Extracto
El desarrollo de xenoinjertos de tumores animales marcados genéticamente es un área de investigación en curso para permitir la inspección más fácil y más fiable de terapias contra el cáncer. Genéticamente modelos tumorales marcadas tienen un número de ventajas sobre los modelos de tumores convencionales, incluyendo el seguimiento longitudinal fácil de terapias y la reducción del número de animales necesarios para los ensayos. Varios métodos diferentes se han utilizado en estudios previos para marcar tumores genéticamente, sin embargo, todos tienen limitaciones, tales como la genotoxicidad y otros artefactos relacionados con el uso de la integración de vectores virales. Recientemente, hemos generado un sistema de ADN (pDNA) plásmido de expresión episomal basado en mantenido Andamios /matriz de ligadura Región (S /MAR), que permite la expresión de luciferasa transgén a largo plazo en el hígado de ratón. Aquí se describe un uso adicional de este vector pDNA con el promotor humano ubiquitina C para crear transfectadas establemente hepatoma humano (Huh7) y humano Carcinoma Pancreático (MIA-PaCa2) líneas celulares, que fueron entregados en ratones "inmunodeficientes" y monitoreado longitudinalmente sobre tiempo usando un bioluminometer. Ambas líneas celulares revelaron expresión sostenida episomal a largo plazo de la luciferasa y la formación de un tumor que muestra las características patológicas de carcinoma hepatocelular (HCC) y el carcinoma de páncreas (PACA), respectivamente. Esta es la primera demostración de que un vector pDNA puede conferir expresión episomal luciferasa transgén sostenida en varios modelos tumorales de ratón y por lo tanto se puede utilizar fácilmente para seguir la formación de tumores, sin interferir con el genoma celular
Visto:. Argyros O, Wong SP, Gowers K, Harbottle RP (2012) Modificación genética de células de cáncer de Uso no virales, episomales S /MAR vectores para
En Vivo
tumor Modelado. PLoS ONE 7 (10): e47920. doi: 10.1371 /journal.pone.0047920
Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos de América
Recibido: 17 Junio, 2011; Aceptado: September 20, 2012; Publicado: 26 Octubre 2012
Derechos de Autor © 2012 Argyros et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue financiado por el myrovlytis Trust. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer representa uno de los mayores riesgos para la salud en todo el mundo. Por consiguiente, existe una creciente necesidad para el desarrollo de nuevas terapias y los nuevos avances en el modelado de tumor animal. Sin embargo, a pesar de muchos avances en este campo, el desarrollo de modelos animales clínicamente relevantes que permiten la monitorización rápida y sensible del crecimiento tumoral temprana y la posterior metástasis sigue siendo un reto [1].
Muchos modelos de tumores animales convencionales en curso utilizado en el desarrollo de tratamientos contra el cáncer implican la inyección de las células tumorales humanas en ratones inmunocomprometidos [2], [3] seguido por mediciones de pinza estándar para evaluar el tamaño del tumor, por lo general como una medición de punto final, después de que el animal ha sido sacrificado. Estos modelos son bastante limitadas y la investigación ha sido en curso para desarrollar un tumor marcada genéticamente que permita la monitorización no invasiva de los parámetros tumorales por
in vivo
de imagen basada en la emisión de luz a partir de células que expresan luciferasa o de fluorescencia a partir de células que expresan GFP [1]. El uso de células tumorales marcadas genéticamente en un modelo de cáncer de animal tiene una serie de ventajas. En primer lugar, le permite a uno controlar la eficacia de las intervenciones terapéuticas, tales como drogas, gen o terapias con células más fácilmente que con los modelos convencionales. Se facilita el seguimiento de los parámetros de tumores, tales como el tamaño y el desarrollo, así como permite la visualización altamente sensible de metástasis temprana y la evaluación de la enfermedad residual mínima después de la terapia [4]. También permite el uso de mediciones secuenciales para seguir el tamaño del tumor durante el tratamiento de modo que los estudios longitudinales pueden llevarse a cabo para analizar los efectos de las terapias en el tiempo con información más fiable y reduciendo el número de animales de experimentación [5].
