Extracto
La propagación de las células de cáncer de próstata en el microambiente de la médula ósea y el crecimiento resistente a la castración son la clave pasos de progresión de la enfermedad y una fuente importante de morbilidad. Sin embargo, la importancia biológica de las células madre mesenquimales (MSC) y la médula ósea derivada de la matriz extracelular (BM-ECM) en este proceso no se entiende completamente. Por lo tanto, establecimos un
in vitro
modelo de ingeniería de tejidos de médula ósea en que incorpora hMSCs y BM-ECM para facilitar estudios sobre el mecanismo de supervivencia de las células del cáncer de próstata en los medios de andrógenos empobrecido en respuesta a factores paracrinos y BM-ECM. factores paracrinos derivados de hMSC aumento de la supervivencia celular LNCaP, lo cual era en parte atribuirse a IGFR y la señalización de IL-6. Además, BM-ECM aumenta la supervivencia celular LNCaP y MDA-PCa-2b en condiciones de andrógenos-agotado, e indujo a la quimio-resistencia y cambios morfológicos en LNCaPs. Para determinar el efecto de BM-ECM en la señalización celular, se examinó el estado de fosforilación de 46 quinasas. Se observaron aumentos en la fosforilación de las proteínas relacionadas con la vía MAPK-así como la fosforilación de Akt sostenida en cultivos de BM-ECM cuando se compara con cultivos crecidos en poliestireno tratada con plasma. El bloqueo de vía de MEK1 /2 o la PI3K condujo a una reducción significativa en la supervivencia LNCaP cuando se cultivan en BM-ECM en condiciones de andrógenos empobrecido. La relevancia clínica de estas observaciones se determinó mediante el análisis de la fosforilación de ERK en el cáncer de próstata metastásico hueso humano contra el cáncer de próstata no metastásico, y aumento de la fosforilación se observó en las muestras metastásicos. Aquí se describe un modelo de médula ósea de ingeniería que imita muchas características observadas en los pacientes y proporciona una plataforma para
in vitro
estudios sobre el mecanismo
Visto:. Lescarbeau RM, Seib FP, Prewitz M, Werner C , DL Kaplan (2012) Modelo in vitro de metástasis a la médula ósea media la del cáncer de próstata resistente a la castración Crecimiento a través paracrina y factores de la matriz extracelular. PLoS ONE 7 (8): e40372. doi: 10.1371 /journal.pone.0040372
Editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, los Estados Unidos de América
Recibido: 11 Abril, 2012; Aceptado: 7 Junio 2012; Publicado: 1 Agosto 2012
Copyright: © Lescarbeau et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud EB002520-05 P41 donación de tejidos (Centro de recursos Ingeniería) (DL Kaplan). FP Seib está apoyado por una beca postdoctoral Mildred Scheel de la ayuda del cáncer de alemán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El microambiente de la médula ósea proporciona muchas señales que permiten la supervivencia y proliferación de las células del cáncer de próstata. Ahora está bien establecido que, en particular, factores secretados de osteoblastos permiten andrógenos crecimiento independiente de las células de cáncer de próstata con metástasis [1], [2]. Además, la médula ósea derivado de la matriz extracelular (BM-ECM) está implicada en la progresión de otros tipos de cáncer, incluyendo el mieloma múltiple, a través de la activación de las vías asociadas con la supervivencia [3].
Debido a la significativa tropismo
del cáncer de próstata de la médula ósea, numerosos
in vivo y modelos han sido desarrollados para estudiar esta interacción. Estos incluyen modelos de ratones de xenoinjerto en los que se inyectan células de cáncer de intratibialmente [4], los modelos de ratón humanizado donde hueso humano se coloca por vía subcutánea y luego se sembró con células de cáncer de próstata, la implantación subcutánea del hueso ingeniería tisular [5], y las fibras huecas que contienen tanto el cáncer de próstata y ósea como las células [6]. Estos
in vivo
modelos, sin embargo, son de bajo rendimiento y potencialmente sufren interacciones xenogénicas. Para superar algunas de estas limitaciones, y que permita la mejora de los estudios de detección de rendimiento mecanicistas y altas, los investigadores están utilizando
in vitro y modelos de cultivos celulares in. Sólo recientemente se ha tratado artículos de poliestireno (PTP) de cultivo de tejidos plasma convencional sido sustituido por sustratos de cultivo que se asemejan más a la
in vivo
microambiente tumoral. Estos han incluido modelos estudio de las interacciones paracrinas y, recientemente, las interacciones ECM [7], [8], [9]. Sin embargo, ninguno de estos estudios han utilizado un modelo de tejido de médula ósea ingeniería en combinación con medios de andrógenos empobrecido para modelar la progresión del cáncer de próstata resistente a la castración
in vitro.
