Extracto
Antecedentes
Los microARN (miARN) representan una clase de pequeños ARN no codificantes que controlan la expresión génica mediante la orientación mRNAs y disparo, ya sea la represión de traducción o degradación del ARN. Nuevas evidencias sugieren la posible participación de alteración en la regulación de los genes miARN en la patogénesis del cáncer, y se cree que estos genes para funcionar como supresores de tumores y oncogenes.
Metodología /Principales conclusiones
El uso de microarrays de microARN , identificamos varios miRNAs expresados de forma aberrante en cáncer de los tejidos y líneas celulares de ovario humano.
miR-221
se destaca como un miARN altamente elevada en el cáncer de ovario, mientras que
miR-21
y varios miembros de la
7 let-
familia se encuentran regulados a la baja. bases de datos públicas se utilizaron para revelar posibles objetivos para los miRNAs altamente expresados diferencialmente. Con el fin de identificar de forma experimental transcripciones cuya estabilidad puede verse afectada por los miRNAs expresados diferencialmente, transfectadas precursores miRNAs en líneas celulares de cáncer humano y lo usamos microarrays de ADN para examinar los cambios en los niveles de mRNA. Curiosamente, había poca superposición entre el predicho y los objetivos o las vías experimentales, o entre objetivos experimentales /vías obtenidos utilizando diferentes líneas celulares, poniendo de relieve la complejidad de la selección de objetivos miARN.
Conclusión /Importancia
Nuestros resultados identifican varios miRNAs expresados diferencialmente en el cáncer de ovario e identificar potenciales objetivo transcripciones que pueden estar regulados por estos miRNAs. Estos miRNAs y sus objetivos pueden tener un papel importante en la iniciación y el desarrollo de cáncer de ovario
Visto:. Dahiya N, Sherman-Baust CA, Wang T-L, Davidson B, Shih I-H, Zhang Y, et al. (2008) La expresión de microARN e identificación de posibles dianas miARN en cáncer de ovario. PLoS ONE 3 (6): e2436. doi: 10.1371 /journal.pone.0002436
Editor: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Alemania |
Recibido: 4 Enero, 2008; Aceptado: May 6, 2008; Publicado: 18 Junio, 2008
Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la declaración Creative Commons Public Domain que estipula que, una vez colocado en el dominio público, este trabajo puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitirse, modificarse, construida sobre, o de otra forma utilizado por cualquier persona con cualquier objeto lícito
Financiación:.. Esta investigación fue apoyada por el Programa de investigación Intramural del NIH, Instituto Nacional sobre el Envejecimiento
Compitiendo intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los microARN (miRNA) son 21-23 nucleótidos ARN regulador procesan de horquilla 70-100 nucleótidos de pre-miRNAs [1], [2]. El miARN se incorporan en un complejo de ribonucleoproteína llama ARN inducida por silenciar complejo (RISC) y guías de la RISC a la meta ARNm [3]. La unión de los genes miARN al objetivo mRNA 5'UTR puede regular a la baja la expresión de genes a través de la inhibición de la traducción o el aumento de la degradación del ARN. Además, la evidencia reciente sugiere que los genes miARN también puede regular al alza traducción en ciertas circunstancias [4]. Cientos de miRNAs se han identificado en varias especies, incluyendo
C. elegans
, los seres humanos, y la planta de
Arabidopsis thaliana
. Se cree que miRNAs de mamífero tienen el potencial de regular al menos el 20-30% de todos los genes humanos [5]. Cada miARN puede dirigir hasta 200 transcripciones directa o indirectamente, y múltiples miRNAs pueden dirigirse a un gen dado [6]. Por lo tanto el circuito regulador potencial proporcionado por miRNA es extremadamente complejo. La expresión de varios miRNAs se ha demostrado que ser regulado por el desarrollo y varios estudios han demostrado que los genes miARN son responsables de la determinación del destino celular. Estos resultados indican que miRNAs juegan un papel importante en los procesos celulares fundamentales, incluyendo el tiempo de desarrollo celular, la hematopoyesis, el metabolismo de la grasa, la organogénesis, la apoptosis, la proliferación celular y la diferenciación. También existe una fuerte evidencia de que los miRNAs están implicados en la aparición y progresión de muchas enfermedades, incluyendo el cáncer [3].