en estudios anteriores, una variedad de diferentes métodos se han empleado para dotar a las células tumorales con marcadores detectables [1], [4], [6], [7], [8], [9]. El método más eficaz para la entrega de genes a las células es el uso de vectores derivados de virus modificados [10]. Sin embargo, a pesar de las ventajas de este sistema de suministro de genes también existen limitaciones significativas, principalmente relacionados con la integración del vector en el genoma de la célula, la inmunogenicidad potencial de genes de codificación virales así como la pérdida de expresión a largo plazo del gen informador. Sería de gran interés, por lo tanto, desarrollar un sistema de administración de genes no viral que puede mediar la expresión del gen reportero prolongada en un modelo de tumor animal. Una manera eficaz de lograr este objetivo es el uso de un ADN sistema de expresión de plásmido (pDNA) que puede mantenerse como una entidad episomal funcional una vez que ha sido entregado a las células del modelo de tumor y les proporcionan buenos niveles detectables de expresión del gen marcador durante toda su vida [11].
Anterior
in vivo
estudios con vectores pDNA han demostrado que los promotores virales, tales como el promotor de citomegalovirus (CMV) es capaz de proporcionar los más altos niveles de expresión de los transgenes inicialmente [12], [13] pero es seguido con un posterior descenso de la expresión de un plazo de dos meses [14]. Esta disminución de la expresión es el promotor dependiente y probablemente sea el resultado de silenciamiento transcripcional del promotor [15]. De hecho, CpG de metilación del promotor de CMV en varios vectores de plásmido se ha encontrado que tienen un efecto negativo en la expresión del transgen tanto
in vitro
y
in vivo
[11], [16], [ ,,,0],17].
Recientemente, nosotros y otros han demostrado que un vector pDNA que comprende una combinación de un promotor de mamífero, específica de tejido con una región de unión en andamio /matriz nuclear (S /MAR) elemento puede promover a largo plazo expresión episomal
in vitro
y
in vivo
[11], [18], [19], [20], [21]. El elemento S /MAR proporciona una asociación específica del vector con la matriz nuclear a través de unión en andamio factor A (SAF-A), la inmovilización del vector para el andamio de cromosomas durante la mitosis y llevando el plásmido en estrecho contacto con la maquinaria de replicación de la célula, por lo tanto, la creación de estabilidad mitótica y el mantenimiento del plásmido como una entidad epigenética a través de cientos de divisiones celulares [22], [23], [24], [25], [26]. El elemento S /MAR se ha demostrado que tienen un efecto protector de los sitios sensibles a la metilación de la α1-antitripsina (AAT) promotor específico de hígado [11], pero no tiene tal efecto sobre el promotor de CMV, destacando que un mamífero en lugar de un promotor viral es más adecuado para la expresión del transgen a largo plazo con este vector.
un S /MAR-que contiene el plásmido se ha desarrollado para su aplicación en el hígado por la utilización de un promotor específico de hígado, AAT, y se ha demostrado que persisten y expresar el transgen de la luciferasa episomal de más de 6 meses en los hepatocitos [11]. Dada la expresión a largo plazo de estos plásmidos episomal mantenimiento, una S /MAR vector basado en combinación con un promotor de mamífero parece ser ideal para el uso como un marcador genético de las células tumorales.
Los plásmidos que contiene un S /secuencia MAR y un promotor de CMV previamente han sido transfectadas con éxito en células CHO [18], [23], [25], HaCat [23], HeLa [27], las células de leucemia K562, U251 de glioma [20] y de fibroblastos primario [28] y se ha demostrado para replicar y ser mantenido como episomas extra-cromosómico.
el trabajo descrito aquí muestra, por primera vez, el uso de una, pUbC-S /MAR plásmido episomal mantenido, la mediación de la luciferasa persistente la expresión del transgen para generar líneas de células tumorales marcadas genéticamente que dan lugar a diferentes tipos de cáncer cuando se aplica
in vivo
. Las líneas celulares utilizadas son un carcinoma hepatocelular línea celular humana Huh7, que se deriva de un paciente con carcinoma hepatocelular y carcinoma de células de línea de páncreas humano, MIA-PaCa2.
