Extracto
reordenamiento genético de la
ROS1
tirosina quinasa del receptor fue identificado recientemente como una firma molecular distinta de pulmón de células no pequeñas humano cáncer (NSCLC). Sin embargo, la evidencia directa de la carcinogénesis pulmonar inducida por
ROS1
genes de fusión aún no se ha verificado. El presente estudio muestra que
EZR-ROS1
juega un papel esencial en la oncogénesis del NSCLC que alberga el gen de fusión.
EZR-ROS1
se identificó en cuatro pacientes de sexo femenino de adenocarcinoma de pulmón. Tres de ellos nunca fueron fumadores. deleción intersticial 6q22-q25 del dio lugar a la fusión de genes. La expresión de la quinasa de fusión en células NIH3T3 inducida por el crecimiento independiente de anclaje
in vitro
, y tumores subcutáneos en ratones desnudos. Esta capacidad de transformación fue atribuible a su actividad quinasa. El /MET /ROS1 inhibidor de la quinasa, crizotinib, suprimió el crecimiento independiente de anclaje de fusión inducida por ALK de células NIH3T3. Lo más importante, establecidas líneas de ratones transgénicos que expresan específicamente EZR-ROS1 de pulmón en células epiteliales alveolares desarrollaron múltiples nódulos en ambos pulmones de adenocarcinoma en una edad temprana. Estos datos sugieren que el
EZR-ROS1
es un oncogén clave en NSCLC humano, y que este modelo animal podría ser valiosa para explorar agentes terapéuticos contra el
ROS1
-rearranged cáncer de pulmón.
Visto: Arai Y, Totoki Y, Takahashi H, H Nakamura, Hama N, Kohno T, et al. (2013) modelo de ratón para ROS1 con reordenamientos del cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (2): e56010. doi: 10.1371 /journal.pone.0056010
Editor: John D. Minna, Univesity de Texas Southwestern Medical Center en Dallas, Estados Unidos de América
Recibido: 3 de octubre de 2012; Aceptado: January 4, 2013; Publicado: 13 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Arai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por el Programa de Promoción de Estudios Fundamentales en Ciencias de la Salud del Instituto Nacional de Innovación Biomédica, Centro Nacional del cáncer de Investigación y fondos de desarrollo (23-a-7 y la 23-B-28), Beca de Investigación del cáncer de Investigación de la princesa Takamatsu Fondo y subvenciones-en-Ayudas del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar para la 3ª plazo exhaustiva estrategia de 10 años para el control del cáncer. Centro Nacional del Cáncer Biobanco es apoyado por el Fondo de Investigación y Desarrollo Centro Nacional del Cáncer, Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. Adenocarcinoma de pulmón (LADC), la forma más común de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), comprende varios subconjuntos diferentes genómicas definidas por las alteraciones oncogénicas únicas, y una proporción considerable de casos LADC puerto alteraciones de controlador en el
EGFR, KRAS Opiniones y
ALK
genes en la forma mutuamente exclusiva con raras excepciones [2] - [5]. La comprensión de las bases moleculares del cáncer nos permite desarrollar agentes terapéuticos que se dirigen a las aberraciones druggable genéticos identificados en los genomas del cáncer. inhibidores de la tirosina quinasa (TKIs) que se dirigen a las proteínas EGFR y ALK son particularmente eficaces en el tratamiento de LADC llevar a
EGFR
mutaciones y
ALK
fusiones, respectivamente [2] - [6]. Sin embargo, el desarrollo de un TKI eficaz requiere la validación experimental de las aberraciones genéticas como procesable y druggable. modelos de ratones transgénicos que albergan
EGFR
mutaciones o
EML4-ALK
fusiones de genes han demostrado con éxito el potencial oncogénico de las alteraciones y la eficacia de la terapia de TKI [7], [8]. reordenamiento genético de la
ROS1
fue identificado recientemente como una firma molecular distinto para LADC humana [9] - [16]. En el presente estudio, hemos establecido un modelo de ratón de
ROS1 sobre Fusion, y demostraron que
EZR-ROS1
como un oncogén motor esencial en la carcinogénesis pulmonar.
