Extracto
Antecedentes
cánceres humanos consumen grandes cantidades de glucosa en comparación con los tejidos normales con la mayor de ser convertido y se excreta como lactato a pesar de la disponibilidad de oxígeno abundante (efecto Warburg). Por tanto, la mayor tasa subyacente de la glucólisis está en la raíz de la formación de tumores y el crecimiento. El control normal de las enzimas glucolíticas alostéricos aparece con deficiencias en los tumores; Sin embargo, el fenómeno no se ha resuelto por completo.
Metodología /Principales conclusiones
En el presente trabajo, se muestra evidencia de que el nativo de 85-kDa de 6 fosfofructo-1-quinasa (PFK1) , una enzima reguladora clave de la glucólisis que es normalmente bajo el control de la inhibición por retroalimentación, se somete a modificación postraduccional. Después de la escisión proteolítica de la porción C-terminal de la enzima, se formó un fragmento activo, más corto 47-kDa que era insensible a la inhibición de citrato y ATP. En líneas celulares tumorigénicas, sólo los fragmentos cortos pero no el nativo de 85-kDa PFK1 se detectaron por inmunotransferencia. fragmentos similares se detectaron también en un tejido tumoral que se desarrolló en ratones después de la infección subcutánea con células B16-F10 tumorigénicas. Sobre la base de la digestión proteolítica limitada del músculo de conejo PFK-M, se obtuvo una forma más corta inhibición resistente citrato activa, lo que indica que una única etapa de modificación postraduccional era posible. Las masas moleculares exactos de los fragmentos activos PFK1 más cortos se determinaron mediante la inserción de los genes truncados construidos a partir de músculo humano PFK1 ADNc en un
PFK
nula
E. coli cepa
. Dos
E. coli
transformantes que codifican para los PFK1s modificadas de 45.551 Da y 47.835 Da crecieron en medio de glucosa. La inserción del ser humano truncado modificado
PFK
M genes también estimuló el consumo de glucosa y lactato en la excreción transfectantes estables de células humanas HEK no tumorigénicos, lo que sugiere la importancia del papel de los fragmentos más cortos PFK1 en el aumento de flujo glucolítico.
Conclusiones /Importancia
modificación postraduccional de enzima PFK1 podría ser el factor decisivo del flujo glucolítico desregulado en los tumores que en combinación con mecanismos de señalización alteradas apoya en lo esencial rápida proliferación de las células cancerosas
Cita.: Šmerc A, Sodja E, Legisa M (2011) postraduccional Modificación de 6-fosfofructo-1-quinasa como una característica importante de cáncer Metabolism. PLoS ONE 6 (5): e19645. doi: 10.1371 /journal.pone.0019645
Editor: Anil Kumar Tyagi, Universidad de Delhi, India
Recibido: Diciembre 10, 2010; Aceptado: April 12, 2011; Publicado: 4 Mayo 2011
Derechos de Autor © 2011 Šmerc et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue financiado por la Agencia de Investigación de Eslovenia (Contrato Nº J4-9606 y 1000-07-310027; http://www.arrs.gov.si/sl/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
una característica consistente de las células malignas es el consumo de una cantidad mayor de la glucosa en comparación con la de las células normales y la conversión de la mayoría de la glucosa en ácido láctico. Las células tumorales utilizan preferentemente glicólisis sobre la fosforilación oxidativa mitocondrial para la producción de ATP dependiente de la glucosa, incluso en presencia de oxígeno suficiente para alimentar la respiración mitocondrial. [1]. Por tanto, este metabolismo energético desviada, conocido como el "efecto de Warburg," está en la raíz de la formación de tumores y el crecimiento y se ha discutido incluso como un sello distintivo potencial de cáncer [2].
En la última década, la descubrimiento de los oncogenes desvía el interés fuera de los estudios de metabolismo celular en los tumores hacia las destinadas a descubrir la función de los oncogenes que controlan el metabolismo. Hasta el momento, los factores cruciales reconocidos para producir el fenotipo metabólico cáncer parecen ser las mutaciones oncogénicas que alteran el factor de crecimiento de señalización a través de la PI3K /Akt /mTOR [3]. La activación de esta vía de mejora las actividades metabólicas de la glucólisis por dos eventos principales. En primer lugar, se induce la síntesis de la Glut1 transportador de azúcar para facilitar la captación de glucosa por las células [4], [5]. En segundo lugar, la actividad de transcripción complejo HIF-1α aumenta, lo que, en cooperación con el factor de transcripción c-Myc mejora la síntesis de la mayoría de las enzimas glucolíticas [6]. Las mayores cantidades de las enzimas de tipo salvaje en consecuencia, resultan en un aumento de las actividades específicas. Sin embargo, el flujo glucolítico en organismos eucariotas está estrechamente controlada por enzimas alostéricos que conservan su regulación por la inhibición por retroalimentación a pesar de las actividades elevadas de enzimas intermediarias. Esta afirmación ha sido confirmada por los experimentos in
E. coli
[7] y
S. cerevisiae
[8], donde la sobreexpresión de todas las enzimas glucolíticas no tuvo ningún efecto sobre la tasa de consumo de glucosa y /o la producción de etanol. Por lo tanto, uno se ve obligado a concluir que las modificaciones importantes de la cinética de enzimas reguladoras también deben ser involucrados en los cambios metabólicos que se producen durante la transformación de células de mamíferos normales en células cancerosas.