La comparación entre los cánceres humanos y sus contrapartes normales han puesto de manifiesto distintos perfiles de expresión de los genes miARN. miRNAs De hecho, varios estudios han informado regulados diferencialmente en diversas tipos de cáncer, como el cáncer de mama [7], el cáncer de pulmón [8], la leucemia linfocítica crónica [9], el cáncer de colon [10], los carcinomas de tiroides [11], el cáncer de páncreas [12], de cabeza y cuello [5], el cáncer de próstata [13], los adenomas hipofisarios [14], y el cáncer de ovario [15] - [18]. En conjunto, estos estudios demuestran que algunos miRNAs humanos están desreguladas consistentemente en el cáncer humano, lo que sugiere un papel para estos genes en la tumorigénesis. Específico sobre-expresión o bajo la expresión de ciertos miRNAs se ha demostrado que se correlaciona con los tipos de tumores particulares [19]. miRNAs sobreexpresados potencialmente podrían apuntar a los genes supresores de tumores, mientras que los miRNAs Downregulated serían teóricamente regular los oncogenes. Por ejemplo, el
let-7
miRNAs, que están reguladas en el cáncer de pulmón, pueden regular negativamente la oncogenes RAS y HMGA2, proporcionando un mecanismo para la regulación al alza de estos oncogenes [8], [20], [ ,,,0],21]. Por lo tanto, los miembros de la
let-7 función
familia biológicamente como supresores de tumores y su pérdida se predice para promover la transformación y la progresión tumoral. Por el contrario, el grupo miARN humana
miR-17-92
actúa como un oncogén en el linfoma de células B [22] y el cáncer de pulmón [23], y puede colaborar con
myc
[22] .
han encontrado Unique miARN firmas de expresión que se asocia con características bio-moleculares y de pronóstico de cáncer de pulmón humano y la leucemia linfocítica crónica [8], [24], lo que indica que las firmas miARN se podrían utilizar para definir biológica o características clínicas de los cánceres humanos. El desarrollo de nuevos marcadores de genes miARN en un futuro próximo representará uno de los objetivos principales en la medicina molecular como los perfiles de expresión de genes miARN podría clasificar mejor los tumores pobremente diferenciados en comparación con los clasificadores basados en la transcripción [19].
Hay un número limitado de estudios en la literatura sobre el papel de los miRNAs en el cáncer de ovario. Zhang et al. comunicados de alta frecuencia alteraciones genómicas que implican los genes miARN en 227 cáncer, cáncer de mama y melanoma especímenes de ovario humano [15]. En otro estudio, se analizaron 84 tejidos normales (15 y 69 malignas) y 5 líneas celulares de alteración en el perfil miARN [16]. Por último, un estudio que analiza 10 tumores de ovario y 10 controles normales diferentes se informó recientemente [17]. En este informe se describe una serie de experimentos para dilucidar los cambios en la expresión de los genes miARN en el cáncer de ovario y de identificar posibles objetivos de miRNAs candidatos pertinentes.
Resultados
Los patrones de expresión de genes miARN en los tejidos ováricos
MiRNA perfiles de expresión se determinaron durante 34 tejidos ováricos cáncer (Tabla 1), así como 10 líneas celulares de cáncer de ovario. Una línea celular de epitelio de superficie de ovario humano inmortalizado se utilizó como control no transformada. Los perfiles de expresión se determinaron utilizando miRCURY ™ LNA miARN matrices. LNA son una clase de análogos de nucleótidos conformacionalmente restringidos que aumentan la afinidad de un oligonucleótido por su diana de ARN o ADN complementario. La matriz Exiqon miARN es actualmente la sonda conjunto más completo disponible en una gama plataforma y permite un análisis en profundidad de la expresión de los genes miARN. Después de la hibridación de ARN y el análisis conjunto, las muestras se agruparon de acuerdo a su perfil miARN utilizando el algoritmo de agrupamiento jerárquico del software JMP 6.0.0. La figura 1A muestra el análisis de agrupamiento jerárquico de los tejidos tumorales y líneas celulares basados en la expresión general miARN. Los perfiles mostrados son en relación con las células epiteliales de la superficie del ovario (células TUBO-B). Las muestras se dividen en tres grupos principales. El cúmulo central está compuesto en su totalidad de los tumores (17 muestras), mientras que el grupo de la izquierda contiene 2 líneas celulares y tumores primarios 7. El cluster derecho se enriquece en líneas celulares y contiene 8 líneas celulares de cada 18 miembros de la agrupación. A continuación, la agrupación jerárquica se repitió basándose en un número mucho más pequeño de los genes y se incluye solamente 70 expresado diferencialmente altamente miARN en tejidos de cáncer de ovario y líneas celulares. Esta agrupación análisis dio lugar a varios clústeres, pero de nuevo, las líneas celulares agrupan en 2 grupos diferentes, mientras que los tejidos primarios se agruparon (Figura 1B), lo que sugiere diferencias específicas en los genes miARN expresión entre los tejidos de cáncer de ovario y líneas celulares.