identificación de EZR-ROS1 gen de fusión en LADC de los no fumadores
Todo el transcriptoma secuenciación de alto rendimiento de muestras de tumor es uno de los métodos más eficaces para identificar los oncogenes de fusión [17]. El análisis de cinco casos LADC de los no fumadores sin
EGFR /KRAS /ALK
alteraciones utilizando secuenciación del transcriptoma identificaron 56 lee anulando el en marco
EZR-ROS1
punto de fusión de genes de conexión
EZR
exón 10 a
ROS1
exón 34 en un tumor. análisis RT-PCR de los tejidos no cancerosos emparejados confirmó la expresión específica del tumor de la transcripción de la fusión (Figura 1A). Además, la secuenciación del transcriptoma demostró claramente un aumento específico en la expresión de la "parte fusionada 3 de
ROS1 gratis (exones 34 a 43) después de que el punto de interrupción, lo que sugiere que el
EZR-ROS1 sobre Fusion transcripción provoca la sobreexpresión aberrante de
ROS1
dominio tirosina quinasa junto con la porción 5 'del
EZR gratis (Figura 1B). SNP serie de datos de hibridación genómica comparada (CGH array) demostraron que este gen de fusión se genera mediante una gran deleción intersticial abarca ~41.5 Mb en el cromosoma 6q22-q25 (Figura 1C). Genómica PCR y análisis de secuenciación revelaron también la supresión de 41,5 Mb provocando fusiones somáticas del
EZR
intrón 10 en 6q25 con el
ROS1
intrón 33 en 6q22 (Figura S1).
(A) Junction lee en representación de
EZR-ROS1
transcripciones de fusión de la muestra LCY66T (izquierda). Sanger de secuenciación del producto de RT-PCR validado transcripción de fusión en el marco específico de tumor (derecha). m: marcadores moleculares. perfiles (B) Expresión de
EZR
y
ROS1
en LCY66T. Se observó expresión activa del gen
ROS1
después del punto de fusión. (C) SNP array CGH análisis de la LCY66T. el número de copias en todo el cromosoma 6 se representa como la relación log2.
RT-PCR y secuenciación de Sanger análisis de 569 muestras LADC de individuos japoneses, incluyendo los casos antes mencionados (343 casos con estadio temprano y patológica 226 casos con estadio avanzado), identificaron cuatro casos que albergan este transcrito de fusión (Figura S2). Todos los cuatro
EZR-ROS1
casos de fusión-positivos fueron del sexo femenino, y albergaban ni
EGFR
/
KRAS /HER2
mutaciones ni
EML4-ALK /KIF5B-RET
fusiones. Tres casos fueron adenocarcinomas pobremente diferenciados de los fumadores nunca, y el otro era un adenocarcinoma moderadamente diferenciado de un fumador.
La transformación de la actividad de EZR-ROS1
EZR-ROS1
ADNc aislado de la pieza tumoral codifican una proteína de 858 aminoácidos (Figura 2A; número de acceso del GenBank /DDBJ AB698667). La proteína se conecta el dominio FERM [18] de ezrin (EZR) con los dominios transmembrana y de cinasa de ROS1, pero carece de la mayor parte del dominio enrollado de la bobina de EZR.