Resultados
Generación del tumorales transfectadas de forma estable líneas celulares utilizando pUbC-S /MAR plásmido
sobre la base de anterior
in vitro
estudios que utilizan vectores S /MAR, que tuvo como objetivo aplicar esta experiencia para establecer un número de diferentes establemente líneas celulares transfectadas tumorales para la generación de diferentes modelos de tumores, que pueden ser monitoreados por
Tarjetas telefónicas técnicas de imagen de bioluminiscencia in vivo. Un plásmido que contiene un elemento S /MAR en combinación con el promotor UbC de mamíferos (pUbC-S /MAR), la conducción de un transgen de la luciferasa se utilizó en este estudio (figura 1A). Se aplicó el promotor UbC ubicua de modo que el mismo vector se podría utilizar para controlar el transgen de la luciferasa en diferentes líneas celulares.
A) El plásmido pUbC-S /MAR utilizado en este estudio, en el que la luciferasa de la expresión se dirige por el promotor UbC humano. B) Huh7, y MIA-PaCa2 células fueron transfectadas con pUbC-S /MAR y se cultivan bajo selección con G418 durante unas dos semanas. Tres colonias individuales se aislaron y se expandieron fuera de la selección con imágenes de periódicos por medio de un Bioimager Xenogen. C) de transferencia Southern de DNA total aislado a partir de tres colonias individuales de cada línea celular en 45 días después de la transfección. Los carriles 1-3: Huh7 colonias aisladas; Los carriles 4-6 MIA-PaCa2 colonias aisladas; (+): Control positivo, 10 ng de plásmido bacteriano pUbC-S /MAR. D) ensayo de luciferasa bioluminiscencia (por duplicado) en cantidades crecientes de células Huh7 y MIA-PaCa2, que muestra los límites de) la detección de señales de luciferasa (,
in vitro
. E-F) plásmido experimentos de rescate de tres
E.Coli
colonias para Huh7 (carriles 1-3) y cuatro colonias de líneas celulares de MIA-PaCa2 (carriles 4-7), que muestra un patrón de restricción idéntico a pura pUbC -S /MAR plásmido (+), después de digestión de restricción con
Spe I
enzima. (-) Control negativo (sin ADN); M: Escala de 1 kpb (Hyperladder I, Bioline) guía empresas
Las células MIA-PaCa2 y Huh7 fueron transfectadas con el vector pUbC-S /MAR y se cultivaron durante dos semanas en presencia de G418 (. 1 mg /ml). Después de este tiempo las células formaron colonias distintas y expresión de luciferasa se verificó utilizando un generador de imágenes de bioluminiscencia (Figura 1B, panel superior). Tres transgén individuo que expresa colonias para cada una de las líneas celulares (Huh7 y MIA-PaCa2) se aislaron y posteriormente se cultivaron sin selección de antibióticos (Figura 1B, panel central). La expresión del transgen de la luciferasa se demostró en las dos líneas celulares que indican el éxito de la transfección estable con el plásmido pUbC-S /marzo Las células se cultivaron en ausencia de presión de selección para otra meses (panel inferior figura 1B). A los 45 días después de la transfección se extrajo ADN genómico a partir de las tres colonias de cada línea celular para confirmar el mantenimiento episomal del pDNA. Una transferencia de Southern se llevó a cabo (Figura 1C), que en todos los casos mostró una única banda del tamaño exacto de pUbC-S /MAR (8198 bps) para cada una de las colonias de ambas líneas celulares. Finalmente hemos realizado ensayos de bioluminiscencia de la luciferasa en el aumento de cantidades de células, con el fin de proporcionar resultados cuantitativos directos de la expresión génica para la comparación. Los resultados se muestran en la figura 1D, donde el límite de detección de la señal fue entre 500-5000 células para células Huh7 y entre 250-2500 células para MIA-PaCa2
.
Otra prueba para el mantenimiento episomal fue proporcionado por el plásmido de rescate de pUbC-S /MAR de kanamicina resistentes
E. coli
bacterias después de la transformación con el ADN total a partir de cada una de las colonias de las dos líneas celulares. En este caso, sólo intacta de ADN plásmido libre produciría colonias de bacterias en placas que contenían kanamicina que es el marcador de resistencia presente en el plásmido pUbC-S /marzo Los patrones de restricción del pDNA de colonias seleccionadas fueron consistentes con construcciones de plásmidos no integrados no modificados, tanto para el las líneas celulares MIA-PaCa2 (Figura 1E y 1F) y Huh7.
