Extracto
propiedades y mecanismos de mimulone (MML),
C
-geranylflavonoid aisladas de los
Paulownia tomentosa
frutos contra el cáncer, fueron aclarados en primer lugar en este estudio. MML impedía la proliferación celular de una forma dosis-y dependiente del tiempo y desencadena la apoptosis a través de la vía extrínseca en células de adenocarcinoma de pulmón humano A549. Además, las células tratadas con MML muestran características autofágicas, tales como la formación de vacuolas autofágicas, una característica morfológica primaria de la autofagia, y la acumulación de la proteína 1 3 puntos lagrimales asociada a microtúbulos luz de la cadena (LC3), otro fabricante típico de la autofagia, como se determina por inmunotinción FITC-conjugado y monodansylcadaverine tinción (MDC), respectivamente. Los niveles de expresión de LC3-I y LC3-II, marcadores específicos de la autofagia, también fueron aumentados por el tratamiento MML. la inhibición de la autofagia en un 3-metiladenina (3-MA), inhibidor de la autofagia farmacológica, y shRNA desmontables de Beclin-1 reduce la muerte celular por apoptosis inducida por la MML. flujo de autofagia no se vio afectada significativamente por el tratamiento MML y el inhibidor lisosomal, la cloroquina (CQ) suprimió la autofagia inducida por la MML y la apoptosis. autofagia inducida por la MML fue promovido por las disminuciones en los niveles de p53 y p-mTOR y aumento de p-AMPK. Por otra parte, la inhibición de la transactivación de p53 por pifithrin-α (PFT-α) y la caída de p53 mejorada inducción de la autofagia y la muerte celular por apoptosis, finalmente promovido. En general, los resultados demuestran que la autofagia contribuye a la citotoxicidad de MML en células de cáncer que albergan p53 de tipo salvaje. Este estudio sugiere que la MML es un candidato potencial para un agente anticancerígeno dirigida tanto a la autofagia y la muerte celular por apoptosis en el cáncer de pulmón humano. Por otra parte, el co-tratamiento de MML y el inhibidor de p53 sería más eficaz en la terapia de cáncer de pulmón humano
Visto:. Un H-K, Kim K-S, Lee J-W, Parque M-H, Luna H-I, Parque S-J, et al. (2014) Mimulone inducido por autofagia través de la AMPK mediada por p53 /mTOR Camino Aumenta la caspasa-mediada por apoptosis muerte celular en células A549 de cáncer de pulmón humano. PLoS ONE 9 (12): e114607. doi: 10.1371 /journal.pone.0114607
Editor: Ilya Ulasov, Swedish Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Julio, 2014; Aceptado: 10 de noviembre de 2014; Publicado: 9 de diciembre 2014
Derechos de Autor © 2014 An et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Dong-A fondo de investigación de la Universidad. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción cáncer
pulmón es el tumor maligno más frecuente que representa una de las principales causas de muerte asociada al cáncer global y el carcinoma no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) capta casi el 85% de todos los cánceres de pulmón [1], [ ,,,0],2]. Pese a los considerables avances en la terapia del cáncer de pulmón, incluyendo la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia, el pronóstico para los pacientes que tienen cáncer de pulmón sigue siendo pobre, con menos del 15% de la tasa de supervivencia global a 5 años [1]. Especialmente, la quimioterapia usando compuestos de platino o combinaciones a base de platino es la terapia de cáncer de pulmón más frecuentemente usado y se considera que es el tratamiento óptimo en pacientes con NSCLC avanzado en etapa [2], [3]. Sin embargo, la eficacia de la quimioterapia en pacientes con cáncer de pulmón avanzado es limitada, debido a la resistencia a los medicamentos y los efectos secundarios tóxicos de los fármacos [2], [3]. Por lo tanto, es crucial para el desarrollo de agentes quimioterapéuticos menos tóxicos y más eficaces para el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón avanzado
.
