicas
Presentado con el amplia información proporcionada por la metilación aberrante methyCap-ss, que necesita un método para filtrar los resultados de metilación del BCC para identificar marcadores BC factibles. Hemos adoptado la estrategia de comenzar el proceso de selección con un gran número de objetivos en algunas muestras y la reducción gradual de los objetivos con un aumento en las muestras (Figura 3). Al ser sometido a las limitaciones del MSP, sólo la parte superior de las 104 1.627 promotores hypermethylated de los BCC fueron seleccionados en las muestras de ADN de orina de 8 controles normales (BNS); las mismas muestras de BCC y BM utilizados en el tramo MethylCap-ss del estudio se incluyeron como controles. En estas condiciones, sólo los objetivos que mostraron metilación en al menos uno de los dos CCB pero no en más de 2 de los 8 BN procedió a la siguiente de cribado (un resultado representativo MSP se muestra en la Figura S1). Debido a que no cumplen con estos criterios, 55 blancos fueron retirados de la primera ronda de selección. Cuarenta y nueve objetivos procedieron a la segunda ronda de detección de ADN orina de un niño de 8 BNs adicionales y 18 pacientes con CM. Se seleccionaron los objetivos que mostraron metilación en al menos 3 de las muestras de BC 18 pero 0 o 1 de los 8 BN muestras. En esta etapa, 8 genes (VAX1, KCNV1, ECEL1, TMEM26, TAL1, PROX1, SLC6A20, y LMX) cumplan las condiciones y fueron seleccionados por su potencial para discriminar BC desde BN (Figura 3).
Evaluación del valor diagnóstico de los 8 objetivos en una gran cohorte
Para asegurar que el potencial de los objetivos candidatos BC fue evaluada de forma fiable, hemos examinado los 8 candidatos en una cohorte independiente de pruebas con una muestra de gran tamaño. Se obtuvieron muestras de orina de una gran cohorte (n = 402) que incluyó 212 pacientes con CM, 149 controles normales, y 41 pacientes con lesiones no cancerosas urinario.
La frecuencia de metilación de los 8 nuevos genes en el ADN de la orina pacientes con CM (212 casos) oscilaron entre 9,43% y 42,45%, mientras que la frecuencia de metilación en los controles normales (149 casos) varió de 1,34% a 6,04%. Los 8 objetivos mostraron una diferencia significativa entre los tumores y controles normales (
P Hotel & lt; 0,0001)., Que favorablemente en favor de su uso potencial como marcadores de diagnóstico (Tabla 2) guía
Para diferenciar tumores metilación específicos de metilación de un posible asociado con la enfermedad benigna, 41 lesiones no cancerosas urinarios fueron incluidos en nuestro estudio (Tablas 1 y 2). La frecuencia de metilación de los 8 genes en este grupo de pacientes varió de 0,00% a 12,19%, apoyando la noción de que el origen de la hipermetilación estaba más estrechamente relacionado con tumores que enfermedad benigna (
P
& lt; 0,04; Tabla 2). Por lo tanto, estos 8 objetivos potencialmente pueden servir como marcadores para la detección clínica de AC y BC de distinguir de los controles normales y lesiones benignas urinario.
Debido a la heterogeneidad de la metilación del tumor, un único marcador metilado no puede proporcionar una adecuada SN y SP para el diagnóstico del tumor [27]. Por lo tanto, la combinación de un grupo de genes como un panel era una opción alternativa [28]. Tomando el área bajo la curva (AUC) como un juicio de la capacidad de diagnóstico, una combinación de 4 genes (VAX1, KCNV1, TAL1, PROX1) fue seleccionado para formar un panel de diagnóstico, que mostró un SN de 76,89% y SP de 88,59% (cuadro S5).
para mejorar aún más el potencial diagnóstico de este panel, añadimos CFTR y SALL3, los dos objetivos principales de BC de nuestro trabajo previo [17], que también se encuentran dentro de los 1.627 promotores relacionados con DMR en los BCC. El CFTR exhibió potencial decente para el diagnóstico de BC, con un SN y SP de 52,36% y 96,64%, respectivamente (Tabla 2). Sin embargo, SALL3 no presentó una buena SP en una evaluación a gran cohorte y por lo tanto se eliminó (datos no mostrados). Por último, se adoptó un panel de 5-gen (VAX1, KCNV1, TAL1, PROX1 y CFTR) que reveló la eficiencia de diagnóstico, con SN, SP, valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) de 88.68%, 87.25% , 90,82% y 84,42%, respectivamente (Tabla 2). Los resultados similares también se obtaind en un análisis independiente pequeña cohorte de validación constaba de 24 BC y 22 controles (datos no mostrados).