(A) Representación esquemática de EZR, ROS1 Esd-ROS1 y supresiones /mutaciones de los genes EZR-ROS1. se muestra la organización del dominio. C-C: dominio espiral de la bobina; TM: transmembrana; C-ERMAD: ERM C-terminal de dominio asociado. (B) la fosforilación en ROS1 de tipo salvaje y mutante EZR-ROS1 (E /R) expresando clones NIH3T3. Los lisados celulares de cada clon se inmunotransfirieron con anti-V5-tag (arriba) y ROS1 anti-fosforilada (Tyr-2274, parte inferior) de anticuerpos. (C) La supresión de ROS 1 actividad quinasa de EZR-ROS1 por crizotinib inhibe la activación de STAT3. Las células NIH3T3 transfectadas con 1: vector vacío, 2: de tipo salvaje EZR-ROS1, 3: KD 4: DL1, 5: DL3 fueron privadas de suero y se trataron durante 2 horas con DMSO o 1 M de crizotinib, y immunoblotted con los anticuerpos correspondientes . β-actina se utilizó como control de carga. E /R: EZR-ROS1, p-E /R: fosforilada EZR-ROS1 detecta con un anticuerpo anti-fosfotirosina-2274 de ROS1. (D) la formación de colonias en agar blando de tipo salvaje y mutante EZR-ROS1 expresando clones NIH3T3. Una imagen representativa de la formación de colonias de cada clon se representa en la parte superior (barra de escala, 100 micras). El número de colonias obtenidas para cada clon se representa en la parte inferior. * P & lt; 0,05. la supresión del crecimiento independiente de anclaje de células NIH3T3 que expresan EZR-ROS1 (E) crizotinib inducida. Gráfico de barras que muestra el porcentaje de colonias NIH3T3 inducidas por
EZR-ROS1
o
CCDC6-RET
después del tratamiento con 200 nM de crizotinib o vandetanib con respecto a los formados por las células tratadas con DMSO. EZ-ROS: EZR-ROS1, C6-RET: CCDC6-RET. * P & lt; 0,05. (F) imágenes representativas de los ratones por vía subcutánea trasplantados con células NIH3T3 que expresan de tipo salvaje, mutada de dominio quinasa, o amino-terminal-elimina EZR-ROS1. Un clon NIH3T3 EML4-ALK-expresión se utilizó como control positivo. El número de tumores por inyección en cada transfectante se muestra debajo de las fotografías.
Para examinar la actividad oncogénica de la
EZR-ROS1 sobre Fusion
in vitro
, establecimos clones NIH3T3 estables que expresan de tipo salvaje EZR-ROS1 y quinasa muertos mutante EZR-ROS1 (KD), en la que el residuo de lisina de unión a ATP fue mutado a metionina (K491M), así como mutantes con amino-terminal en serie borrado FERM dominios (DL1, DL2 y DL3; Figura 2A). La autofosforilación de residuos de tirosina específicos es un evento crucial en la activación de distintas vías de transducción de señales, y Tyr-2274 de ROS1 es un sitio de autofosforilación específica esencial para inducir la actividad de la quinasa para la transformación [19]. En los ensayos de transformación, la fosforilación de la Tyr-2274 (correspondiente a Tyr-785 en la fusión de tipo salvaje EZR-ROS1) se observó en una de tipo salvaje clon EZR-ROS1-expresión, pero no se detectó en la quinasa muerta (KD) y suprimido (DL) mutantes; esto implica que la porción amino-terminal de FERM (1-88 aminoácidos) es necesaria para la activación ROS1 quinasa (Figura 2B). De tipo salvaje
EZR-ROS1
pero no KD mutantes /dl indujeron específicamente la activación de STAT3 para la señalización aguas abajo, y producen el crecimiento independiente de anclaje de manera significativa (Figura 2C, D). El crecimiento independiente de anclaje inducida por
EZR-ROS1
fue suprimida por el tratamiento con crizotinib, un TKI contra ALK /MET /ROS1, mientras que el crecimiento inducido por otro oncogén de pulmón,
CCDC6-RET
[11] no era (Figura 2E). Por el contrario, vandetanib, un TKI contra RET /EGFR /VEGFR fue eficaz en la inhibición de la formación de colonias de CCDC6-RET células que expresan, pero no en las células que expresan EZR-ROS1. Como se muestra en la Figura 2C, el tratamiento crizotinib suprimió la fosforilación de EZR-ROS1, e inhiben la activación de STAT3.
A continuación, las células NIH3T3 se inyectaron subcutáneamente en ratones inmunocomprometidos. clones de tipo salvaje EZR-ROS1 que expresan los tumores producidos invariable (6/6), mientras que ninguno de los mutantes KD y DL-expresando clones producidos tumores (Figura 2F), lo que confirma que
in vivo
actividad tumorigénico de
EZR-ROS1
requiere la actividad quinasa ROS1.