En los últimos años, los productos naturales derivados de plantas han recibido amplia atención como fuentes principales de nuevos fármacos para la reducción de la quimioterapia asociados efectos secundarios y que ejercen sus efectos contra el cáncer mediante la activación de la apoptosis y la autofagia [4] - [7]. Estudios recientes han demostrado que varios productos naturales derivados de plantas, incluyendo plumbagina [8], glossogin [9], la curcumina [10], celastrol [11], isolinderalactone [12], la glicirricina [13], polydatin [14], 6- shogaol [15], ácido glicirretínico [16] y Embelin [17], inducir la apoptosis a través de la vía intrínseca y /o extrínseco y activación de la vía p38 /JNK en células de cáncer de pulmón humano. Además, 6-shogaol causó la muerte celular a través de la inducción de la autofagia por la inhibición de la ruta AKT /mTOR en células humanas NSCLC A549 [18] y paclitaxel y feroniellin A ejerce sus efectos citotóxicos mediante la inducción de tanto la autofagia y la apoptosis en las células A549 de cáncer de pulmón humano [19], [20].
Paulownia tomentosa Steud
. (Scrophulariaceae) es árbol de hoja caduca distribuido a través de China, Corea y Japón [21] y extractos de
P
.
tomentosa
se han utilizado para aliviar la bronquitis, ataques de asma y flema en la medicina tradicional china [22]. Estudios anteriores demostraron que
C
flavonoides -geranylated, los principales constituyentes bioactivos de
P. tomentosa
, tiene efectos neuroprotectores, actividades antibacterianas y anti-radicales [23] - [26]. Además,
C
-geranylated flavanonas de
Paulownia tomentosa
frutos mostraron fuerte actividad citotóxica en varias líneas celulares de cáncer humano [27], [28]. También se ha informado recientemente que geranylated flavanona tomentodiplacone B inhibe directamente la proliferación celular mediante la regulación a la baja de la actividad quinasa 2 dependiente de ciclina, lo que lleva a la acumulación de la fase G1 en THP-1 células de leucemia monocítica humana [29]. Sin embargo, el mecanismo subyacente responsable de la actividad antitumoral de los flavonoides geranylated no está bien aclarada.
Hemos aislado recientemente un compuesto que pertenece a
C
-geranylated flavonoides, mimulone (MML), desde el
Paulownia tomentosa
frutos. En el presente estudio se analizaron en primer lugar los efectos anticancerígenos de la MML en las células cancerosas de pulmón humano y también aclaró su mecanismo de acción. Se demuestra aquí que la autofagia desencadena la apoptosis MML precedentes en las células A549 NSCLC humanos, y la inhibición de la autofagia disminuye la apoptosis en las células tratadas con MML.
Materiales y Métodos
Materiales
Monodansylcadaverine ( MDC), 4 ', 3-metiladenina (3-MA), cloroquina (CQ), el compuesto C (comp C) y 6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO , ESTADOS UNIDOS). Z-VAD-FMK (inhibidor de pan-caspasa), Z-DEVD-FMK (caspasa-3 inhibidor), Z-IETD-FMK (caspasa-8 inhibidor) y Z-LEHD-FMK (caspasa-9 inhibidor) se obtuvieron de Calbiochem (EMD Biosciences, San Diego, CA, EE.UU.). 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT), DAPI, puromicina dihidrocloruro y la cloroquina (CQ) se disolvieron en dH
2O. 3-MA (100 mM), poli-L-lisina (0,1%) y polibreno (20 mg /ml) disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Pifithrin-α (PFT-α), el compuesto C (comp C) y MDC se disolvieron en sulfóxido de dimetilo (DMSO). Los anticuerpos para ATG7, Beclin-1, LC3, caspasa-3, caspasa-8, caspasa-9, Puja, p-p38, p38, p-AMPK-α, la AMPK-α, p-ACC, ACC, p-mTOR, mTOR se obtuvieron de Señalización celular Tecnología (bailarines, Massachusetts, EE.UU.); anticuerpos para p53 PARP-1/2, (DO-1), p-ERK y ERK se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.); anticuerpo de p62 /SQSTM1 se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.); anticuerpo de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se obtuvo de Millipore (Milford, MA, EE.UU.); Peroxidasa de rábano (HRP) y conjugado con anticuerpos secundarios fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (bailarines, Mass, EE.UU.) y Enzo Life Science (Farmingdale, NY, EE.UU.), respectivamente; isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con anticuerpo secundario se obtuvo de Vector Laboratories (Burlingame, CA, EE.UU.). Anexina V-FITC kit de detección de la apoptosis y el kit de ensayo de proteína BCA se compraron de BD Biosciences (San Jose, CA, EE.UU.) y Thermo (Rockford, IL, EE.UU.), respectivamente. MML (fig. 1A) aislado de
P. tomentosa
frutos se preparó como se describe en el informe anterior [25], se disolvió en DMSO a 40 mM de concentración de reserva, y se almacenaron a -20 ° C.