el árbol generado por el análisis de conglomerados de cáncer de ovario tejidos y líneas celulares basados en (a) todos los miRNAs probados en tejidos y líneas celulares, y (b) miRNAs diferencialmente regulados (doble cambio & gt; 2,0 o & lt; 0,5 en más de un 60 % de las muestras) en los tejidos y líneas celulares en comparación con las células TUBO-B normales de control.
el uso de análisis de componentes principales (PCA), se encontró que la expresión de los genes miARN global podría distinguir tumores de cáncer de ovario partir de líneas celulares de cáncer de ovario (Figura 2). El control no tumorigénicos MANGUERA-B también exhibió un patrón de expresión único, distinguible de las dos líneas celulares y tejidos
.
bidimensional PCA muestra que los patrones de expresión de los genes miARN globales son diferentes en líneas celulares de cáncer de ovario (indicada en azul ), tejidos de cáncer de ovario (indicado en verde), y las células TUBO-B no tumorigénicas (en rojo).
diferencialmente expresado miRNAs
a continuación, los miRNAs identificados que fueron diferencialmente expresado entre muestras no neoplásicas y neoplásicas (Figura 3A, Tabla 2). Sólo miRNAs que se han alterado candidatos importantes al menos 2 veces en al menos 60% de las muestras fueron consideradas. Utilizando estos criterios estrictos, se identificaron 25 upregulated y 31 downregulated miRNAs entre los tejidos de control y el cáncer. Del mismo modo, se identificaron 5 upregulated y 23 downregulated miRNAs en líneas celulares de cáncer de ovario en comparación con las células TUBO-B no neoplásicas. 14 miRNAs fueron desregulados en ambos tejidos y líneas celulares y se enumeran en la Figura 3A. El número de miRNAs que mostró regulación a la baja en muestras de tumores (n = 31), así como en líneas celulares de cáncer (n = 23) fueron mayores que el número de upregulated (n = 25 en los tejidos tumorales, n = 5 en líneas celulares) miRNAs . Esto está de acuerdo con los estudios de perfiles de miARN publicados anteriormente, la mayoría de los cuales han mostrado regulación a la baja de miRNAs a ser más comunes de lo que la regulación al alza en el cáncer [8], [13], [19], [25], [26].
(a) El diagrama de Venn muestra los miRNAs número expresado diferencialmente en líneas celulares de ovario, en los tejidos de cáncer de ovario y en ambos. Para cada categoría, los miRNAs elevados (indicados en rojo) y la regulación a la baja (indicado en verde) se indican a continuación el diagrama. (B) El diagrama de Venn muestra el número de miRNAs expresados diferencialmente identificados en el estudio actual y el número de miRNAs indentified en 3 estudios de cáncer de ovario anteriores. Los miRNAs en común se indican a continuación el diagrama y un código de colores (rojo: elevado; verde: disminuye)
miR-221
fue el miARN más altamente elevados. en ambos tejidos y líneas celulares (9 veces y 7 veces, respectivamente), mientras que
miR-21
se redujo significativamente en ambos tipos de muestras (3 veces y 9 veces, respectivamente) (Tabla 2). Entre los diferentes
7 let-
miembros de la familia,
let-7e
y
let-7f
mostraron más de desregulación de 2 veces en al menos el 60% de las muestras tumorales . El otro
let-7 Buscar miembros de la familia (
let-7 g
,
let-7d
,
let-7c
,
let-7a -e
,
let-7i
,
let-7a
,
let-7b
no fueron downregulated la manera más coherente, pero cada uno de ellos se encontró una disminución 2 -fold o más en al menos el 20% de los tumores. en general, el 94% de los tumores tenían al menos un
let-7
miembro de la familia downregulated al menos 2 veces. las líneas celulares exhibieron regulación a la baja de la
let-7 Buscar miembros de la familia también.