La glucólisis es central en el metabolismo primario y normalmente, está estrechamente regulada por tres enzimas alostéricos, la hexoquinasa, la 6-fosfofructo-1-quinasa (PFK1) y piruvato quinasa (PK), que catalizan pasos irreversibles individuales. Hexoquinasa, que participan en la primera etapa reguladora, aparece predominantemente en una forma isoenzima HK2 en los tumores que se une a la membrana externa mitocondrial frente al citosol. Microposición de esta enzima permite el acceso preferencial a ATP recién sintetizado para fosforilar la glucosa, y es resistente a la inhibición del producto [9]. Otra enzima alostérico es la piruvato quinasa, que regula el flujo metabólico a través de la parte terminal de la glucólisis. Las células tumorales han demostrado expresar exclusivamente la isoforma embrionaria M2 de PK que puede ser activado por la fructosa-1,6-bisfosfato. Sin embargo, la unión de péptidos de tirosina fosforilada a resultados PK-M2 en la liberación del activador alostérico, que conduce a la inhibición de la actividad enzimática. La desactivación de PK-M2 en las células tumorales se cree que desviar el metabolismo de la glucosa de la producción de energía para los procesos anabólicos [10].
Sin embargo, el control más complejo sobre el flujo glucolítico se atribuye a PFK1 (CE 2.7.1.11), la cual supera las funciones de regulación de las otras dos enzimas alostéricos. PFK1 cataliza la fosforilación de la fructosa-6-fosfato a fructosa-1,6-bisfosfato, usando MgATP como donante de fosforilo [11]. PFK1 es estimulada por la fructosa-2,6-bifosfato (F-2,6-BP), los iones de ADP /AMP y de amonio, mientras que los inhibidores fuertes como citrato y actuar ATP [11], [12].
durante la evolución, las enzimas eucariotas PFK1 desarrollados por la duplicación, la fusión tándem y divergencia de sitios catalíticos y de unión efectoras de un antepasado procariota [12]. Sin embargo, la conservación estricta entre los residuos de sitio activo en el segmento N-terminal de la enzima eucariótico y las de PFKs bacterianos sugieren que el sitio activo de PFK1 eucariota se encuentra sólo en la porción N-terminal [12]. Por otro lado, los sitios alostéricos de unión a ligando que se desarrollaron durante la evolución por mutaciones en el C-terminal permiten el ajuste fino de la enzima reguladora por los niveles elevados de metabolitos intermedios específicos. Uno de los ligandos alostéricos es el citrato, que actúa como un inhibidor potente de todas las isoformas de mamíferos PFK1. Los estudios sobre los sitios alostéricos de citrato en el músculo de conejo PFK1 llegaron a la conclusión de que estos sitios desarrollados a partir del fosfoenolpiruvato (PEP) /ADP sitio alostérico de
Escherichia coli
. Los residuos de aminoácidos que forman el sitio alostérico citrato se encuentran tanto en los extremos N- y C-terminales de la molécula [13].
En los genomas de mamíferos, tres genes PFK1 diferentes están presentes y son expresados de manera diferente en los tejidos individuales. En los tejidos humanos, sus productos proteicos tienen las siguientes masas moleculares: tipo de músculo (PFK-M), 85.051 Da [14]; Tipo de hígado (PFK-L) 84.917 Da [15]; y el tipo de plaquetas (PFK-P), 85.596 Da [16].
Las tres isoenzimas están fuertemente inhibidas por citrato, con IC
50 valores de 0,08, 0,13 y 0,18 mM para el cerebro (plaquetas), músculo, hígado y PFK1, respectivamente [17]. También se informa de todas las isoformas PFK1 humanos para ser intensamente inhibida por concentraciones de ATP superiores a 0,05 mM, sin embargo, (F-2,6-BP) puede antagonizar los efectos negativos de la ATP hasta cierto punto [18].
Actualmente , en las células cancerosas, la actividad de las enzimas PFK1 se cree que es hasta reguladas sólo por la pérdida de función de p53, lo que resulta en la regulación por disminución de la proteína del proyecto TIGAR que actúa como una fructosa-2,6-bisfosfatasa [19 ]. En consecuencia, el nivel de F-2,6-BP se mantuvo alta en tumores y actuó como un fuerte estímulo positivo.