(A) Estructura molecular de la mimulone. Varias células humanas de cáncer, no pequeñas A549 del cáncer de pulmón de células (B), el cáncer de mama MCF7 (C), HCT116 de cáncer de colon (D) y U2OS osteosarcoma células (E) fueron tratados con el MML como concentraciones indicadas (0-80 mM) durante 12 h o 24 h y luego la viabilidad celular se midió por el ensayo MTT. Los gráficos de barras indican el porcentaje de viabilidad. células A549 (F) fueron tratados con el MML a diversas concentraciones (0 a 80 mM) durante 24 h y las células viables se contaron mediante tinción con azul de tripano. Las células vivas (células no teñidas) se calcularon utilizando hemocitómetro y gráfico de barras que indica el porcentaje de células viables. Todos los datos se expresan como media ± SEM de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 y ** p & lt;. 0,01 en comparación con el control
Los cultivos de células
no microcítico de pulmón de células A549 de carcinoma humano, el adenocarcinoma de mama humano MCF-7, el carcinoma colorrectal humano HCT116 y las líneas celulares de osteosarcoma U2OS humanas se adquirieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE.UU.). Las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; WelGENE Co., Daegu, Corea) que contenía 10% (v /v) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) y 1% de PSA (WelGENE Co., Daegu, Corea) en 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 en el aire.
la viabilidad celular
para el análisis de la viabilidad celular, el ensayo de MTT se llevó a cabo por un procedimiento similar al descrito anteriormente [30]. Brevemente, las células fueron sembradas en placa de 24 pocillos (5 x 10
4 células /pocillo) y se cultivaron durante 24 h. Las células se trataron luego con MML a diferentes concentraciones (0 a 80 mM) durante 24 h o tratadas con 60 mM de MML para diferentes cursos de tiempo (0-24 h). Después del tratamiento MML, las células se incubaron con medio /MTT (0,5 mg /ml) mezcla durante 3 h. DMSO se añadió para disolver el cristal de formazan de MTT reducido y la absorbancia se leyó a 540 nm usando un lector de placas ELISA (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Para confirmar el efecto de la MML sobre la proliferación celular, las células vivas se contaron mediante tinción con azul de tripano de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las células A549 se sembraron en placa de 12 pocillos y se trataron con MML como concentraciones indicadas durante 24 h. Después del tratamiento, las células se recogieron usando tripsina-EDTA (WelGENE Co., Daegu, Corea) y se tiñeron con 0,4% de solución de azul de tripano (Gibco, Carlsbad, CA). Las células vivas se contaron mediante un hemocitómetro. La viabilidad celular se muestra con respecto al control.