El crecimiento y la supervivencia de las células de cáncer de próstata en condiciones de andrógenos empobrecido se ha atribuido a una variedad de mecanismos. Sobre regulación del receptor de andrógenos que permite una mayor sensibilidad, las mutaciones que permiten el aumento de la promiscuidad de otros ligandos, así como la síntesis intracrina de andrógenos por las células de cáncer de próstata andrógeno contribuyen a crecimiento independiente [10]. Otros métodos de crecimiento independiente de andrógenos incluyen la activación de las vías mitogénicas y factores de transcripción tales como MAPK, PI3K, STAT3, y β-catenina [11], [12]. La activación de estas vías permite el crecimiento independiente de andrógenos o la supervivencia celular a través de co-activación del receptor de andrógenos.
Anterior
in vitro
estudios sugirieron que los componentes individuales de ECM pueden actuar como ligandos para inducir la señalización celular mitogénica y la supervivencia. Por ejemplo, la fibronectina, que es un componente de BM-ECM, inducida por la fosforilación de MEK por medio de FAK y Src [13]. Del mismo modo, la integrina β1 y las interacciones de IGF-1R con fibronectina mediada por la quimio-resistencia en la línea celular de cáncer de próstata DU145 [14]. Estos estudios indican un posible papel de ligandos BM-ECM activación de las vías asociadas con el crecimiento independiente de andrógenos y la progresión de la enfermedad.
Los co-cultivos de células mesenquimales humanas (hMSC madre) y las células de cáncer de próstata permite la señalización paracrina, induce osteogénesis, y es compatible con la supervivencia del cáncer de próstata. Para los paneles A, B, valores en bruto C se normalizaron con el grupo control negativo. hMSCs (A) se trataron con medios de comunicación normal de crecimiento, LNCaP medios acondicionados, los medios de comunicación PC3 acondicionado, o medios de comunicación osteogénicas 14 días. a continuación se tiñeron con rojo de alizarina, que posteriormente fue extraído y cuantificado para determinar la deposición de calcio. (B) QRT-PCR para las transcripciones especificados. Cada grupo se cultivó como se describe en (A), y, posteriormente, el ARN extraído. (C) indirectos co-cultivos de hMSCs con LNCaPs en los medios eliminados de andrógenos en la presencia del inhibidor de IGFR AG1024, o inhibidores de la IL6, AG490 y anti-IL6 mAb. Las células se sembraron en medio de crecimiento, se dejaron recuperar durante 24 h, y posteriormente se pasaron a andrógenos empobrecido inhibidor más medio. viabilidad LNCaP se midió después de 7 días. (D) IL6 concentraciones en medio de cultivo condicionado. (E) concentraciones en medios condicionados después de 48 horas de cada tipo de células cultivadas solas de IGF-1. (* P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001, n = 3, ± SEM).