Huh7 transfectadas de forma estable y MIA-PaCa2 célula líneas forman tumores
in vivo
manteniendo altos niveles de expresión transgénica de 35 días después de la inyección
las células de cada uno de los dos generado líneas celulares transfectadas de forma estable (MIA-PaCa2 y Huh7) se administraron por separado inyección intraperitoneal a grupos de ratones (n = 4). Los ratones se obtuvieron imágenes de las 24 horas después de la inyección y se observó la expresión de luciferasa en ambos grupos de ratones inyectados (Figura 2A). Hemos observado que los cuatro ratones inyectados con células MIA-PaCa2 expresaron luciferasa durante todo el período de seguimiento y tumores formados, mientras que tres de cada cuatro ratones inyectados con células Huh7 luciferasa expresado y un ratón no tenían expresión de luciferasa inicial, probablemente debido a la incapacidad de la células para establecerse en el nuevo entorno, aunque esto sigue siendo poco clara. Sin embargo, la expresión de luciferasa se controló en ambos grupos de ratones durante un periodo total de 35 días con bioimagen semanal. fotos de imágenes bioluminiscentes de un representante del ratón a través del tiempo para cada línea celular se muestra en la Figura 2A. El nivel de expresión aumentó bruscamente 21 días después de la administración de las células (Figura 2C). Ninguna expresión de luciferasa se detectó en el control de los animales no tratados (datos no mostrados), donde el nivel de fondo de la emisión de luz fue de 5 × 10
5 fotones /s /cm
2 /sr.
A) un grupo de cuatro ratones para cada línea celular se inyectó por vía intraperitoneal con 3 × 10
6 células Huh7 o MIA-PaCa2 transfectadas establemente con pUbC-S /MAR y visualizados en el tiempo (desde el primer día después de la inyección) para la bioluminiscencia usando un Xenogen Bioimager, después de las inyecciones intraperitoneales de 15 mg /ml de D-luciferina, con tiempo de adquisición de un minuto. Un representante del ratón para cada línea celular se muestra en los días 7, 21 y 35. B) A los 35 días después de la inyección los ratones Huh7 y MIA-PaCa2 inyectada murieron y diseccionados para buscar evidencia de crecimiento tumoral. No hay crecimiento era obvio a partir de un examen externo del animal, pero en la apertura hasta una masa se observó en la cavidad peritoneal (Huh7 tratada ratón se muestra como un ejemplo). El animal fue fotografiada por bioluminiscencia antes y después de la extirpación del tumor. La intensidad de la expresión de luciferasa se muestra en el ratón: rojo representa alta expresión, violeta representa una baja expresión. La barra de color ilustra la intensidad relativa de la señal. (C) Ilustración gráfica de la expresión de luciferasa a largo plazo de los ratones NOD-SCID inyectados con cualquiera Huh7 o MIA-PaCa2 líneas celulares estables (n = 3 para Huh7 y n = 4 para el MIA-PaCa2). la cuantificación de la luciferasa se expresa, en forma de fotones /s /cm
2 /sr y se representaron (+/- SD). nivel de fondo de la emisión de luz en los animales no tratados es de 5 × 10
5 fotones /s /cm
2 /sr.
Dado el aumento de la expresión del transgen de la luciferasa en 35 días post -Administración de las células, que estaban seguros de que se había formado un tumor derivado de las células inyectadas. Por consiguiente, los ratones se sacrificaron a los 35 días y se diseccionaron para buscar evidencia de la formación de tumores. Si bien externamente no hubo crecimiento notable, se observó una gran masa en la cavidad peritoneal vez que el animal se diseca. Una foto representante de la masa tumoral de un animal tratado con células Huh7 se muestra en la Figura 2B. Obtención de imágenes de los ratones antes y después de la extirpación del tumor confirmó que la expresión del transgen de la luciferasa fue localizado en la masa tumoral (Figura 2B).