La extracción de proteínas y Western blot
extractos de proteínas de células enteras de células A549 se prepararon con un tampón RIPA (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) que contiene la mezcla de inhibidor de la proteasa (GE Healthcare, Piscataway, EE.UU.) y cóctel inhibidor de fosfatasa (Thermo, Rockford, IL, EE.UU.). Las proteínas de lisados de células enteras se cuantificaron utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de transferencia Western se llevó a cabo como se describe anteriormente [30]. aumento de quimioluminiscencia (ECL) se utilizó el sistema de detección (Amersham Bioscience, NJ, EE.UU.) para detectar la señal y la intensidad de la señal de las bandas de proteínas detectadas se midieron utilizando Scion Image Instrumento (Scion Co., Frederick, MD, EE.UU.). La igualdad de carga se evaluó por GAPDH como controles internos para la transferencia Western.
inmunocitoquímica
La tinción de inmunofluorescencia se llevó a cabo por un procedimiento similar al descrito anteriormente [30]. En resumen, las células A549 se cultivaron en cubreobjetos estériles y se trató con MML durante 24 h, y luego se fija con 3% de paraformaldehído (PFA) durante 15 min a 37 ° C. A continuación, paso de permeabilización se llevó a cabo con metanol enfriado (100%) durante 10 min a -20 ° C y luego las células se incubaron a continuación en una solución de bloqueo que contiene 5% de albúmina de suero bovino (BSA) y 1% de Triton X-100 para 1 h a 37 ° C. Las células fueron incubadas con el anticuerpo LC3 durante 12 horas a 4 ° C seguido de anticuerpo secundario conjugado con FITC durante 1 hora a 37 ° C. Los núcleos se tiñeron con DAPI (1 mg /ml) durante 10 min a 37 ° C. Las imágenes de fluorescencia fueron capturados por LSM 700 confocal microscopio de escaneo láser (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania).
MDC tinción
MDC tinción también se llevó a cabo por un procedimiento similar al descrito anteriormente [30 ]. Las células se fijaron con 3% PFA durante 10 min a 37 ° C, y después se incubaron con 50 monodansylcadaverine mu M (MDC), un compuesto autofluorescente que etiqueta vacuolas autofágicas a 37 ° C durante 10 min. Fluorescente imágenes fueron capturadas por Olympus BX51 microscopio de fluorescencia (Center Valley, PA, EE.UU.).
anexina V y PI tinción
Las células fueron tratadas con concentraciones tan indicadas de MML y /o inhibidores de caspasas ( inhibidores, 3-MA, PFT-α) durante 24 h, y se recogieron usando tripsina-EDTA. Después de la tinción con FITC-conjugado de Anexina V y yoduro de propidio (PI), se midieron las células apoptóticas usando flujo Beckman Coulter FC500 Cytomics citómetro (Beckman Coulter, Miami, FL, EE.UU.).
interferencia de ARN
pLKO.1 plásmido lentiviral de expresión que contiene shRNA contra Beclin-1 (TRCN0000033552) y p53 (TRCN0000003753), (Beclin-1; 5'-CCGGCTCAAGTTCATGCTGACGAATCTCGAGATTCGTCAGCATGAACTTGAGTTTTTG-3 ', p53; 5'-CCGGCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGTTTTT-3') fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Misión shRNA). Las partículas virales se generaron en 294T de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las células fueron transfectadas con pLKO.1 shBeclin-1, VSVG y vectores de la mordaza. a continuación, sopa viral se inyecta a la célula A549 y se incuba durante 12 h. células A549 infectadas con virus fueron seleccionados por tratamiento puromicina dihidrocloruro y se utilizaron las células seleccionadas para experimentos. pLKO.1 shRNA control de vectores (Misión shRNA, SHC002) se utilizó como control.