let-7f
fue downregulated más de 4 veces en líneas celulares, mientras que
let-7d
y
let-7a- e
eran también disminuyó significativamente (más de 2,3 veces y 2 veces, respectivamente).
por último, comparamos los miRNAs de ovario regulados diferencialmente identificados en este estudio con los reportados en tres estudios anteriores [15] -.. [17] de un total de 136 miRNAs se han encontrado desregulado en los estudios previos, 16 fueron también identificados en nuestro estudio (Figura 3B) de estos 16 miRNAs, 9 se downregulated (
let-7d
,
miR-106b
,
miR-122a
,
miR-141
,
miR-183
,
miR-195
,
miR-200a
,
miR-335, mir424
) y 7 fueron upregulated (
miR-100
,
miR-199a
,
MIR -296
,
miR-29a
,
miR-29c
,
miR-99a, miR-494
). Curiosamente, nos informan de 56 miRNAs que anteriormente no hayan sido encontrados desregulados en el cáncer de ovario (Figura 3B).
Predicción objetivos de genes de los genes miARN
miRNAs pueden regular un gran número de genes diana y varios bases de datos en base a diversos algoritmos están disponibles para la predicción de los objetivos de miRNAs seleccionados. Target Scan 3.0 y PicTar se utilizaron para predecir objetivos de genes de los miRNAs desregulados identificados en este estudio. La tabla 2 enumera los 3 primeros objetivos predijo acuerdo tanto con el Objeto de Análisis y PicTar para cada miRNAs expresados diferencialmente. Hubo poca superposición entre los objetivos identificados con las dos bases de datos diferentes y sólo 7 objetivos (FAM44B, BACH1, BCL6, HMGA2, Calu, FGF2, y TNKS2) durante 7 miRNAs (
let-7
familia,
miR-98
,
miR-155
,
miR-195
,
miR-346
,
miR-206
,
miR-335
) se comparte entre estas dos bases de datos cuando se examinaron los 3 primeros objetivos.
Experimental identificación de los genes miARN objetivos
Para estudiar más a fondo los posibles objetivos de miRNAs ováricos clave, overexpressed
miR-34c
,
miR-98
,
miR-424
, y
let-7f Hoteles en 2 líneas celulares de cáncer de ovario (BG -1 y UCI-101).
miR-424
y
let-7f
fueron regulados a la baja en ambos tejidos y líneas celulares (Figura 3A), mientras que
miR-34c
y
miR-98
se encontraron downregulated en tejidos de cáncer de ovario y en líneas celulares, respectivamente. Figura 4 muestra el éxito sobre-expresión de los miRNAs 72 horas después de la transfección. A continuación, utiliza microarrays de Illumina para investigar cambios en el nivel de ARNm después de la sobreexpresión de estos candidatos. Las tablas 3 y 4 lista de las transcripciones que se han alterado significativamente mayor después de la sobre-expresión de los miRNAs en BG-1 y líneas celulares UCI-101, respectivamente. Curiosamente, estas tablas incluyen genes tales como
GPX3, MCM7, MSN
que previamente han sido implicados en el cáncer de ovario. Entre los genes alterados significativamente (absoluta Z-relación & gt; 1,5), hay 10 genes del cáncer conocidos (
MSN, PIM1, CBL, COL1A1, COX6C, EVI1, EXT1, HLXB9, PTPN11, TCEA1
), 4 tumoral genes supresores (
HIF1A, CAV1, GADD45A, PTTG1IP
), 26 genes del ciclo celular (
ACAT2, CDK5, FDPS, ID1, LLGL1, MAD2L1, ANLN, ATAD2, C12orf48, CD9, ECT2, GADD45A, GSTO1, HSPD1, IPO7, KNTC2, KRT18, MRPS17, NUDT1, PFN1, PRKCA, SFRP1, SKP2, SNRPA1, VAMP8, WEE1
), y 6 genes implicados en la remodelación de la cromatina (
ASF1A, gcn5l2, ATAD2, CBX2 , CBX4, NCOA3
). Muy se encontró poca superposición entre el predicho (PicTar y el Objeto de Análisis) y objetivos experimentales. Curiosamente, los objetivos experimentales variaron de acuerdo con la línea celular utilizada, lo que sugiere una influencia significativa del fondo molecular en la selección de los genes miARN objetivo. Con el fin de validar los datos de Illumina, RT-PCR se realizó en 8 genes que se encuentran objetivos de
let-7f gratis (
KIF1A, ASS, FDPS, NTS
en las células de la UCI-101, y
TFF1, eEF1A2, ESM1, VIM
, en las células BG-1) (Figura 5). Se encontró que, mientras que los valores absolutos fueron diferentes, las tendencias fueron los mismos.