médula ósea derivadas de la matriz extracelular (BM-ECM) protege el cáncer de próstata células contra el agotamiento de andrógenos y la quimioterapia. Para los paneles A, B, valores en bruto C se normalizaron con el grupo control negativo. (A) El crecimiento de las células LNCaP con el tiempo se cultivan en medios de andrógenos empobrecido como se mide a través de MTT. Igual número de LNCaPs se sembraron a BM-ECM o PTP con un n de 4 por grupo por punto de tiempo, y se ensayaron en el día apropiado. (B) MDA-PCa-2BS se sembraron y se cambió a andrógenos medios eliminados como se describe en (A) y se determinó la viabilidad celular después de 4 días. Las células MDA-2BS-PCA también fueron cultivadas en ECM comercial. (C) La viabilidad celular de las células LNCaP después de 72 horas en medio de cultivo con 25 nM de docetaxel. (* P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001, n = 3, excepto como se indica en (A), ± SEM)
médula ósea derivadas de la matriz extracelular. (BM-ECM) induce clúster como crecimiento de LNCaPs que resiste el agotamiento de andrógenos. LNCaPs se sembraron a BM-ECM y PTP como se detalla en la Figura 2A. Las micrografías electrónicas de barrido de 7 culturas día en medio de crecimiento (A) normales y (B) medios de andrógenos empobrecido. (C) superior micrografía electrónica de barrido de ampliación de las células cultivadas en BM-ECM (asterisco blanco) LNCaP (asterisco negro). (D) La circularidad de LNCaPs en PTP en andrógenos agotado y medio de crecimiento y LNCaPs en BM-ECM en andrógenos medios empobrecido se cuantificó a partir de imágenes de microscopía electrónica de barrido después de 7 días en cultivo (* P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; * ** P & lt;. 0.001, ± SEM)
Expresión de αvβ3 integrina en las células LNCaP media la adhesión al hueso matriz extracelular derivada de la médula (BM-ECM). (A) expresión en la superficie celular de integrina αvβ3 medida por citometría de flujo. (B) integrina anticuerpos anti-αvβ3 reduce la adhesión celular a BM-ECM. valores en bruto se normalizaron con el grupo control IgG. (N = 3, * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** p & lt; 0,001, ± SEM).
diferenciales fosfo-proteómica de las células LNCaP cultivadas en el hueso extracelular derivada de la médula matriz (BM-ECM). (A) La agrupación jerárquica revela LNCaPs en BM-ECM en los medios de andrógenos empobrecido agrupadas más estrechamente con LNCaPs cultivaron en PTP en medio de crecimiento (B) fosforilación diferencial de LNCaPs en BM-ECM en los medios de andrógenos empobrecido frente LNCaPs en PTP en los medios de andrógenos agotado. (C) la fosforilación diferencial de LNCaPs en PTP en los medios de andrógenos empobrecido frente LNCaPs en PTP en medio de crecimiento. (D) la fosforilación diferencial de LNCaPs en BM-ECM en los medios de andrógenos empobrecido frente LNCaPs en PTP en medio de crecimiento.
médula ósea derivadas de la matriz extracelular (BM-ECM) induce diferencial de señalización en las células LNCaP que media la supervivencia celular. Figura paneles C, D, E valores en bruto se normalizaron con el grupo control negativo. (A) por transferencia Western de LNCaPs indica mayor fosfato ERK1 /2 y fosfo-p90rsk en respuesta a BM-ECM. (B) Efecto de la PI3K, LY294002, o MEK1 /2, U0126, los inhibidores en LNCaPs cultivó en BM-ECM. Las células se sembraron a densidades iguales a BM-ECM o PTP en medio de crecimiento y después de 24 h cambiaron a andrógenos medios agotados ± inhibidores. La viabilidad celular se midió después de 7 días (n = 3). (C) la apoptosis relativa tal como se mide utilizando un ensayo de 6-fosfato deshidrogenasa de glucosa después de 72 horas. Clara indica un medio de crecimiento, las barras negras de andrógenos medios agotados. Las células lisadas son un control positivo (n = 8). (D) LNCaPs se cultivaron en PTP indirectamente con hMSCs, en BM-ECM, o en ambas condiciones simultáneamente mientras que en los medios agotados de andrógenos. la viabilidad celular relativa se midió después de 7 días (n = 3, excepto como se indica en (D), * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001, ± SEM). (E) La reducción de fosfato ERK1 /2 en células LNCaP en BM-ECM cuando son tratados con U0126 y LY294002.
La tinción para la fosforilación de ERK en un microarray de tejido a partir de muestras de tumores primarios y metastásicos del hueso muestras (a) secciones de tejido representativas teñidas para la p-Erk a partir de muestras de tumores primarios de próstata. Muestra VI contenía la única tinción positiva sustancial en muestras de próstata primarios. secciones (B) de tejidos teñidos para p-Erk a partir de muestras de cáncer de próstata metastásico de hueso (barras de escala son 200 micras).