El análisis estadístico
Todos los datos se expresan como medias ± SEM de tres experimentos independientes en cada grupo. Se evaluaron las diferencias entre cada uno de los grupos de Student con
t-test y
* p & lt; 0,05 se consideró para mostrar significación estadística
Resultados
Efecto de la MML sobre la viabilidad celular de. diversas líneas celulares de cáncer humano
Para evaluar los efectos de MML sobre el crecimiento celular de diversas líneas celulares de cáncer humano, humano A549 del cáncer de pulmón (Fig. 1B), el cáncer de mama humano MCF-7 (Fig. 1C), humanos HCT116 de cáncer de colon (Fig. 1D) y U2OS osteosarcoma humano (Fig. 1E) las células fueron tratadas con MML a diferentes concentraciones durante 12 h o 24 h y a continuación, seguidos por ensayos de MTT. los resultados del ensayo MTT demostraron tratamiento MML que la proliferación celular significativamente inhibido en la dosis y de forma dependiente del tiempo en estas líneas celulares de cáncer. Para comprobar adicionalmente el efecto de MML sobre la proliferación celular de las células A549, las células se trataron con MML a diferentes concentraciones durante 24 h y después se sometieron a tinción con azul tripán. El resultado reveló una inhibición significativa de la proliferación celular mediante el tratamiento MML de una manera dependiente de la dosis (Fig. 1F).
MML desencadena la apoptosis dependiente de caspasa en células A549
Para determinar si MML- citotoxicidad inducida en las células A549 se debió a la apoptosis, después del tratamiento MML a diferentes concentraciones durante 24 h o 60 M de tratamiento MML para diferentes períodos de tiempo, la población apoptótica se analizó por Anexina V /PI doble tinción. células anexina V /PI-positiva se incrementaron notablemente en la dosis y de forma dependiente del tiempo (Fig. 2A-C) que indica el efecto apoptótico de MML en células A549. análisis de citometría de flujo también reveló que el tratamiento incrementó MML acumulación de células en la fase sub-G1 de apoptosis de una manera dependiente de la dosis. El número de células en fase G2 /M también aumentó de una manera dependiente de la dosis (S1 Figura). Para confirmar aún más el efecto de la MML en la inducción de apoptosis en las células A549, caspasa-3 y la activación de poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) de escisión fueron investigados por inmunotransferencia con sus anticuerpos. La caspasa-3, un ejecutor clave en la maquinaria apoptótica, se escinde muchas proteínas indispensables para la supervivencia celular y se activa a través de la escisión en dos fragmentos (17 kDa y 19 kDa) por la caspasa-8 y /o caspasa-9 durante la apoptosis [31], [32]. Caspasa-3 activada escinde posteriormente proteínas celulares, incluyendo la PARP, lo que conduce a la muerte celular apoptótica. PARP desempeña un papel vital en el mantenimiento de la integridad genómica y es la principal proteína para ser proteolizada por la caspasa-3 durante la apoptosis [32]. Como se muestra en la Fig. 2D, caspasa-3 y PARP divisiones se incrementaron claramente después de 60 M de tratamiento MML durante 24 h, lo que indica que la apoptosis inducida a través de MML caspasa-3 y PARP activación de escisión en las células A549. La caspasa-8 y la caspasa-9 juegan un papel crucial en la inducción de la apoptosis a través de la muerte mediada por el receptor (extrínseca) y las vías mitocondriales (intrínsecos), respectivamente [31], [32]. Se requiere la escisión de la subasta para la diafonía entre las vías intrínsecas y extrínsecas [31], [32]. Para desentrañar la vía por la que MML induce la apoptosis en las células A549, el contenido de proteína de la caspasa-8 y la caspasa-9 fueron analizados por análisis de inmunotransferencia. Como se muestra en la Fig. 2D, el tratamiento MML aumentó las formas escindidas (18 kDa y 43 kDa) de la caspasa-8, pero no activar la caspasa-9 y Bid divisiones, lo que indica que MML inducida por la activación de la caspasa-8 en células A549. Para confirmar aún más si la apoptosis inducida por MML era dependiente de caspasa, el porcentaje de células apoptóticas fue verificada por Anexina V-PI doble tinción después de un tratamiento de 24 h con varios inhibidores de caspasas, tales como Z-VAD-FMK (inhibidor de pan-caspasa ), Z-DEVD-FMK (caspasa-3 inhibidor), Z-IETD-FMK (caspasa-8 inhibidor) y Z-LEHD-FMK (caspasa-9 inhibidor). Como se muestra en la Fig. 2E, el análisis de citometría de flujo reveló que la apoptosis inducida por MML fue rescatado por el inhibidor pan-caspasa, caspasa-3 y caspasa 8 inhibidores en comparación con el tratamiento MML solo, pero no por el inhibidor de la caspasa-9. Un resultado similar también fue obtenido de ensayo MTT (Fig. 2F). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la apoptosis inducida por MML es impulsado principalmente por vía extrínseca en lugar de vía intrínseca.