KIF1A
y
ASS
se encontraron elevados en UCI-101, mientras que
FDPS
y
NTS
se downregulated en estas células.
TFF1
y
eEF1A2
fueron confirmados a ser elevados en BG-1, mientras que
ESM1
y
VIM
fueron downregulated.
pre
miR-34c
,
Pre-miR-98
, pre
miR-424
, pre
let-7f
se sobreexpresa en BG-1 y la UCI-101. Los productos para cada uno de los miRNAs se muestra por duplicado para las dos líneas celulares utilizadas. sobreexpresión significativa de la miRNAs se confirma. RT-PCR del ARN 18S se muestra para cada condición para demostrar la igualdad de carga.
Las transcripciones identificadas por las matrices de Illumina para ser alterados después de dejar que la sobreexpresión-7F son validados por RT-PCR. Plegar los cambios de los genes
KIF1A, ASS, FDPS, NTS gratis (en las células de la UCI-101), y
TFF1
,
eEF1A2, ESM1, VIM gratis (en BG-1 células) se muestran y confirman los cambios identificados por las matrices de Illumina.
el uso de estos objetivos experimentales como punto de partida (Tabla 3 y Tabla 4), se utilizó el análisis Ingenuity Pathway (IPA) para revelar posibles enfermedades , funciones moleculares, sistemas fisiológicos, y las vías canónicas asociadas con la expresión de estos miRNAs en BG-1 (Tabla 5) y UCI-101 (Tabla 6). Como era de esperar, el análisis identificó "cáncer" como la principal enfermedad asociada a estos patrones de expresión en ambas líneas celulares. enfermedad gastrointestinal también fue identificado comúnmente. Curiosamente, se encontró que el movimiento celular, el ciclo celular, y las funciones cardiovasculares sistemas a menudo estar relacionada con estos patrones de expresión. Hubo poca consistencia en las vías canónicas identificados a través de IPA y con excepción de la señalización de integrina (que se encuentra tras miR34c o expresión miR98 en BG-1), ninguna de las vías canónicas se ha encontrado más de una vez en las Tablas 5 y 6. Por tanto, este análisis sugiere que mientras que las vías generales afectados por
miR-34c
,
miR-98
,
miR-424
, y
let-7f
expresión en estos dos líneas de células están relacionados con el cáncer, las vías moleculares exactos específicas, son variables y dependen de la línea celular y en los miRNAs. Aquí se evidencia el alto grado de complejidad de la selección de objetivos y la regulación de los genes miARN.
Discusión
El trabajo previo ha demostrado que los miARN expresión específica firmas en diversos cánceres humanos puede estar asociada con el diagnóstico, el pronóstico y la respuesta al tratamiento [27]. Además, se ha sugerido que miRNAs específicos pueden tener papeles cruciales en la iniciación y /o progresión de los cánceres humanos a través de sus efectos sobre diversas vías moleculares. Una mejor comprensión de los genes miARN expresión en el cáncer puede descubrir nuevas vías moleculares, o nuevos mecanismos de activación de vías conocidas. Utilizando la matriz Exiqon miARN, la gama más amplia miARN disponibles, hemos obtenido miARN expresión firmas en el cáncer de ovario e identificado varios miRNAs expresados diferencialmente en el cáncer de ovario tejidos y líneas celulares, así como posibles dianas para varios de estos miRNAs.