Análisis histológico de la Formado tumores
hematoxilina y eosina manchadas se realizaron secciones de tejido para identificar la histología del tumor derivado de cada línea celular. La Figura 3 muestra secciones histológicas de los tumores formados a partir de células Huh7. Histología confirma que el tumor es un carcinoma hepatocelular (HCC) con diferentes grados de diferenciación (Figura 3A-D). El tumor está compuesto de células poligonales distribuidos en hojas sueltas y patrones pseudoglandulares. Los núcleos fueron moderadamente pleomórfico, vesicular y contienen un nucleolo. También se observaron algunas cifras mitóticas aisladas. El citoplasma eosinófilo y los bordes de las celdas estaban bien definido, mientras que el estroma era escasa. gotitas biliares intracelulares y extracelulares no se observaron en el tumor y tampoco lo fue de necrosis tumoral. Las características del tumor fueron confirmados por un anatomopatólogo independiente para ser consistente con un CHC Grado II (modificado Edmonson y de Steiner sistema de clasificación).
Las secciones de diferentes partes de los dos tumores fueron cortadas y teñidas con hematoxilina y eosina para el análisis histológico de los tumores. A-D) Secciones de Huh7 inyectaron a los ratones. Secciones tienen una estructura amorfa y fueron identificados como carcinoma hepatocelular (HCC) de diversos grados de diferenciación: (A) moderadamente diferenciado HCC, aumento x 10 (B-C) Secciones se analizaron por inmunohistoquímica para mostrar la distribución de la expresión de luciferasa. tinción de color marrón indica células positivas de luciferasa. (B) con tinción positiva, aumento x 40 (C) con tinción positiva, aumento x 10 (D) Control negativo: sin anticuerpo primario agregado, aumento x 10 E-H) Secciones de MIA-PaCa2 inyectaron a los ratones. Secciones tienen una estructura amorfa y fueron identificados como carcinoma pancreático (PACA) de diversos grados de diferenciación. (E) Paca moderadamente diferenciado, aumento x 10 (F-G) Las secciones se analizaron por inmunohistoquímica para mostrar la distribución de la expresión de luciferasa. tinción de color marrón indica células positivas de luciferasa. (F) con tinción positiva, aumento x 40 (G) con tinción positiva, aumento x 10 (H) Control negativo:. No añadió anticuerpo primario, aumento x 10
Además el análisis inmunohistoquímico de las secciones del tumor luciferasa (Figura 3B y 3C) mostró todas las células hepatocitos como las derivadas de las células inyectadas que se expresan luciferasa. áreas sin teñir se cree que son ya sea tejido necrótico o células reclutados para el tumor, que aún no ha sido confirmado experimentalmente y está actualmente bajo investigación.
Del mismo modo, se obtuvieron secciones de tejido teñidas con hematoxilina y eosina para los tumores formados en los ratones después de la inyección de las células MIA-PaCa2 (Figura 3E-H). En este caso, las secciones histológicas revelaron que las células tumorales formados habían penetrado entre la acinos pancreáticos normales en la periferia del tumor. Se describieron las células tumorales para ser distribuidos en hojas sólidas sin evidencia de diferenciación glandular y tienen una cantidad moderada de citoplasma con los bordes de celda bien definidos. Los núcleos fueron atípicos hipercromáticos y nucléolos mientras eran poco visible. Las figuras mitóticas eran raros. La mayoría de las células tumorales contenía una vesícula intracitoplasmática pálido empujando el núcleo a la periferia impartir una apariencia anillo de sello. moco extracelular y fibrosis del estroma no se observaron. Un anatomopatólogo independiente confirmó todas las características del tumor fueron consistentes con un carcinoma de páncreas anillo de sello.
Los pUbC-S /MAR plásmido se mantenidos en los episomas y se expresa en el tumor resultante tejidos
Para proporcionar evidencia física de la naturaleza molecular de los pUbC-S /MAR plásmido en el HCC y los tumores de páncreas, se realizó un análisis de transferencia de Southern en el ADN total aislado a partir de dos sitios diferentes de la misma tumor a los 35 días después de la entrega de cualquiera de los Huh7 o la MIA-PaCa2 línea celular.
un blot representativo se muestra en la Figura 4A, donde se detecta una banda individual del tamaño esperado en todos los carriles. Esto indica que los pUbC-S /MAR pDNA permanecen episomales a los 35 días posteriores a la entrega. Otra prueba para el mantenimiento episomal También se proporcionó por el plásmido de rescate de pUbC-S /MAR plásmido aislado a partir de
E resistente a la kanamicina. coli
después de la transformación con el ADN total del tumor derivado de Huh7 o MIA-PaCa2 ratones tratados. En este caso, sólo intacta pDNA libre de la muestra de tumor aislado produciría colonias de bacterias en placas que contienen kanamicina, el marcador de resistencia presente en el plásmido. Los patrones de restricción del plásmido pUbC-S /MAR fueron consistentes con construcciones de plásmido no integrados no modificados (que se muestran en la Figura 4E).