células A549 (A) se trataron con la MML como concentraciones indicadas (0-60 mM) para 24 h y luego teñidas con FITC-anexina V y PI conjugado. Las células apoptóticas se midieron por citómetro de flujo. (B) las células A549 se trataron con 60 mM de MML para una manera dependiente del tiempo. Las células apoptóticas fueron teñidas con anexina V y PI y detectado usando citómetro de flujo. gráfico (C) La barra indica el porcentaje de células apoptóticas (forma dependiente de la dosis; arriba, forma dependiente del tiempo; abajo). población de apoptosis fue evaluada por Anexina V positivo, negativo PI (AV + /PI, barra blanca) y la anexina V y PI doble positivo (AV + /PI +, barra de color negro) células apoptóticas. (D) Las células fueron tratadas con la MML como concentraciones indicadas (0-60 mM) para 24 h y análisis de transferencia Western se realizó para comprobar marcador de apoptosis, la caspasa-3, -8, -9, Bid y PARP-1/2, respectivamente. GAPDH se utilizó como control de carga de análisis de transferencia de Western. (E) Las células fueron pretratadas con o sin cada inhibidor de caspasas Z-VAD-FMK (30 mM), Z-DEVD-FMK (30 mM), Z-IETD-FMK (30 M) y Z-LEHD-FMK (30 M) durante 1 h y después se trató con MML (60 M) durante 24 h. Las células apoptóticas se tiñeron con anexina V y PI y luego poblaciones fueron detectados por citómetro de flujo. (F) Las células fueron tratadas con inhibidores de caspasas y MML en las mismas condiciones que el análisis de citometría de flujo y a continuación, la viabilidad celular se midió por el ensayo MTT. Los gráficos de barras indican el porcentaje de viabilidad celular (parte superior) y el porcentaje de células apoptóticas (parte inferior), respectivamente. población de apoptosis fue evaluada por Anexina V positivo, negativo PI (AV + /PI, barra blanca) y la anexina V y PI doble positivo (AV + /PI +, barra de color negro) células apoptóticas. Todos los datos se expresan como media ± SEM de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,01 en comparación con el control;
#p. & Lt; 0,05 en comparación con el grupo tratado con MML
MML desencadena la autofagia en las células A549
compuestos naturales derivados de plantas son conocidos por ejercer sus efectos contra el cáncer mediante la inducción de la autofagia en células de cáncer humano [7]. La autofagia es un proceso catabólico de formación de vesículas de doble membrana, denominada autofagosomas [33]. Para investigar si la MML desencadena la autofagia en las células A549, se comprobaron los cambios morfológicos después del tratamiento MML. Como se muestra en la Fig. 3A, extensa vacuolización citoplasma y formaciones de vacuolas autofagosoma similar en las células A549 tratadas con MML se observaron bajo el microscopio de contraste de fase. Para confirmar la inducción de la autofagia por MML, la tinción de MDC y la proteína asociada a los microtúbulos 1 luz de la cadena 3 (LC3) inmunotinción usando anticuerpos fluorescentes a LC3 se llevaron a cabo. MDC y LC3 se conocen como marcadores específicos de vacuolas y autofagosomas autofágicas, respectivamente, y la formación de puntos lagrimales de LC3 en el autophagosome se puede observar por microscopía confocal, que se utiliza ampliamente como método fiable capaz de detectar la autofagia [33]. Como se muestra en la Fig. 3A, las células de control no tratadas MML-mostró difunde MDC-tinción, mientras que las células A549 tratadas con MML resultaron en un aumento de la intensidad de fluorescencia indica una extensa vacuolas autofágicas MDC-positivos. Por otra parte, el aumento de la localización subcelular de LC3 punteada también se detectó en las células A549 tratadas con MML comparación con las células de control sin tratar y la formación de puntos lagrimales LC3 se aumentó de una manera dependiente del tiempo (Fig. 3B). Para determinar adicionalmente la formación autophagosome en las células tratadas con MML, los cambios en las tres principales marcadores relacionados con la autofagia, LC3-II, Beclin-1 y ATG7, se analizaron por inmunotransferencia. ATG7 y los niveles de proteína LC3-II se incrementaron notablemente en una forma dependiente de la dosis mediante el tratamiento MML, pero Beclin-1 planta fue aumentada ligeramente (Fig. 3C). En conjunto, estos datos muestran que definitivamente MML induce la formación autophagosome en células A549.