La puntuación media trazada para cada grupo tomado de dos investigadores ciegos (círculos negros). La tinción en las secciones de metástasis óseas es significativa tanto sobre secciones de tejido normal y de tumor primario (n = 8 para el tejido de próstata normal, n = 72 para el tumor primario y la metástasis n = 4 hueso, *** P & lt; 0,001, ± std dev.. ).
a continuación presentamos un
in vitro
plataforma, lo que permite el examen eficiente y precisa del microambiente del tumor de la médula ósea con un enfoque específico en la BM-ECM. Se utilizó este sistema para examinar la respuesta de las células de cáncer de próstata y pudimos indentify numerosos factores que han contribuido al progreso de la enfermedad, incluido el crecimiento independiente de andrógenos y la quimio-resistencia. Los factores identificados incluyeron IGF1 y la señalización paracrina IL6, y la activación de la vía MAPK a través de señalización BM-ECM.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y sustrato BM-ECM
LNCaP, PC3, y las células MDA-PCa-2b fueron recientemente adquiridos de ATCC (Manassas, VA) que valida líneas celulares mediante el análisis de STR. aspirados de médula ósea enteras se obtuvieron de Lonza (Basel, Suiza), y se aislaron y caracterizaron hMSCs como se detalla en otra parte [15]. Después del aislamiento, las hMSC se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% penicilina estreptomicina, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, y 1 ng /factor de crecimiento de fibroblastos básico ml. células LNCaP y PC3 se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, y 1% de penicilina estreptomicina. Mientras que las células MDA-PCa-2b se hicieron crecer en medio BRFF-HPC1 (Athena ES, Baltimore, MD) suplementado con 20% de FBS sin penicilina estreptomicina. Para los estudios que implican los medios agotados de andrógenos, se utilizó medios rojo fenol base libre con 10% de SFB tratado con carbón vegetal. Indirectos co-cultivos utilizados 1 micras de tamaño de poro insertos transwell (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) con un solo tipo de células se sembró en la placa de cultivo de tejidos y otro en el inserto de cultivo celular. estudios indirecta de co-cultivo utilizan una relación de 01:01 de los medios de comunicación de los dos tipos de células de interés. En los estudios de andrógenos empobrecido se prepararon dos tipos de medios como se describió anteriormente. Los cultivos de células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2. El ECM derivada de la médula ósea se generó como se detalla en otra parte [16]. A menos que se indique lo contrario todos los reactivos de cultivo celular se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA).
andrógenos estudios de crecimiento agotado
Para los estudios de andrógenos crecimiento /supervivencia independientes, las células del cáncer de próstata se sembraron a 5.000 células /cm
2 en los medios de cultivo a cada PTP o BM-ECM. Estudios incluyendo las células MDA-PCa-2b, placas de control PTP también se revistieron primero con una matriz de unión de las células patentada que contiene fibronectina, colágeno y albúmina (Athena ES, Baltimore, MD) para facilitar la adhesión celular. Las células se dejaron adherir durante 24 horas, después de lo cual los cultivos se lavaron con PBS, y cambiaron a andrógenos medios agotados. células LNCaP en BM-ECM o PTP se ensayaron como se describe más adelante en sus respectivos puntos de tiempo para completar la curva de crecimiento, o se sustituyen los medios de comunicación. Las células MDA-PCa-2b con cultivo durante 4 días, se cambió el medio a los 2 días, y los números de celda relativas evaluó a través de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT, Invitrogen ) al final del periodo de cultivo siguiendo el protocolo del fabricante. La validez del ensayo de MTT fue confirmada por comparación con el conteo manual y cuantificación de ADN (Fig. S1A, S1B). MTT valores se normalizaron con el control negativo que se fija arbitrariamente a un valor de uno.
integrina experimento bloqueo
células LNCaP suspendidos fueron pre-incubadas con un anticuerpo monoclonal contra el bloqueo de αvβ3 (20 mg /ml), clon 23C6 (eBioscience, San Diego, CA), o IgG control de isotipo durante 30 minutos y luego se sembró a BM-ECM. Después de 12 horas, el medio se aspiró y las células se lavaron una vez con PBS. Entonces, el número relativo de células se midió usando un ensayo de MTT como se describe anteriormente.
estudios de tratamiento Docetaxel
células de cáncer de próstata se sembraron en PTP o BM-ECM como se detalla anteriormente y se dejó que se recuperaran durante 24 horas. A continuación, las células se lavaron con PBS y se sustituye con medio de cultivo suplementado con 25 nM docetaxel o vehículo solamente. Las células se expusieron al tratamiento durante 72 horas y luego la viabilidad celular relativa se midió usando un ensayo MTT, que se normalizó como en ensayos de MTT anteriores.
ensayos ELISA
Para recoger muestras de medio acondicionado de cada tipo de células se sembró en PTP y co-cultivos llevados a cabo usando insertos transwell con hMSCs en las células LNCaP PTP y sembradas a los insertos. Los medios condicionados de cada grupo se eliminó cada 48 horas y se reemplaza con medio fresco. Tanto IL6 y kits IGF-1 de ELISA se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (eBioscience y amp; R y D Systems, respectivamente). El experimento se realizó por triplicado y el valor medio calculado.