(A) análisis de transferencia Southern de pDNA aislado a partir de dos regiones diferentes de tejido tumoral de NOD /SCID, 35 días después de la entrega de líneas celulares estables Huh7 y MIA-PaCa2, realizados como se describe en materiales y métodos. Se muestra un patrón de hibridación representante de pDNA aislado de un animal de cada tumor. La detección de plásmido indicador de M: Escala de 1 kpb (Hyperladder I, Bioline); carril 1: pUbC-S /MAR aislado del tejido tumoral formada después de la inyección Huh7 de ratones NOD /SCID a los 35 días después de la inyección; carril 2: pUbC-S /MAR aislado de una región diferente del tejido tumoral formada después de la entrega Huh7 en ratones NOD /SCID a los 35 días después de la inyección; carril 3 pUbC-S /MAR aislado del tejido tumoral formada después de la inyección de MIA-PaCa2 de ratones NOD /SCID a los 35 días después de la inyección; carril 4: pUbC-S /MAR aislado de una región diferente del tejido tumoral formada después de la entrega MIA-PaCa2 en ratones NOD /SCID a los 35 días después de la inyección; (+) Control positivo: 25 ng de plásmido linealizado pUbC-S /MAR. (B) ensayo de replicación dependiente de pUbC-S /ADN plásmido MAR aislado de los tumores de los ratones a los 35 días post-administración. carriles 1-3: transferencia Southern de ADN tumoral total aislado a partir de ratones NOD /SCID a los 35 días posteriores a la entrega con Huh7 línea celular estable y doble digerido con
Spe
I-
Mbo I (
carril 1),
Spe
I-
Dpn
(carril 2) o
Spe
I-
BFU Estrellas: 3 enzimas CI (carril); carriles 7-9: Southern de ADN tumoral total aislado a partir de ratones NOD /SCID a los 35 días post-parto con MIA-PaCa2 línea celular estable y doble digerido con
Spe
I-
Mbo I
(carril 4),
Spe
I-
Dpn
(carril 5) o
Spe
I-
BFU gratis (6) de carril enzimas CI; M: Escala de 1 kpb (Hyperladder I, Bioline UK Ltd., Londres, Reino Unido). (C) La PCR cuantitativa a cabo en el ADN tumoral obtenida en el día 35 después de la inyección de líneas celulares Huh7 y MIA-PaCa2. Se extrajo el ADN a partir de dos sitios diferentes de cada tumor al final del experimento y el número de pUbC-S /MAR genomas de vector por genoma diploide se muestra, después de la normalización con el gen de GAPDH, como se describe en materiales y métodos. (D) Análisis de PCR de ADN aislado
in vitro
de la Huh7 (carril 1) y las células antes de la inyección en ratones NOD /SCID MIA-PaCa2 (carril 4), y
in vivo
de dos regiones diferentes del tumor para cada línea celular (calles 2,3 a 5,6 Huh7 y carriles para las líneas celulares MIA-PaCa2). Tamaño esperado del producto de PCR: 1.091 pb. escalera de ADN de 100 pb (carril M), (+) control positivo: pUbC-S /MAR; (-) Control negativo: mezcla PCR sin ADN. experimentos de rescate (E) plásmido de cuatro
E.Coli
colonias para Huh7 (carriles 1-4) y tres colonias de líneas celulares de MIA-PaCa2 (carriles 5-7), que muestra un patrón de restricción idéntico pUbC- pura S /MAR plásmido (+), después de digestión de restricción con
Spe I
enzima. M:. Escalera de 1 kpb (Hyperladder I, Bioline) guía empresas
Además, se realizó un ensayo de restricción dependiente de la replicación de mostrar replicación pDNA. El ADN total del tumor a partir de dos áreas diferentes de cualquiera de los HCC o el tumor PACA, fueron aisladas de los grupos de animales tratados con pUbC-S /MAR plásmido al final del experimento de 35 días y se digirió con
Spe
I, una única cuchilla, para linealizar el plásmido, antes de la digestión durante la noche con las enzimas sensibles a la metilación