Hemos identificado un total de 70 miRNAs desregulado en los tejidos ováricos y 14 de estos también se expresaron de manera aberrante en líneas celulares de cáncer de ovario (Figura 3A). En general, hubo relativamente pocos miRNAs se encuentran en común entre este estudio y estudios previos (Figura 3B). Hay varias explicaciones posibles para esta discrepancia. En primer lugar, la plataforma de matriz utilizada para la identificación de los genes miARN es diferente y puede producir diferentes patrones. En segundo lugar, el material se utilizó como control normal es diferente de la que se utilizó en los estudios anteriores y la elección de normal se sabe que influyen en el resultado del análisis de genes de perfiles [28]. Se utilizó inmortalizados células epiteliales de la superficie del ovario, mientras que dos de los otros tres estudios de ovario miARN utilizaron ovarios enteros. Creemos que el tejido de ovario mayor conjunto no es el control normal más apropiado como el ovario se compone de varios tipos de células y que el epitelio sólo representa una pequeña fracción del tejido ovárico. El uso de una cepa celular inmortalizada también tiene inconvenientes, pero creemos que es una mejor aproximación de los tejidos epiteliales de ovario normales que la mezcla presente en los ovarios enteros. En cualquier caso, la validación independiente de los patrones de expresión es fundamental, independientemente de la fuente de tejido o tumores normal utilizado en el estudio.
Identificamos
let-7f
como altamente downregulated tanto en células líneas y tumores. La expresión de varios
let-7 se han notificado a ser regulada en los cánceres de mama [7], cánceres de pulmón [29], cáncer de tiroides [11], el cáncer de próstata [13], y el cáncer de ovario [15
miRNAs ] - [17]. Una asociación entre la
regulación a la baja y el mal pronóstico se ha reportado en humanos de pulmón [29] y el cáncer de mama permiten 7-[7]. El hallazgo de que el
let-7
familia de miRNAs regula la expresión de la familia del oncogén RAS proporciona una base molecular para el papel de
let-7
miRNAs en el cáncer humano [20].
let-7
tanto, se considera ser un supresor tumoral miARN y, curiosamente,
let-7
genes se asignan a loci borrado en múltiples tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de ovario [20]. Además,
let-7f
ha informado de que la promoción de la angiogénesis por dirigir genes anti-angiogénicos [30]. El presente trabajo, así a los informes anteriores [15] - [17] muestra que los miembros de la
let-7
familia se ha alterado en el cáncer de ovario sugieren que
let-7
puede representar una importante jugador en esta enfermedad. Será importante identificar
let-7
abajo objetivos pertinentes a la tumorigénesis de ovario.
El miARN más consistente y altamente aumentada en ambos tejidos y líneas celulares de cáncer de ovario fue
miR-221
(Tabla 2).
miR-221
ha demostrado ser altamente regulada al alza en los cánceres de páncreas [12], en el glioblastoma [31] y estaba implicado en el cáncer de tiroides [32].
miR-221
se ha demostrado que el objetivo del kit del oncogén [33], así como el supresor de tumores p27kip1 [34].
Mientras que
miR-21
sobreexpresión ha sido observado en varios tipos de cáncer, incluyendo glioblastoma [31], cáncer de mama [7], [35], cáncer de pulmón [8], cáncer de páncreas [36], las líneas humanas malignas de células cholangiocyte [37] y el cáncer de colon [38], encontramos este gen altamente downregulated en nuestras muestras. Como cuestión de hecho,
miR-21
fue la más significativa downregulated miARN en el cáncer de ovario cuando nuestros datos se promedió en todas las muestras y líneas celulares. Nuestro hallazgo es contrario a la intuición, ya que se ha encontrado que
miR-21
regulación a la baja se asoció con un aumento de la apoptosis y la disminución de la proliferación celular [35].
miR-21
se sugirió para funcionar como un oncogén modulación de la tumorigénesis mediante la regulación de genes tales como BCL2 [35], PTEN [37] y PDCD4 [39]. Actualmente estamos investigando los posibles objetivos de
miR-21
en nuestras células, así como las posibles razones de su regulación a la baja de nuestro sistema. Es posible que los objetivos de determinados miRNAs podría ser específico de tejido, lo que explicaría las diferencias en los roles de los diferentes miARN en diferentes tejidos.