Apoptosis ensayo
LNCaPs se sembraron a 2.500 células /cm
2 en una placa de 24 pocillos y se dejaron adherir durante 24 horas antes de que el medio se cambió a cualquiera de los medios de crecimiento, los medios de andrógenos empobrecido, o medios de comunicación de andrógenos empobrecido suplementado con LY294002 (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ). Después se recogió 72 horas medios de cada pocillo y se ensayó para la apoptosis utilizando un ensayo de 6-fosfato de glucosa (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 0,25% Triton X-100 se complementó en el grupo de control positivo antes de la retirada de los medios de comunicación. El experimento se realizó con n = 8 y la media calculada. los valores de fluorescencia medidos se normalizaron con el control negativo que se establece en un valor de uno.
microscopía electrónica de barrido
células LNCaP fueron sembradas en PTP o BM-ECM como se detalló anteriormente. A los 4 días en medios agotados al crecimiento o de andrógenos, se terminaron los cultivos, se lavaron con PBS, se fijaron con glutaraldehído al 2% y se prepararon para pulverización catódica de platino-paladio, como se detalla en otra parte [17]. Las muestras se visualizaron con un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo Zeiss Supra 55VP.
Western blot y arrays de proteínas de fase inversa
células LNCaP se sembraron en medio de crecimiento para PTP y BM-ECM y se dejaron recuperar durante 24 horas. Como se ha indicado, el medio de cultivo fue reemplazado o bien con medio de crecimiento fresco o medios de comunicación y las células de andrógenos empobrecido se cultivaron durante 72 horas. A continuación, se eliminó medios, las células se lavaron con PBS enfriado en hielo y se recogieron con un raspador de células. Las células se sedimentaron a 4 ° C y se lisaron con tampón RIPA cócteles (Roche, Basilea, Suiza) que contenía inhibidores de la proteasa y de fosfatasa (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) a 4 ° C El contenido de proteína se determinó con el ensayo de proteínas de ácido bicinconínico ( Pierce Biotechnology) y 5 g de proteína celular se redujo y se analizaron por transferencia de Western por carril. Las membranas se bloquearon con albúmina de suero bovino y se sondaron con un cóctel de anticuerpos contra fosfo-p90rsk (Ser380), fosfo-Akt (Ser473), fosfo-p44 /42 (Thr202 /Tyr204), fosfo-S6 (Ser235 /236), fosfo -Erk1 /2 (Thr202 /Tyr204), y eIF4E (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) usando una incubación durante la noche a 4 ° C y una dilución 1:400 anticuerpo. ERK total se determinó utilizando una p44 /42 MAPK anticuerpo específico (Cell Signaling Technology) a una dilución 1:2000. Para los arrays de proteínas de fase inversa, en total de 150 g de lisado de LNCaP se ensayó usando el kit de proteoma de perfiles fosfo-quinasa humana (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN). De acuerdo con las instrucciones del fabricante
citometría de flujo
Las células LNCaP se tripsinizaron y se centrifugaron en un gránulo (1.200 rpm, 10 minutos). Las células se resuspendieron en un PBS que contiene el anticuerpo αvβ3, LM609 clon, (Millipore, Billerica, MA) a una dilución de 1:300 y se incubaron a 4 ° C durante 30 min. Las células fueron fijadas en formalina al 4%, y se analizaron mediante citometría de flujo (FACSCaliber, BD Biosciences). Los datos fueron analizados utilizando el software Flow-jo (Árbol-Star Inc., Ashland, Oregón).