Dpn
I,
Mbo
I o
BFU
CI. Todos los tres enzimas reconocen la misma secuencia (GATC).
Dpn
I requiere la metilación del ADN diana por las células bacterianas para la digestión, mientras que
Mbo
restricción que es dependiente de la metilación del ADN de mamíferos y
BFU
cortes Cl independientemente del estado de metilación y no distingue la fuente de metilación
.
la restricción fragmentos de digestión se separaron en un gel de agarosa al 0,8%, entonces se transfirió y se sondeó con un fragmento de 408 pb del gen de resistencia a la kanamicina. El análisis de transferencia Southern (Figura 4B) sirve para comparar el patrón de digestión de pUbC-S /MAR en el ADN aislado del tumor tratado Huh7 grupo de animales (Figura 4B carriles 1-3) con el del grupo MIA-PaCa2 (carriles Figura 4B 4-6).
Una pérdida de metilación bacteriana del plásmido pUbC-S /MAR se encuentra en el ADN aislado de ambos tumores cuando éstos se digieren con
Spe
I /
Mbo
I o
Spe
I /
Dpn I
, respectivamente (carriles 1,2,4,5). la digestión exitosa por
Mbo
que se indica mediante la conversión de la lineal
Spe
banda para fragmentos de digestión (carril 1 de Huh7 y el carril 4 de MIA-PaCa2), y la falta de digestión mediante
Dpn
I abandona la única
Spe I
linealizado banda intacta (carril 2 para Huh7 y el carril 5 de MIA-PaCa2). Como
Mbo
que sólo corta el ADN derivada de mamíferos, mientras que
Dpn
que requiere metilación bacteriana para la digestión, esto indica que pUbC-S /MAR plásmido se ha replicado en las células tumorales, tanto de la CHC y Paca. Por último, la digestión con
Spe
I-
BFU
CI no es bloqueada por cualquier tipo de metilación y sirve como control positivo para la digestión del plásmido (carriles 3 y 6). Estos datos indican que el plásmido S /MAR-albergar pUbC-S /MAR es capaz de replicarse
in vivo
después de la entrega de las líneas celulares transfectadas de forma estable, de forma similar a los estudios
in vitro
en la que S /dotado-MAR pDNA es capaz de lograr la estabilidad mitótica y la replicación [26]. El tamaño correcto de las bandas de digestión de restricción sugiere estabilidad mitótica sin reordenamientos brutas del plásmido de replicación.
PCR cuantitativa se realizó en la terminación del experimento (a los 35 días después del parto) para comparar el número de copias relativo del plásmido moléculas en el Huh7 y MIA-PaCa2 grupos tratados. Los resultados se muestran en la Figura 4C, en donde en ambos casos se calcula el número de copias del plásmido en alrededor de una a tres copias del vector /célula, en consonancia con los informes anteriores que demuestra un número de copias relativamente bajo de S /MAR vector de menos de 10 copias /celular [18], [25], [29].
Además, el mantenimiento del gen marcador transgénico también se demostró por análisis de PCR sobre el ADN aislado de las células MIA-PaCa2 y Huh7 "cultivadas" (Figura 4D , carriles 1 y 4) y en dos sitios diferentes de tejido tumoral a los 35 días después del parto (Figura 4D, carriles de 2,3 a 5,6 Huh7 y carriles para MIA-PaCa2). Un producto de PCR del tamaño esperado, 1091 bps, se generó a partir de ADN de todas las fuentes que indican que el plásmido pUbC-S /MAR se mantuvo tanto en las células Huh7 y MIA-PaCa2 y en todo el tumor derivado de estas células después de la inyección en NOD -SCID ratones. Esto verifica la presencia de la pUbC-S /MAR plásmido ambos
in vitro
y
in vivo.