células A549 (A) se trataron con 60 mM de MML para 24 h y luego imágenes morfológicas fueron capturados por microscopio de contraste de fase (400 ×, ORDENADOR PERSONAL). Las flechas indican las vacuolas autofagosoma endógenas similares (izquierda) y gráfico de barras que indica el número de vacuolas por célula. Las células se trataron con MML (60 micras, 24 h) y a continuación, las células se tiñeron con MDC y el anticuerpo LC3, respectivamente. MDC (brillante color, medio) las imágenes fueron capturadas por el microscopio de fluorescencia y LC3 (verde, derecha) imágenes fluorescentes se detectaron mediante microscopio confocal (bar; 10 micras). gráfico de barras indica la intensidad de fluorescencia de FITC LC3. (B) Las células se trataron con MML (60 M) para diferentes periodos de tiempo (0 a 24 h) y la tinción de inmunofluorescencia LC3 se realizó para detectar autofagosomas. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Las imágenes fueron capturadas utilizando microscopio confocal (bar; 10 micras). células A549 (C) se trataron con diversas concentraciones de MML (0-60 mM) durante 24 h. a continuación, se realizó análisis de transferencia de Western con anticuerpos contra ATG7, Beclin-1 y LC3, respectivamente. GAPDH se utilizó como control de carga. gráfico de barras que indica el análisis de densitometría de la relación de GAPDH LC3-II /. las células A549 se trataron con diferentes concentraciones de MML (0-60 mM) durante 24 h (D) o 60 mM de MML para el curso de tiempo diferente (E) y luego análisis de inmunotransferencia se realizó usando anticuerpos contra p62 y LC3, respectivamente. GAPDH se utilizó como control de carga. (F) células A549 se pre-incubaron con o sin cloroquina (CQ, 25 mM) durante 1 h, después se trató con MML (60 M) durante 24 h. El análisis de transferencia Western se realizó utilizando anticuerpos como se indicó anteriormente. GAPDH se utilizó como control de carga de transferencia Western. Todos los datos se expresan como media ± SEM de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 y ** p & lt;. 0,01 comparado con el control
Se sabe que autofagosomas también se acumulan cuando flujo autophagic indicando todo el proceso de autofagia es ineficiente [35], [46]. Para evaluar si MML afecta el flujo de autofagia en las células A549, el nivel de proteína p62 que se utiliza para controlar el flujo de autofagia [35], [46] se comprobó mediante inmunotransferencia con su anticuerpo. Como se muestra en la Fig. 3D y 3E, el nivel de p62 se disminuyó notablemente por el tratamiento MML de una manera dosis-y tiempo-dependiente. Por otra parte, para evaluar los efectos de la MML en la rotación de la vesícula autofagia, los niveles de proteína de p62 y LC3 II se comprobaron mediante inmunotransferencia después de un tratamiento de 24 h con cloroquina (CQ) conocido como inhibidor de la degradación lisosomal. Como se muestra en la Fig. 3F, el pretratamiento con CQ aumentó significativamente los niveles de p62 y LC3 II comparación con el tratamiento MML solo. Estos resultados sugieren claramente que el tratamiento MML no interfirió con la rotación de la vesícula autofagia. En conjunto, estos resultados indican ciertamente que MML induce la autofagia sin menoscabo de flujo autofagia en las células A549.