Sin embargo, una isoforma PFK1 que era menos sensible a la inhibición de citrato (K
i = 0,75 citrato mM) y más sensible a la activación por F-2,6-BP fue descrito en glioma humano [20]. Una isoforma PFK1 con características cinéticas similares también se observó en el rápido crecimiento de roedores células de hepatoma AS-30D, que mostraron insensibilidad completa hacia sus inhibidores alostéricos, citrato y ATP, en presencia de concentraciones fisiológicas de F-2,6-BP. Además, la enzima fue muy activa por sus activadores NH
4
+, AMP, y F-2,6-BP [21]. Sin embargo, la naturaleza de isoformas PFK1 que exhiben cambios en la cinética de la enzima no se ha estudiado en detalle.
Una forma de inhibición resistente citrato de PFK1 que fue activada a un nivel superior por activadores alostéricos Recientemente se ha descrito en la importancia comercial hongos,
Aspergillus niger
[22] - [24]. Estas características cinéticas se atribuyeron a 49-kDa subunidades, que son moléculas relativamente pequeñas PFK1 con respecto a otros eucariotas PFK1s de aproximadamente 85 kDa. Otros estudios demostraron que los fragmentos más cortos de 49 kDa están formados por una modificación posterior a la traducción de dos etapas de la enzima nativa de 85 kDa [23] - [25].
En el presente informe, se presenta evidencia de que una modificación postraduccional similar de la PFK1 de tipo muscular nativo también se puede producir en células de cáncer de mamífero que por lo tanto conduce a la formación de fragmentos más cortos PFK1 activos con parámetros cinéticos modificados.
resultados
los análisis de aminoácidos secuencias de la humana PFK-M proteína
el origen de los genes de mamíferos que codifican enzimas PFK1 por la duplicación de genes procariotas antepasado [12] se pueden confirmar por la alineación de secuencias de residuos de aminoácidos de las mitades N- y C- de la isoenzima PFK-M humana, que muestra una homología sustancial (suplementario Fig. S1). Análisis realizado por CLUSTALW [26] reveló identidad 25,4%, 21,6% fuerte similitud, 11,6% de similitud débil y 41,8% de diferencia entre los residuos de aminoácidos de las dos mitades de la estructura primaria.
Los estudios sobre modificación postraduccional de
A. niger
PFK1 mostró que la enzima nativa se escindió primero por la proteasa de serina a una proteína más corta que fue inicialmente inactiva, pero la actividad recuperó después de la fosforilación de un residuo de treonina específica que se encuentra en la enzima centro activo [25]. Un residuo de aminoácido cargado negativamente (treonina fosforilada) era esencial para la generación de actividad de la enzima [25]. Al reemplazar el codón para el residuo de treonina con una para el ácido glutámico en el
A truncado. niger PFK
A, la necesidad de que la fosforilación de fragmentos inactivos inicialmente PFK1 más cortos fue eliminada y fragmentos activos PFK1 más cortos fueron codificados directamente por el
PFK modificado
una genes [25]. Mediante la alineación de las secuencias de aminoácidos deducidas de tres isoenzimas humanos con el de la
A. niger
enzima (suplementario. Fig S2), un residuo de aminoácido cargado negativamente (ácido aspártico) se encontró sólo en la secuencia de PFK-M en la posición correspondiente al residuo de treonina en el
A. niger
proteína. Las otras dos isoenzimas, PFK-L y PFK-P, contenían un residuo de alanina no polar en el sitio de juego. PFK-M con un residuo de ácido aspártico cargado negativamente en este locus crítico por lo tanto, se llegó a la conclusión de ser el candidato más probable para la generación de fragmentos PFK1 más corto activos después de una sola etapa de modificación postraduccional.
In vitro
modificación postraduccional de PFK1 mamíferos
Para comprobar que, PFK1 se aisló a partir de músculo de conejo. La enzima purificada se incubó con diversas proteasas y se prueba para la presencia de, PFK1, fragmentos generados recientemente activas citrato de inhibición resistente más cortos. Varias proteasas disponibles comercialmente de diversas especies se emplearon en los experimentos individuales.
El experimento se realizó en un tampón que contiene citrato 5 mM, que funciona como un inhibidor potente de la enzima nativa, pero no de los fragmentos más cortos. Después de la proteolisis limitada de la PFK1 nativa purificada con proteinasa K (0,001 mg /ml), no se detectó actividad PFK1. Se detectó un aumento gradual de la actividad PFK1 en las muestras que fueron expuestos a la acción proteolítica durante períodos prolongados de tiempo (Fig. 1). Con SDS-PAGE, se observaron fragmentos de aproximadamente 45 kDa después de la proteólisis limitada con 0,001 mg /ml de proteinasa K (suplementario Fig. S3), mientras que la incubación con proteinasa K a una concentración mayor (0,01 mg /ml) produjo inactivo, ligeramente más corta fragmentos. No hay fragmentos activos podrían ser detectados después de la escisión de la enzima nativa con otras enzimas comercialmente disponibles de microbiano o de mamífero.