La capacidad de diagnóstico del panel de cinco genes es comparable a la cistoscopia
el rendimiento de los cinco objetivos en la evaluación de pacientes con sospecha clínica es crítica. Por lo tanto, hemos utilizado MSP para evaluar la orina de pacientes con sospecha de tumores malignos uroepithelial. De los 48 pacientes, 32 pacientes BC fueron finalmente confirmados por cistoscopia, y 25 de estos fueron MSP-positivas para al menos uno de los cinco genes. De los 16 pacientes que no presentaban tumores malignos mediante cistoscopia, 14 fueron negativos para MSP. Por lo tanto, el objetivo del 5-gen mostró una buena conformidad con la cistoscopia (81,25%; 25 positivas y 14 negativas en un total de 48 pacientes por ambos procedimientos).
El panel de cinco gen también podría predecir la eficacia de la cirugía la resección
los 21 (100,0%) de los pacientes con CM-MSP fueron positivas para al menos 1 de los 5 genes antes de la cirugía, mientras que sólo 2 de los 21 pacientes con CM (9,5%) retenido loci genéticos MSP-positivo después de la cirugía (
P Hotel & lt; 0,0001). Estos resultados se suman apoyo adicional a nuestro descubrimiento y la hipótesis [17] anterior, y corroboran la idea de que existe una estrecha relación entre la metilación observados en el sedimento de orina y el tumor de vejiga correspondiente.
La hipermetilación de VAX1 y LMX1A es importante para predecir la recurrencia del cáncer
Además de la relación entre el estado de metilación de genes y el fenotipo maligno del tumor en sí, sino que también estudió la asociación entre los objetivos metilados y diferentes parámetros clínicos
.
el múltiplo El análisis de regresión logística univariante de 9 dianas génicas (VAX1, KCNV1, ECEL1, TMEM26, TAL1, PROX1, SLC6A20, LMX1A y CFTR) mostró que VAX1 y metilación LMX1A fue más frecuente en las muestras de orina de los casos recurrentes que en las muestras de casos primarios en el análisis inicial de 212 pacientes con CM (primaria: 157; recurrencia: 55), con HR = 2,37 (IC del 95%, 1,27 a la 4.44 P & lt; 0,05) y HR = 2,59 (IC del 95%, 1,01 a la 6,65, P & lt; 0,05 ), respectivamente (Figura 4). modelos de regresión logística multivariante reveló que la HR de VAX1 y LMX1A fueron 2,27 (IC del 95%, 1,20 a la 4,32;
P = 0,047
) y 2,63 (IC del 95%, 1,01 a la 6,85;
P
= 0,012), respectivamente (Tabla 3). Y la asociación fue más evidente cuando estos dos genes se analizaron en combinación, con HR de 4,73 (IC del 95%, 1,39 a la 16.08;
P = 0,013
). La estrecha asociación de estos dos genes con recurrencia fue evidente en los datos de seguimiento basado en 145 casos (sin recurrencia: 108; recurrencia: 37) con la información de seguimiento intacta. modelos de riesgos proporcionales de Cox multivariado reveló que la HR de VAX1 y LMX1A fueron 2,11 (IC del 95%, 01/08 a 04/11;
P = 0,029
) y 3,31 (IC del 95%, 1,27 a la 8.59;
P
= 0,014; Tabla 4), respectivamente. La combinación de los dos genes reveló una alta HR más de 7,25 (IC del 95%, 2,41 a la 21.79;
P = 0,014
). Por otra parte, las parcelas de Kaplan-Meier revelaron que el riesgo acumulado de recurrencia en VAX1 metilado y no metilado y LMX1A difería significativamente (
P = 0,034
y
P = 0,013
, respectivamente). Se obtuvo más sigficance cuando VAX1 y LMX1A analizaron juntos (
P Hotel & lt; 0,0001, Figura 5). La validación en una pequeña cohorte independiente consistió en 24 aC y 22 controles reveló la misma tendencia con HR 9,11 (IC del 95%, 0,89 para el 93,7,
P = 0,063
) para la combinación de dos genes con importancia marginal a poseer el tamaño pequeño de la muestra quizá (datos no mostrados). Estas observaciones ponen de relieve la importancia para la determinación del estado de metilación de VAX1 y LMX1A para el pronóstico de recurrencia de la enfermedad.