Alazarin mancha roja y cuantificación
Para evaluar la diferenciación osteogénica de hMSC en respuesta al cáncer de próstata de células acondicionado medios de comunicación, y LNCaPs hMSCs o PC3s y hMSCs fueron indirectamente co-cultivadas en una relación 01:01 de los medios de comunicación respectiva. A los 14 días de co-cultivo, la capa de MSC se fijó con formalina al 4% y se incubaron con una solución acuosa al 1% de rojo de alizarina (pH 4,2) (Sigma-Aldrich) durante 10 min a temperatura ambiente. A continuación, las muestras se lavaron con agua para eliminar el colorante no unido y posteriormente imágenes de microscopía de luz. Para alizarina cuantificación rojo se añadió 10% de ácido acético a cada pocillo, se incubaron durante 30 minutos, retiró de cada pocillo, y se neutralizó con hidróxido de amonio 10%. Por último, la absorbancia de las muestras se leyeron a 405 nm utilizando un espectrofotómetro. Los valores de absorbancia se normalizaron con el control negativo que se establece en un valor de uno.
Señalización estudios de inhibición
Para las células co-cultivos indirectos se sembraron en medio de cultivo y después de 24 h los medios se sustituido con una mezcla 01:01 de los medios de andrógenos LNCaP empobrecido y hMSC. Este medio fue suplementado con LY294002 a una concentración de 5 mM o U0126 (EMD Chemicals) a 100 nM. AG1024 y AG490 (Merck Chemicals) también se complementaron en los medios de comunicación de andrógenos empobrecido de hMSCs y LNCaPs en indirecta co-cultivo a una concentración de 1 mM y 50 mM, respectivamente. El anticuerpo monoclonal anti-IL6 humana (eBioscience) fue suplementado en el medio a una concentración de 20 mg /ml mientras que LNCaPs eran indirectamente co-cultivadas con hMSCs. concentraciones de trabajo de inhibidores de moléculas pequeñas se determinaron a partir de curvas de respuesta de dosis de LNCaPs solos en cultivo (Fig. S2). La supervivencia celular se determinó con el ensayo MTT como se detalló anteriormente después de 7 días. MTT valores se normalizaron con el control negativo que se establece en un valor de uno.
reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-PCR)
El ARN total se aisló utilizando columnas de sílice RNeasy (Qiagen , Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante, y 200 ng de ARN se transcribió de forma inversa de cada muestra (iScript, Bio-Rad, Hercules CA). Los niveles de expresión de los genes diana se cuantificaron por RT-PCR utilizando Brilliant II QPCR rápida mezcla maestra (Aglient Technologies, Santa Clara CA) y cebadores validados (TaqMan, Applied Biosystems, Carlsbad CA). La expresión relativa de los genes diana se calcula en base a los C
valores de T, y éstos se normalizaron a la de la limpieza gen de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa utilizando el
-ΔΔCT método suponiendo un 100% de eficiencia 2 PCR [18] .
fosfato ERK inmunohistoquímica
microarrays de tejidos de próstata que contienen secciones de tejido normal de próstata, tumores primarios de próstata y el tejido óseo metastásico de próstata se obtuvieron de los Estados Unidos Biomax (Rockville, MD). Un anticuerpo monoclonal contra la T185 Erk1 /2 phosphosites, Y187, T202, Y204 y se obtuvo de Abcam (Cambridge, MA), el clon MAPK-YT. La tinción se realizó en el laboratorio del Centro Médico Tufts Histología siguiente optimización de dilución de anticuerpo y el bloqueo en la optimización diapositivas cortadas de los bloques del mismo tejido que las muestras experimentales. microscopía de campo claro se realizó utilizando un microscopio Leica Microsystems DM IL (Buffalo Grove, IL), con una cámara Leica Microsystems DFC420 y Software Suite V3.5 Leica Microsystems Aplicación sin alteraciones a las imágenes en bruto. Las secciones fueron anotados por dos investigadores ciegos utilizando la escala Dako (0,1 +, 2 +, 3 +), donde la puntuación final de cada sección se promedian en conjunto [19]. Se utilizó una prueba de ANOVA de una vía con la prueba post hoc de Bonferroni en el intervalo de confianza del 95% para determinar la significación.
Se sembraron cálculos de IC50
p>
2. Las células se trataron con concentraciones crecientes de inhibidor y de supervivencia relativa medidos con un ensayo MTT después de 3 días. Las concentraciones de IC50 se determinan con base en la mitad de la distancia entre los valores máximos y mínimos de supervivencia a lo largo de la curva de respuesta a la dosis. La media fue tomada de 12 réplicas por concentración.