Desarrollo de LADC en ratones transgénicos EZR-ROS1
a fin de evaluar el papel de los
EZR-ROS1 Hoteles en carcinogénesis de pulmón, hemos generado ratones transgénicos que expresan el gen de fusión bajo el control de un promotor de tipo 2 alveolar-epitelio específico del gen tensioactivo C [20] (Figura 3A). Se obtuvieron cuatro líneas independientes (TGA, B, C y D) con diferente número de copias del transgen (Figura S3) y se detectaron nódulos adenocarcinoma de pulmón en todas las líneas examinadas, excepto TGD. Análisis del nivel de expresión de proteínas de fusión entre ellos no reveló ninguna expresión en TGD (figura S4). La tasa de natalidad de progenie transgenes positivo fue baja en TgC (transgen positivo número de familias F1: número total de F1; 1:03), y que no pudo mantener una línea TgC, a continuación, se analizaron principalmente una línea (TGA), el cual alberga aproximadamente cuatro copias del transgén. RT-PCR y análisis de inmunotransferencia verifican
EZR-ROS1
la expresión de ARNm y proteína-pulmonar específica, e indicaron la fosforilación de la proteína de fusión EZR-ROS1 (Figura 3B). Aunque endógena de
Ezrin
se expresa de forma ubicua en muchos tejidos, endógena de
ROS1
-transcript se detectó sólo en el estómago, riñón y pulmón. los niveles de expresión de la proteína endógena de ROS1 eran muy débiles en comparación con los niveles del gen de fusión en los ratones transgénicos (Figura S4). Incluso a las cuatro semanas de edad, múltiples lesiones fueron detectadas más de 1 mm de diámetro en los ratones transgénicos, y los tumores ocuparon más del 40% de la superficie seccionada de pulmón (Figura 3C y Figura S5). examen de tomografía computarizada detecta múltiples nódulos en ambos pulmones, y los ratones mostraron disminución de la supervivencia (Figura 3D, E). El examen histológico de los tumores de pulmón en las líneas de ratones transgénicos demostró general los adenocarcinomas con patrón papilar /lepidic crecimiento (Figura 3C). Estas lesiones mostraron ser adenocarcinomas invasivos con actividad mitótica moderada según lo revelado por positiva Ki-67 tinción (Figura S6A). Sin embargo, en algunos casos de las líneas de TGB, se observó acumulación de mucina citoplasmática en las células tumorales (Figura S6B).
(A) Representación esquemática de la
SP-C /EZR-ROS1 /poli A
transgén. (B) Expresión de la exógeno
EZR-ROS1
gen en ratones transgénicos. RT-PCR (parte superior) y análisis de inmunoblot (parte inferior) de tejidos de ratón reveló que EZR-ROS1 se expresa específicamente en los pulmones de dos ratones transgénicos (TgA21 y TgA25). HT: corazón, LV: hígado, ST: estómago, SP: bazo, KD: riñón, LG: pulmón (C) Representante análisis histológico de las lesiones pulmonares en ratones transgénicos. tinción con hematoxilina-eosina muestra lesiones extendidas tanto en ratones de fusión-positivo 4 semanas de edad y 15 semanas de edad. Tg: fusión-positivo, CR: fusión-negativas. Barra de escala, 100 micras. se detectaron (D) La tomografía computarizada (izquierda) de los pulmones en TgA04 ratón en la semana 19. Las lesiones mejoradas en ambos pulmones. lesiones nodulares múltiples (derecha) se observaron en la superficie pleural del pulmón en TgC01 ratón en la necropsia. curvas (E) de supervivencia de los ratones transgénicos y de control generados utilizando el método de Kaplan-Meier.
A pesar de la presencia de múltiples tumores en los pulmones de los ratones transgénicos, no se logró detectar metástasis a distancia en la necropsia en TGA, B y C ratones. Por lo tanto, es probable que la expresión de
EZR-ROS1
por sí sola no es suficiente para hacer que las células del cáncer metastásico.