La inhibición de la autofagia por el inhibidor de la autofagia o desmontables de Beclin-1 suprime mediada por MML celular apoptótica de la muerte
recientemente se ha documentado que la inhibición por un inhibidor de la autofagia autofagia específico, tal como 3-metiladenina (3-MA), puede promover la apoptosis en las células cancerosas humanas [35] - [38]. Por lo tanto, se investigó el efecto de 3-MA en la formación de LC3 puntos lagrimales y vacuolas autofágicas en las células A549 tratadas con MML. La distribución puntiforme LC3 y la formación de autofagosomas MDC-positivas en las células inducidas por MML fueron notablemente suprimida por el tratamiento 3-MA (Fig. 4A). Además, la co-tratamiento con MML y 3-MA inhibió significativamente no sólo la acumulación de LC3-II, sino también la caspasa-3 y PARP divisiones (Fig. 4B). Entonces nos registramos el efecto de 3-MA en la inducción de la apoptosis mediante Anexina V /PI tinción doble. Anexina V /PI-células positivas se redujeron marcadamente en las células co-tratados con MML y 3-MA, en comparación con los tratados con MML solo (Fig. 4C). Resultados similares fueron obtenidos por co-tratamiento de la MML con CQ (Fig. 4D). Estos resultados revelan que, obviamente, la inhibición de la autofagia por 3-MA y CQ podría suprimir la apoptosis inducida por MML en células A549.
(A) células A549 se pre-incubaron con o sin 3-MA (10 mM) durante 3 h y después se incubaron con MML (60 M) durante 24 h. Las células se tiñeron con MDC (color brillante) o anticuerpo LC3 (verde), respectivamente. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Se obtuvieron imágenes fluorescentes que usa el microscopio confocal (bar; 10 micras). (B) Las células se trataron previamente con o sin 3-MA durante 3 h antes del tratamiento de MML (60 M) durante 24 h. El análisis de transferencia Western se realizó con anticuerpos contra LC3, PARP-1/2 y la caspasa-3, respectivamente. GAPDH se utilizó como control de carga. Los gráficos de barras indican la relación de exfoliados caspasa-3 /GAPDH y LC3-II /GAPDH, respectivamente. células A549 (C) se trataron previamente 3 h con o sin 3-MA y se trataron con MML (60 M) durante 24 h y las células se tiñeron con FITC conjugado con Anexina V /PI y luego medida por FACS. gráfico de barras que indica el porcentaje de células apoptóticas. Porcentaje de células apoptóticas fue evaluada por anexina V positiva y negativa PI (AV + /PI-, barra blanca) y anexina V y PI doble positivo (AV + /PI +, bar negro) de las células apoptóticas. (D) Las células se trataron previamente con o sin CQ durante 1 h y después se incubaron con MML para 24 h. análisis de inmunotransferencia se realizó usando anticuerpos como se indica antes. Las células se trataron con CQ y MML en las mismas condiciones como se ha mencionado antes y después de la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT (abajo). gráfico de barras que indica el porcentaje de viabilidad celular. Todos los datos se expresan como media ± SEM de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,01 en comparación con el control;
#p. & Lt; 0,05 en comparación con el grupo tratado con MML
Más inhibición específica de la vía de la autofagia puede lograrse por nocaut o desmontables de relacionados con la autofagia-(
ATG
) genes y
Beclin-1