Validación del recuento de células
Un número igual de células LNCaP se sembraron en PTP y BM-ECM en una placa de 24 pocillos a 2.500 células /cm
2, 5.000 células /cm
2, y 7.500 células /cm
2, tal como se determina a través de contar con un hemocitómetro. Además, se prepararon concentraciones crecientes de células LNCaP y una medida tomada de cada muestra de MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA) y ensayos de cuantificación de ADN utilizando Picogreen (Invitrogen, Carlsbad, CA) para crear una curva estándar. Después de 24 horas de cultivo en medios de andrógenos agotado, las células en PTP y BM-ECM se analizaron utilizando la cuantificación de ADN, MTT, y el recuento manual a través de la tinción nuclear y de imagen. Los núcleos celulares se tiñeron con Hoechst 33258, se lavaron con PBS, y la imagen a 20x usando un microscopio Leica DM IL invertida. Cinco imágenes representativas fueron tomadas por pocillo y el número de núcleos contados manualmente. Este número de núcleos se promedió y se multiplica por el área de superficie de un solo pocillo de una placa de 24 pocillos (2 cm
2) sobre el área del campo de vista a 20x para determinar el número de células por pocillo, y la promedio de todas las repeticiones biológica tomada (n = 4).
análisis de los datos
se completó el análisis estadístico utilizando GraphPad Prism 5. Importancia fue visitada mediante pruebas t no pareada una cola en la confianza del 95% intervalo, o una manera ANOVA con la prueba de comparación múltiple de Dunnett, también en el intervalo de confianza del 95%, a menos que se indique lo contrario (* P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** p & lt; 0,001). Los datos se representan como la media ± SEM, a menos que se indique lo contrario. circularidad análisis de imagen se completó usando ImageJ y sugirió umbralización configuración. El aumento de los valores en la escala de circularidad indican cada vez más células circulares. los datos de microarrays de proteínas fueron escaneados como un archivo de imagen y la intensidad de los píxeles integrada para cada punto medido usando ImageJ. El promedio de los duplicados fue tomada, los datos se centra significar, y se realizó un análisis de agrupamiento jerárquico. la fosforilación de proteínas diferencial entre grupos se expresó como la diferencia de dos mediciones dividida por la desviación estándar de la población.
Resultados
interacciones paracrinas de hMSCs y LNCaPs promueven la diferenciación osteogénica de hMSCs y andrógeno independiente de la supervivencia LNCaPs
Para entender mejor la señalización paracrina entre hMSCs y células de cáncer de próstata, se utilizó indirectos co-cultivos de LNCaPs y hMSCs. LNCaPs inducen la diferenciación osteogénica de hMSC (Fig. 1A, 1B) que se parecía a la activación de los osteoblastos visto con frecuencia en pacientes con cáncer de próstata [20]. Además, la supervivencia de las células LNCaP en hMSC co-cultivos se mejoró significativamente en cultivos monotípico LNCaP en los medios de andrógenos empobrecido (Fig. 1C). Para interrogar a estos efectos, la señalización de IL6 se inhibió con un anticuerpo anti-IL6 monoclonal o, AG490, un inhibidor de molécula pequeña de la quinasa JAK2, un activador corriente arriba de Stat3. Estos tratamientos redujeron significativamente la viabilidad de las LNCaPs comparación con el grupo de co-cultivo sin inhibiciones en condiciones de agotamiento de andrógeno (Fig. 1C). Tomando nota de que la reducción de la viabilidad no fue al nivel de LNCaPs cultivadas solas, también a prueba el efecto de AG1024, un inhibidor de IGFR. Este fármaco también redujo significativamente la viabilidad de las células LNCaP indirectamente co-cultivadas con hMSCs. Estos inhibidores solos no fueron citotóxicos para las células (Fig. S2). Por último, la expresión de IL6 con el tiempo se confirmó mediante ELISA de hMSCs medios condicionados con diferentes condiciones (Fig. 1D). En particular, las hMSC que había sido pre-diferenciadas hacia un linaje osteogénico tuvieron una incidencia más alta de expresión de IL-6. Teniendo en cuenta LNCaPs inducen hMSCs para someterse a la diferenciación osteogénica, esto puede ser una fuente de aumento de IL6 ligandos niveles. Además, los niveles de IGF-1 se midieron en medios acondicionados con un ensayo ELISA. No hay tiempo se observaron diversos efectos, se observó la liberación de estado estacionario sin embargo significativa de hMSC en comparación con el PC3 y LNCaP células (Fig. 1E).