Discusión
Se identificó el
EZR- ROS1
como un oncogén controlador central en la carcinogénesis pulmonar. Ezrin se expresa de forma ubicua en muchos tejidos. En el
EZR-ROS1 sobre Fusion detectada por secuenciación de ARN de los casos LADC, 5 'porción de
EZR ¿Qué causa la sobreexpresión aberrante del dominio quinasa de
ROS1
. Ningún efecto evidente para los niveles de transcripción de la porción 3 'de
se observó EZR
. Esto podría ser atribuible al exceso de expresión del tipo salvaje
EZR
sobre el gen de fusión. También reveló que ROS1 activación de la quinasa en esta fusión requiere el dominio FERM N-terminal de EZR. asociados FERM con muchas proteínas diferentes, incluyendo fosfolípidos, las proteínas de andamiaje EBP50 y E3KARP, y otras proteínas asociadas a la membrana que pueden regular la dimerización u oligomerización de ezrin [21]. Muchas proteínas de fusión de cinasa, incluyendo ALK y RET, muestran actividad tirosina quinasa constitutiva atribuible a dominios de dimerización en la pareja de fusión amino-terminal [6], [22]. Sin embargo, otra proteína de fusión ROS1, FIG-ROS1, que se encuentra en el glioblastoma humano, colangiocarcinoma y el adenocarcinoma de pulmón, no mostró propiedades de dimerización, en lugar existente como monómero en la proteína de fusión a pesar de la retención de los dominios de doble arrollamiento y una cremallera de leucina [19 ]. Por lo tanto, los mecanismos moleculares que subyacen a la activación ROS1 por el dominio FERM sigue siendo poco clara.
Los ratones transgénicos mostraron una aparición de múltiples nódulos de adenocarcinoma en un punto temprano, y la rápida progresión de los tumores. Estas características son muy similares a los
EML4-ALK modelo
ratón [8]. Varios grupos informaron que el patrón cribiforme mucinoso y de células en anillo de sello son rasgos histológicos característicos de E
ML4-ALK
cáncer de pulmón humano positivo [23] - [25]. Recientemente, se investigó la histopatología de
ROS1
-Fusion cánceres de pulmón humanos positivos [16]. Aunque otros investigadores informaron que la función de células en anillo de sello no era común en
ROS1
-rearranged cánceres de pulmón [10], encontramos que el 53% de los casos albergaba cribiforme mucinoso o de células en anillo de sello características similares a la
ALK
cánceres de pulmón -rearranged pero que el resto mostró patrón de crecimiento papilar /lepidic.
EZR-ROS1
tumores -positivos parecía menos bien diferenciados, y mostraron mayor frecuencia características histológicas de cribiforme mucinoso o de células en anillo de sello. Nuestro modelo de ratón de
EZR-ROS1
cáncer de pulmón generalmente papilar demostrado /patrón de crecimiento lepidic, pero en algunos casos, se observó acumulación de mucina citoplasmática en las células tumorales, que se asemeja bastante a la histología característica reportados en
ROS1
cáncer de pulmón -rearranged. Actualmente no tenemos respuesta por qué sólo una parte de los ratones albergaba tumores con la acumulación de mucina.
El
EZR-ROS1
gen de fusión se detectó específicamente en muestras de cáncer de pulmón de mujeres que nunca habían fumado sin
EGFR, KRAS, España y
ALK
alteraciones. Se estima que ~ 2% de los pacientes de Blanco y las cohortes de cáncer de pulmón asiático tenía
ROS1
-rearrangements, que se producen a tasas significativamente más altas en no fumadores, las personas más jóvenes, las mujeres [10], [11], [dieciséis]. Aunque cada alteración es poco frecuente,
ROS1
fusiones con muchos tipos de genes asociados 5 '(
CCDC6, CD74, EZR, figura, KDELR2, LRIG3, SDC4, Slc34a2 y TPM3
) han sido reportados en el pulmón, el cerebro, el tracto biliar, y los cánceres de ovario [9] - [16], [26] - [28]. Estos
ROS1
-rearranged tumores podrían dirigirse terapéuticamente con inhibidores de quinasas específicas, incluyendo crizotinib [10], [14], [27], [29]. Dos pacientes LADC tenían una notable respuesta clínica a crizotinib [10], [14]. Por lo tanto, nuestro
EZR-ROS1
modelo animal de cáncer de pulmón podría ser valiosa para evaluar el potencial terapéutico de estos compuestos y de nuevos fármacos, así como características biológicas de
ROS1
-rearranged cáncer de pulmón
in vivo.