Discusión
Este trabajo representa el desarrollo de modelos de tumores murinos derivan de dos líneas celulares diferentes. Significativamente, este estudio muestra por primera vez el establecimiento de marcados genéticamente modelos murinos de páncreas y carcinomas hepatocelulares utilizando un vector episomal plásmido no viral. Tanto CHC y Paca tienen una alta incidencia; HCC es la quinta forma más común de cáncer en el mundo y representa el 80-90% del cáncer primario de hígado [30] mientras que hay alrededor de 42.470 personas diagnosticadas con cáncer de páncreas cada año en los Estados Unidos con menos de un 20% de uno tasa de supervivencia al año [31].
Dada la prevalencia de estas enfermedades, es vital que se desarrolle un método eficaz para mejorar la detección y pronóstico de la enfermedad. La generación de un modelo de tumor murino marcada genéticamente efectiva para el CHC y PACA es un paso importante en este proceso, ya que permitirá a los efectos de la terapéutica potencial para ser monitoreados con mayor facilidad y precisión y por lo tanto va a permitir que los datos más fiables en el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer.
los intentos de generar tumores marcados genéticamente previamente hayan sufrido limitaciones, tales como el riesgo de la integración con vectores virales y el potencial de mutagénesis de inserción. Además, la genotoxicidad de vectores virales puede alterar considerablemente las características de su célula receptora y células hijas posteriores. Al crear xenoinjertos de tumores, el menor número de alteraciones en las células tumorales originales mejor será la representación del modelo de cáncer. Por lo tanto el desarrollo de vectores no virales en la investigación del cáncer para reducir al mínimo estos efectos adversos son cruciales. Nuestro trabajo previo ha demostrado una fuerte expresión sostenida episomal luciferasa
in vivo
, a partir de un sistema de expresión que comprende un pDNA S /MAR elemento y un promotor de mamífero en el hígado murino [11], [20], [21]. Seguimiento del transgen de la luciferasa en el tiempo en un solo animal sin la necesidad de sacrificar los animales indica la utilidad de este vector en las células tumorales genéticamente marcadas para realizar el seguimiento del desarrollo de un modelo de tumor simplemente por
in vivo
de imágenes. Como se muestra aquí, el vector de S /MAR permite la transfección estable de células de cáncer y posterior desarrollo de xenoinjertos de tumores de HCC y PACA. En este trabajo se describe la primera demostración del uso funcional de un vector de S /MAR para transfectar de forma estable células cancerosas genéticamente para marcar tumores
in vivo
.
Los estudios previos
in vitro
han demostrado que S /MAR vectores pueden replicarse episomalmente independientemente del promotor usado. Nos confirmar y ampliar esta observación utilizando el vector pUbC-S /MAR en líneas celulares Huh7 y MIA-PaCa2. Hemos obtenido resultados similares utilizando el vector PEPI-Luc - un plásmido de S /MAR en donde la expresión de luciferasa es conducida por el promotor de CMV humano (datos no mostrados). Sin embargo, un estudio previo para marcar las células tumorales genéticamente con un transgen de la luciferasa dirigido por el promotor CMV [4] ha demostrado las limitaciones de este promotor para la expresión del transgen a largo plazo, ya que el promotor de CMV se inactiva fácilmente por varios mecanismos huésped tales como CpG metilación [11], [14], [15], [16], [17]. Esta limitación se ha superado por nuestro estudio, lo que demuestra una expresión sostenida a partir del promotor UbC de mamífero en combinación con un elemento de S /marzo establecimiento diferencial de las células puede dar cuenta de las diferencias en la expresión de la luciferasa observada entre animales en cada grupo después de la administración.
análisis histopatológico de los tumores mostró la morfología del tejido típico esperado de PACA y HCC (Figura 3) y el análisis inmunohistoquímico mostró todas las células tumorales derivadas de los inyectada en el ratón para ser positivos luciferasa (Figura 3). Teniendo en cuenta esto y la expresión del transgen a largo plazo alcanzó durante 35 días después de la inyección, donde se observa un fuerte aumento de la expresión después de 21 días (Figura 2C), este S /MAR vector parece ser ideal para su uso en líneas celulares de cáncer de generar un modelo murino marcado genéticamente de esta enfermedad.