Otros miRNAs encontrados expresados diferencialmente en ambos tejidos y líneas celulares son
miR-146b
,
miR-508
,
miR-106b
,
miR-134
,
miR-155
,
miR-346
,
miR-422a
,
miR-424
,
miR-519a
,
miR-648
,
miR-662
. Varios de estos miRNAs han sido implicados en los otros tumores malignos o en el control del crecimiento y la apoptosis. Por ejemplo,
miR-134
downregulated el crecimiento celular, y
miR-155
aumenta el crecimiento celular en células de carcinoma de pulmón, A549 [40]. sigue siendo la contribución de cada uno de estos jugadores a la tumorigénesis de ovario que se determine.
miR-34c
recientemente se ha demostrado que es un objetivo transcripcional de p53 [41], [42] y puede suprimir la proliferación y la formación de colonias en agar blando en las células epiteliales de ovario neoplásicas [42]. Curiosamente, encontramos
miR-34c
desregulado en tejidos de cáncer de ovario y de este hallazgo sugiere que
miR-34c
pueden desempeñar un papel en la tumorigénesis de ovario a través de su papel en la ruta de p53.
Debido a la especificidad de tejido de los miRNAs, diferentes conjuntos de miRNAs es probable que se upregulated o downregulated en cánceres de diferentes orígenes celulares, aunque se ha informado de que las firmas de miARN de diferentes tipos de cáncer, especialmente epiteliales compartiría algunos miRNAs individuales [ ,,,0],38]. De los miRNAs que fueron reportados aquí para ser expresados diferencialmente en el cáncer de ovario, varios se han desregulado de manera similar en otros tipos de cáncer. En general, también se han reportado 31 miRNAs identificados en el estudio actual de-regulada en otro tipo de cáncer (datos no mostrados). Por otra parte, han sido previamente informado 16 miRNAs identificados aquí para ser alterado en el cáncer de ovario (Figura 3b). Más interesante aún, identificamos 56 miRNAs que no hayan sido previamente encontrados expresados diferencialmente en el cáncer de ovario. Estos miARN pueden desempeñar un papel en la tumorigénesis de ovario y están siendo investigados actualmente.
Con el fin de identificar objetivos potenciales de los miRNAs expresados diferencialmente en el cáncer de ovario se realizaron búsquedas dos bases de datos principales, PicTar y de ciclo de destino. Se encontró que había muy poca superposición entre los objetivos previstos de cada algoritmo. De hecho, sólo 7 (FAM44B, BACH1, BCL6, HMGA2, CALU, FGF2, y TNKS2) objetivos previsto fueron compartidos entre estas dos bases de datos. Este resultado ilustra las dificultades bien documentados de los objetivos de la predicción de genes miARN [43]. Por otra parte, es posible que los objetivos pueden depender del entorno celular, (proporciones relativas de los diferentes objetivos potenciales pueden afectar a los más susceptibles de ser regulados a la baja) añadir otro nivel de complejidad en la selección de los genes miARN objetivo. Con el fin de investigar experimentalmente los cambios en los niveles de ARNm, que sobreexpresado 4 candidatos miARN diferentes (
miR-98
,
miR-424
,
miR-34c y
let-7f
) en 2 líneas celulares y los niveles de transcripción evaluó a través de una matriz de oligonucleótidos Illumina. Claramente, este enfoque sólo puede identificar los genes miARN objetivos que han alterado los niveles de mRNA (en oposición a los objetivos de inhibición de la traducción), pero ha sido previamente demostrado que miRNAs pueden regular a la baja los niveles de un gran número de transcripciones [44]. Si bien algunas de las transcripciones alterado puede no representar blancos directos de los genes miARN correspondiente, un nuevo análisis de los ARNm candidatos individuales puede proporcionar evidencia acerca de si representan objetivos directos o secundarios. Ingenuity Pathway Analysis de los objetivos reveló una serie de vías y el sistema potencialmente regulados por los miRNAs sobreexpresados (Tabla 5 y Tabla 6). Curiosamente, las vías previstas no fueron consistentes entre las líneas celulares 2 y otra vez sugirieron que miARN selección de objetivos y, por tanto, la función de los genes miARN es altamente dependiente del tejido.