Materiales y Métodos
muestras clínicas
las muestras de tejido de pacientes con cáncer de pulmón fueron proporcionados por el Centro de cáncer Nacional de Biobancos, Japón. ADN genómico de alto peso molecular y el ARN se extrajeron a partir de muestras de tumor fresco congelado y tejidos del pulmón no cancerosas. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Ético del Centro Nacional del Cáncer, Tokio, Japón.
Análisis del transcriptoma Whole-secuencia de datos
Bibliotecas de inserto de ADNc (150-200 pb) se preparó a partir de 2 g de ARN total usando el kit de preparación de la muestra mRNAseq (Illumina). Las bibliotecas se sometieron a secuenciación de extremo emparejado de 50 pb en el HiSeq2000 (Illumina), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. -Extremo emparejado lecturas fueron asignadas a las secuencias de ARN conocidos en la RefSeq, Ensembl bases de datos, y LincRNA utilizando el programa de Bowtie como se describe anteriormente [30].
RT-PCR, PCR y secuenciación genómica
El ARN total se transcribe inversamente en ADNc utilizando Superíndice III (Life Technologies). ADNc o ADN genómico se sometió a amplificación por PCR utilizando Ex-Taq (Takara Bio) y cebadores EZR-e10-CF1 (GAAAAGGAGAGAAACCGTGGAG) y ROS1-e34-CR1 (TCAGTGGGATTGTAACAACCAG). Los productos de PCR se secuenciaron directamente mediante secuenciación de Sanger usando el kit de terminador BigDye (Life Technologies).
SNP matriz CGH Análisis
cromosómico número de copias para que los tumores se determinó usando arrays de alta resolución de SNP ( matriz GeneChip Mapping 250K-NSP, Affymetrix). El ADN genómico se marcó y se hibridó con los arrays de SNP de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y el número de copias se calcula a partir de las señales de hibridación utilizando el programa de GCNA [31].
vector de clonación, y la generación de mutantes de eliminación y el punto
La región de codificación de
EZR-ROS1
ADNc se obtuvo mediante amplificación por PCR a partir de ADNc tumor LCY66 usando Phusion Taq polimerasa (New England Biolabs) y los cebadores EZR-H1F1 (CACCATGCCGAAACCAATCAATGTCCGAGTT) y ROS1-H1R1 ( ATCAGACCCATCTCCATATCCACTGTG).
EML4-ALK
ADNc y
CCDC6-RET
ADNc se amplificaron a partir de un
EML4-ALK-positivo
muestra de cáncer de pulmón primario (E13; A20) y de un
CCDC6-RET
-positivo muestra primaria del cáncer de pulmón (C1; R12), respectivamente. Los productos de PCR se subclonaron en un pcDNA3.1D-V5-His plásmido (Life Technologies). La sustitución de lisina con metionina en el codón 491 en el gen
EZR-ROS1
se realizó con un kit de mutagénesis dirigida al sitio Primestar (Takara Bio). mutantes de deleción N-terminal del dominio FERM de
EZR-ROS1
de ADNc se construyeron mediante PCR utilizando los cebadores EZR-FERM-AF (CACCATGGTGGCTGAGGAGCTCATCCAGGACATC) y ROS1-H1R1 para DL1, EZR-FERM-BF (CACCATGATCAACTATTTCGAGATAAAAAACAAG) y ROS1-H1R1 para DL2, y EZR-FERM-CF (CACCATGACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGC) y ROS1-H1R1 para DL3. Los plásmidos se transfectaron en células NIH3T3 usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Life Technologies), y los clones estables se aislaron por selección con G418 (0,7 mg /ml). Para el ensayo de formación de colonias, se embebieron células y se cultivaron en agar blando 0,4% por triplicado y se contó el número de colonias después de 21 días. La cuantificación de crecimiento independiente de anclaje bajo la condición con o sin crizotinib (S1068, Selleck) y vandetanib (S1046, Selleck) después de 9 días se realizó con CytoSelect-96 kit (célula Biolabs). La solución de compuesto se añadió a la capa superior de agar blando cada 3 días.