BM-ECM promueve la supervivencia de las células LNCaP en los medios de andrógenos empobrecido y quimio-resistencia
Además de las señales paracrinas soluble, la hipótesis de que el hueso ECM ósea similar puede desempeñar un papel en la supervivencia de las células del cáncer de próstata andrógeno-dependientes. Una matriz descelularizado se deriva de proteínas ECM secretadas por hMSCs [16]. Después de una semana de cultivo en medios de andrógenos privado hubo un aumento significativo en el número de células viables en BM-ECM comparación con las células en medios de andrógenos empobrecido en PTP (Fig. 2A). El mecanismo de este efecto se confirmó en una segunda línea celular dependiente de andrógenos, es decir, las células MDA-PCa-2b (Fig. 2B). células MDA-2b-PCA se cultivan rutinariamente en disponible en el mercado ECM para apoyar la adhesión celular y el crecimiento. Sin embargo, este sustrato ECM no apoya el crecimiento de células MDA-PCa-2b en andrógenos condiciones empobrecido que indican el efecto es específico de los componentes BM-ECM o la estructura (Fig. 2B). A continuación, se examinó si la BM-MEC puede conferir la quimio-resistencia utilizando medio de cultivo suplementado con docetaxel. células LNCaP cultivadas BM-ECM mostraron un aumento significativo en la supervivencia celular en comparación con cultivos de PTP (Fig. 2C). Estos datos indican que los componentes de la BM-ECM desempeñan un papel en la determinación de la supervivencia en respuesta a la privación de andrógenos y docetaxel tratamiento.
BM-ECM altera la morfología LNCaP
Para proporcionar una mejor comprensión de la diafonía BM-ECM y LNCaP, se analizó la morfología celular mediante microscopía electrónica de barrido. LNCaPs pudieron observarse unido a las fibras de ECM y de la matriz (Fig. 3A, 3B y 3C). células LNCaP cultivadas en medios de andrógenos empobrecido tenían un aumento sustancial en el alargamiento cuantificada siguiente imagen SEM después de 4 días (Fig. 3B). Sin embargo, se evitó este cambio morfológico que se produzcan cuando las células se cultivaron en medios de andrógenos empobrecido en BM-ECM. En esta condición, las células parecían crecer en racimos que resulta en un aumento significativo de la circularidad medido (Fig. 3D).
El bloqueo de la integrina αvβ3 límites de archivos adjuntos para BM-ECM
A continuación, se trató de examinar el papel del complejo de integrina αvβ3 para la fijación BM-ECM, ya que este complejo de integrina se ha implicado en la unión ECM y la posterior metástasis de médula ósea [21]. La citometría de flujo de etiquetado de la superficie celular mostró por αvβ3 integrina (Fig. 4A). Para determinar la significación funcional, las células suspendidas se incubaron con un anticuerpo bloqueante contra la integrina αvβ3 o control de isotipo y la fijación de células a la BM-ECM se midió a continuación. Una disminución significativa en la unión celular se midió, lo que sugiere que la integrina αvβ3 en este caso desempeña un papel en la mediación de fijación a BM-ECM (Fig. 4B).
Efecto de BM-ECM en MAPK y PI3K vías de señalización
para determinar el mecanismo de mediación de la respuesta de los LNCaPs a BM-ECM se analizó el estado de fosforilación relativa de 46 proteínas de múltiples vías usando un microarray de proteínas de fase inversa. Cuando se realizó el análisis de agrupamiento jerárquico, LNCaPs en BM-ECM en los medios de andrógenos empobrecido agruparon más estrechamente con LNCaPs en medios de crecimiento en PTP (Fig. 5A). Se evaluó la fosforilación diferencial luego entre LNCaPs en BM-ECM en los medios de andrógenos empobrecido y LNCaPs en PTP en los medios de andrógenos empobrecido, y numerosas proteínas que parecía ser diferencialmente fosforilada (Fig. 5B). Sin embargo, cuando se examinó también las diferencias entre LNCaPs fosforilación de PTP en medios de crecimiento en comparación con los medios agotados andrógenos varias proteínas estaban regulados de manera similar (Fig. 5C).