Cuando se compararon los objetivos previsto (obtenidos con PicTar y el Objeto de Análisis) con los objetivos experimentales obtenidos por Illumina microarrays, se observó que no se solapan. Esto podría ser debido a un número de razones. En primer lugar, los algoritmos para la identificación de los genes miARN objetivos pueden identificar preferentemente objetivos que resultan en la represión de traducción, que obviamente no sería identificado por nuestro experimento de microarrays. Por otra parte, como se ha discutido anteriormente, es probable que los genes miARN objetivos son específico de tejido. De acuerdo con esta posibilidad es el hecho de que los objetivos que hemos identificado experimentalmente eran completamente diferentes en las dos líneas celulares que hemos utilizado. Curiosamente, la mayor parte de la altamente regulada hasta y hacia abajo regulada (10 principales) genes ya se ha informado que tienen un papel en el cáncer u otras actividades celulares relacionadas con el cáncer (Tabla 3 y 4), tales como GSTP1 [45], [46], HIF-1 [47], [48], y SGK [49].
en este estudio hemos identificado miRNAs expresados diferencialmente en el cáncer de ovario. Como primer paso para determinar su papel en la tumorigénesis de ovario, hemos empezado a identificar los objetivos de estos miRNAs. Se demuestra que los objetivos previstos son diferentes de lo experimental y que los objetivos experimentales varían de acuerdo a los antecedentes celular en el que se expresan los miRNAs. Por tanto, será importante estudiar metódicamente cada miRNAs en varios modelos con el fin de aclarar su papel en el cáncer de ovario. Además, una combinación de la sobreexpresión /focalización eventos por miARN junto con la tecnología de matriz de proteínas será crucial en la identificación de los genes miARN: los jugadores de mRNA de cáncer de ovario. La imagen que es probable que surja es un conjunto muy complejo de interacciones entre miRNAs y mRNAs objetivo. Una mejor comprensión de estas vías nos traerá aún más cerca de la comprensión del mecanismo molecular que subyace a esta enfermedad y es de esperar que los nuevos enfoques para la detección y la terapia.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y de tejidos Las muestras
líneas de cáncer de ovario BG-1, UCI-101, HEY, células OVCA420, OVCA432, OVCA433, OVCAR2, OVCAR3 y OVCAR5 se cultivaron en medio de cultivo 5A de McCoy (Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal al 10% ( FBS) y antibióticos (100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina). línea celular de cáncer de ovario OV90 se cultivó en medio MCBD 105 (Sigma) + Medio 199 (Invitrogen) suplementado con FBS al 15% y antibióticos. MANGUERA-B, una línea de células epiteliales de ovario superficie inmortalizado con E6 y E7 [50], se cultivó en RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS, antibióticos y 5 ng /ml de EGF. Dieciocho cánceres primarios de ovario congelados se obtuvieron a través del tejido humano de Colaboración Red Grupo de Oncología Ginecológica (Hospital infantil, Columbus, OH). Además, nueve muestras congeladas primarios de cáncer de ovario y siete muestras de ARN (de tejidos de cáncer de ovario primario) se obtuvieron del Departamento de Patología de las instituciones médicas Johns Hopkins (Baltimore, MD). La clasificación histológica de todos los tejidos se presenta en la Tabla 1 y se encontró que todas las muestras para contener una mayor que las células de cáncer de 80%
extracción de RNA & amp.; cuantificación
El ARN total se obtuvo utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. ARN se cuantificó y se evaluó mediante la RNA 6000 Nano Kit y 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies UK Ltd, West Lothian, Reino Unido).
miARN microarrays de hibridación
miRCURY ™ LNA miARN Arrays (Exiqon), que consiste en sondas de control, desajuste sondas y 1458 sondas de captura, las sondas perfectamente para todos los miARN en todos los organismos emparejado como anotada en miRBase Release 8.1, julio de 2006 (8,2 miRBase humana también está cubierto) se utilizaron en este estudio. Las sondas de captura cubren el 92,3% de miRNAs anotados en miRBase 9.0. Las sondas de control incluyen 10 sondas de control de pico-a para asegurar el etiquetado y la hibridación óptima, ocho sondas de captura negativos y doce sondas de captura que se hibridan con pequeños ARN nucleares. etiquetado de ARN y la hibridación se completó según las instrucciones del fabricante. Brevemente, el ARN de cada muestra se marcó con Cy3 usando miRCURY ™ LNA miRNA kit de marcaje de matriz. Después del marcaje, las muestras se cargaron en los microarrays de diapositivas y se incubaron 16-18 horas a 60 ° C.