Análisis de inmunotransferencia
lisados de células enteras se extrajeron con CelLytic M de reactivo (# C2978, Sigma), y se sometieron a SDS -PAGE seguido de transferencia a una membrana de PVDF. La detección de transferencias de Western se realizó con el kit WesternBreeze quimioluminiscente inmunodetección (Life Technologies) utilizando anticuerpos primarios contra ROS1 (# 9202, Cell Signaling Technology), fosforilada-ROS1 (Tyr2274) (# 3078, Cell Signaling Technology), STAT3 (# 610189, BD), fosforilada-STAT3 (Tyr705) (# 9138, Cell Signaling Technology), p44 /42 MAPK (# 4695, Cell Signaling Technology), fosforilada p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) (# 9106, Cell Signaling Technology) , Ezrin (# 4135, Cell Signaling Technology), p53 (# 6243, Santa Cruz), y b-actina (# A5441, Sigma).
represión de ROS 1 quinasa La actividad de EZR-ROS1 por crizotinib
las células NIH3T3 transfectadas (vector vacío, de tipo salvaje EZR-ROS1, mutantes KD /dl) se mantuvieron en ayunas de suero durante 2 horas, después se añadió durante 2 h con 1% de DMSO o crizotinib 1 M, a continuación, el medio de cultivo se cambiado con medio FBS estándar 10% para 10 min. lisados de células enteras fueron sometidos a análisis de inmunoblot.
Ratones subcutánea en Trasplante inmune comprometido-
Un total de 1 × 10
6 fueron inyectados por vía subcutánea células en ratones desnudos (BALB /c- nu /nu, CLEA Japan). Los ratones se monitorizaron diariamente para la formación de tumor. Todos los procedimientos con animales se realizaron con la aprobación del comité de ética de los animales del Centro Nacional del Cáncer.
Generación y examen de
EZR-ROS1
ratones transgénicos
bandera de etiquetado
EZR-ROS1
cDNA se subclonó en un
SPC-iNOS
plásmido (proporcionado por el Dr. Hagiwara), que incluía un
SPC
promotor y una señal de poliadenilación, mediante la sustitución de la
iNOS
fragmento con el ADNc. El casete de expresión con el
SPC
promotor se cortó de la construcción y se inyectó en embriones de etapa pronuclear de ratones C57BL /6J (Unitech Japón). El número de copias del transgén se determinó por análisis de transferencia Southern de ADN de las colas de los animales. Las líneas transgénicas se mantuvieron por retrocruzamiento a ratones C57BL /6 ratones. ARN total fue aislado de los órganos de los ratones transgénicos y se sometió a análisis de RT-PCR para detectar
EZR-ROS1
, endógena de
ROS1
, endógena de
Ezrin
y
GAPDH
ARNm. Para detectar la proteína EZR-ROS1, ROS1 endógeno y Ezrin en los tejidos, homogeneizados lisadas se sometieron a análisis de inmunoblot utilizando anti-ROS1, anti-Ezrin y los anticuerpos anti-β-actina. El examen de los tumores de pulmón en los animales vivos se llevó a cabo con un aparato de TC de rayos X (eXplore micro-CT, GE Healthcare). Los tejidos pulmonares fueron fijadas en 10% formalina y embebidos en parafina. Se realizó la tinción de hematoxilina-eosina e inmunohistoquímica para Ki67 como se describe anteriormente [32].
Apoyo a la Información
Figura S1.
La detección de
EZR-ROS1
punto de rotura genómico. Electroferograma para la secuenciación de Sanger de fragmentos genómicos que abarca el
EZR-ROS1
punto de rotura del tumor LCY66. productos genómica PCR amplificados por los cebadores EZR-e10-CF1 y ROS1-e34-CR1 fueron secuenciados directamente utilizando el cebador EZR-e10-CF1. Los números encima de la electroferograma indican posición genómica en el cromosoma 6 (genoma humano construir 37,3). Un fragmento genómico de 35 pb de
EZR
intrón 10 fue invertido en el intrón antes de la fusión de
ROS1
intrón 33.
doi: 10.1371 /journal.pone.0056010.s001
(PDF)
figura S2.