En additioin a LMX1 /VAX1, nosotros también tratamos de evaluar la participación de los otros 7 genes en formato de dos -Gene combinación de pares. El estado de hipermetilación en algunos de estos genes mostró una alta coincidencia con BC recurrencia, sin embargo, esta asociación no se puede sostener en el análisis de los datos de seguimiento. Por lo tanto la metilación aberrante en estos genes podrían ser los resultados más que en el gatillo de BC recurrencia
.
El estado de metilación de ECEL1 y TMEM26 se relacionó significativamente con un alto grado de diferenciación del tumor, con HR = 2,43 (95% CI, 1,19 a la 4,97; P = 0,01) y 2,32 (IC del 95%, 1,11 a la 4,85;.
P
= 0,03), respectivamente (Figura 4), lo que sugiere que están involucrados en BC malignidad y la progresión
Discusión
En este estudio, se informó de los detalles del establecimiento de marcadores asociados a la metilación antes de Cristo, que son los siguientes: (i) el perfil de metilación global del CCB y dos evacuaciones por MBD methylCap-ss ; (Ii) la metilación del ADN aberrante BC mapas a través de la comparación del perfil de metilación de los CBC con BMS; (Iii) un panel de prometer objetivos de metilación específicos de BC; (Iv) dos objetivos de genes informativos informativos para BC recurrencia; y (v) dos genes de metilación asociada con BC diferenciación histológica.
general, se espera que las líneas celulares de cáncer establecido para compartir muchos (si no todos) los rasgos genéticos y epigenéticos con tumores
in vivo
, y líneas celulares de cáncer son ampliamente utilizados para los estudios de la tumorigénesis. Un estudio de cáncer colorrectal humano encontrado que las líneas celulares de cáncer de 6 tenían patrones de metilación que eran muy similares al tumor primario con respecto a 60 objetivos de genes metilación [29]. Por lo tanto, comenzamos nuestra en todo el genoma de perfiles de metilación con CCB y utilizamos la proyección muestra clínica para recopilar información BC-específica de metilación.
estimaciones de Kaplan-Meier de supervivencia libre de recurrencia en la cohorte de seguimiento de 145 pacientes de acuerdo a la presencia de VAX1 metilado y LMX1A (a y B). VAX1 o metilación LMX1A se asoció significativamente con un mal pronóstico de los pacientes con CM (P = 0,034 y P = 0,013, respectivamente). Análisis de dos genes combinado espectáculos más potencia estática (P & lt; 0,0001).
Se han reportado muchos genes que se hypermethylated en BC. Recientemente, los estudios con nuevos enfoques de detección, tales como matrices de metilación, han identificado marcadores de metilación con alta SN y SP [30], [31], [32]. Este enfoque de detección genómica proporciona un método eficiente y fiable para el establecimiento de un perfil de metilación aberrante asociada con la enfermedad. Hemos adoptado la técnica de MBD methylCap-ss en nuestros estudios, ya que es una plataforma abierta para nuevos loci metilación sin el conocimiento local secuencia anterior. Por lo tanto, hemos examinado los CBC y los comparó con los SM para intentar descubrir información BC metilación aberrante.
Además del estado de metilación del promotor del gen, se obtuvo la información del perfil de metilación del genoma en todo el conjunto, que incluye diferentes contextos genómicas , tales como potenciadores, reguladores de aguas abajo, el 5'UTR, exones, intrones y microRNAs. La validez de los estados de metilación comparativos fue confirmada por BSP y MSP. Esto representa más información de metilación del ADN para diferentes características contexto genómico que metodología matriz, que está limitado por secuencias de la sonda.
Un método de diagnóstico con alta SN y SP es importante para cualquier prueba clínicamente relacionados. Ha habido varios informes relativos a la elaboración de perfiles de metilación de los sedimentos de orina para la detección aC [17], [19], [26], [33], [34], [35], [36]. Las técnicas usadas en estos estudios incluyen convencional MSP, qPCR, anidado-MSP, y MethyLight. Los paneles de marcadores de diagnóstico se componen generalmente de 3 a 11 objetivos de genes que varían en SN de 77% a 94% y SP de 67% a 100% (Tabla S6).