La detección de transcritos de genes de fusión en muestras clínicas por RT-PCR. Representativos RT-PCR resultados que muestran los casos de fusión-positivo y negativo-fusión utilizando cebadores EZR-e10-CF1 y ROS1-e34-CR1. M: marcador molecular, Carolina del Norte: control negativo. RT-PCR para la de tipo salvaje
EZR Versión taquigráfica (cebadores EZR-e4-CF1 y EZR-e7-CR1) y de
GAPDH gratis (cebadores para GAPDH-F y GAPDH-R) es . también se muestra
doi: 10.1371 /journal.pone.0056010.s002 gratis (PDF)
Figura S3. análisis del número de
de copias del transgén en los ratones transgénicos. ADN genómico se aisló de las colas de los ratones transgénicos generados a partir de pronuclear etapa C57BL /6J embriones. A continuación, esta gDNA se sometió a análisis de transferencia Southern con un fragmento promotor SPC amplificado por PCR de 464 pb, generado usando cebadores SPC-pro-F y SPC-pro-R, como una sonda. Las muestras de control a la derecha se componen de ADN genómico de ratón con las copias indicadas de transgen por genoma diploide. Los números de identificación de los ratones positivos para el transgén se muestran en la parte superior
doi:. 10.1371 /journal.pone.0056010.s003 gratis (PDF)
figura S4.
expresiones de genes en ratones transgénicos. La expresión de los genes indicados en el lado izquierdo fue investigado por RT-PCR o análisis de inmunotransferencia. En RT-PCR, ciclos de PCR para amplificar los genes diana se indican en el lado derecho. Ezrin mostró expresión endógena en todas partes, sin embargo, la expresión endógena ROS1 fue baja. No se detectó expresión de proteína de fusión EZR-ROS1 en ratones de línea TGD (*). SW480 se utilizó como control negativo para la expresión de fusión. HT: corazón, LV: hígado, ST: estómago, SP: bazo, KD: riñón, LG:.
Pulmonar doi: 10.1371 /journal.pone.0056010.s004 gratis (PDF)
Figura S5. el desarrollo de tumores de pulmón
en ratones transgénicos. Los tejidos pulmonares de los ratones fueron TGA en sección transversal y caracterizado histológicamente. El número y tamaño de las lesiones fueron encuestados en ratones de fusión-positivo (Tg) y los ratones de fusión-negativo (CR) a las 4 semanas y 15 semanas después del nacimiento. (A) las lesiones tumorales se clasifican a lo largo de su tamaño de diámetro (mm), y se contaron. (B) de ocupación del tumor se calculó a partir del área del tumor deducida
doi:. 10.1371 /journal.pone.0056010.s005
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Figura S6.
caracterización histológica de tumores de pulmón en ratones transgénicos. (A) tinción con hematoxilina-eosina de un pulmón de ratón que muestra adenocarcinoma de pulmón invasivo que rodea un recipiente pulmonar (a1). Mayor aumento del tumor (a2). La tinción positiva Ki-67 en el tumor (a3). Barra de escala, 100 micras. (B) tinción con hematoxilina-eosina de un pulmón de ratón que muestra la mucina citoplasmática en células de adenocarcinoma de pulmón (b1). Mayor aumento del tumor (b2). Barra de escala, 200 micras
doi:. 10.1371 /journal.pone.0056010.s006 gratis (PDF)
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. K. Hagiwara (Universidad de Medicina de Saitama ) para proporcionar el plásmido SPC-iNOS, los Drs. Y. Nanya y S. Ogawa (Universidad de Tokio) para proporcionar el programa CNAG, y la Sra. N. Okada, H. Shimizu, A. Kokubu, T. Urushidate, S. W. Ohashi y Mukai por su excelente asistencia técnica.