Actividades del PFK1 nativo aisladas de músculo de conejo después de proteólisis limitada por la proteinasa K (oscuro) y nativa no tratada enzima (la luz) como se mide en un sistema que contiene citrato 5 mM. Los datos son representativos de tres mediciones independientes y se presentan como media ± desviación estándar.
Este experimento mostró principalmente que una modificación posterior a la traducción de un solo paso de PFK1 mamíferos era posible para la obtención de los fragmentos activos PFK1 más cortos. La proteasa que fue en realidad implicado en la producción de tales fragmentos en células humanas que queda por determinar, pero los candidatos más probables son serina proteasas que deben ser activados intracelularmente.
Detección de fragmentos cortos PFK-M en la célula tumoral metastásico líneas por inmunotransferencia
para examinar qué formas PFK1 están presentes en las células tumorales, cuatro líneas de células neoplásicas diferentes que se sabe que inducen tumores metastásicos después se utilizaron inserción en animales de prueba. Se probaron las siguientes líneas celulares: células HeLa de carcinoma humano; Las células de melanoma de ratón B16-F10; y dos linfomas, la línea Nb2-11 rata y la línea de TF-1 humano. Para el Western Blot, un anticuerpo generado contra un epítopo de centro activo de la enzima que fue idéntico en diversas isoformas PFK1-M de mamíferos, pero no en L o P isoformas, se empleó.
En los homogeneizados de todos célula neoplásica líneas, la cantidad de PFK1 nativa de 85 kDa estaba por debajo del límite de detección de inmunotransferencia (Fig. 2). Sin embargo, se vio un número de fragmentos de menor peso molecular. En todos los homogeneizados de células, fragmentos de aproximadamente 47 kDa estaban presentes, mientras que algunos otros fragmentos aparecieron esporádicamente. En contraste con las líneas de células tumorigénicas, sólo se observaron los 85 enzimas nativas kDa PFK1 en los linfocitos aislados de sangre humana periférica. enzimas nativas fueron predominantes también en células de riñón embrionario humano (HEK 293) de la línea celular utilizando un método de inmunotinción idénticos. células HEK fueron inmortalizados por adenovirus pero no eran tumorigénicas. Aunque no fragmento de bajo peso molecular 47 kDa se detectó en las células HEK, se observaron algunas formas enzima nativa ligeramente más cortos que podría ser un producto de corte y empalme alternativo. En el músculo humano, una alternativa transcripción que codifica una isoenzima PFK-M se ha informado, produciendo una enzima activa con 749 residuos de aminoácidos y una masa molecular de 81.776 Da [27]. La evidencia de corte y empalme alternativo del gen PFK-M también se ha informado en ratones [28]
.
transferencias Western de cuatro líneas celulares tumorigénicas (arriba) mostró la presencia de fragmentos de diferentes longitudes, con un fragmento de 47 kDa presente regularmente, mientras que ningún nativo de 85-kDa PFK1 se pudo observar. En líneas de células no neoplásicas (abajo) (células HEK), las formas PFK1 nativos fueron predominantes, mientras que en los linfocitos normales aislados de sangre humana periférica sólo se detectó una única banda de proteína correspondiente a 85 kDa PFK1 nativo. En el Western blot de los linfocitos dos volúmenes de lisado celular se aplicaron al gel:. 10 l (izquierda), y 20 l (derecha)
En el control, no se observaron bandas cuando una muestra de medio de crecimiento fue immunoblotted con los anticuerpos utilizados para la detección PFK1.
detección de fragmentos cortos PFK-M en tumores por
inmunotransferencia en un tumor que se ha desarrollado en un ratón C57BL /6, 10 días después de la inyección subcutánea de células B16-F10, se detectaron fragmentos casi idénticos como en las células B16-F10 que crecen en un cultivo de tejido (Fig. 3). Sin embargo, en un tumor, una fuerte banda correspondiente a la enzima nativa PFK-M estaba presente que la mayoría probablemente se originó a partir de tejido de soporte no tumorigénicos tales como vasos sanguíneos, estroma o células inflamatorias. Inspección más detallada de los fragmentos más cortos de las células B16-F10 y correspondiente tumor reveló que el 47 kDa fragmento estaba presente en las células que crecen de forma individual, mientras que los que se desarrolló en un tumor expresa un fragmento de 45 kDa
.
No enzima nativa era PFK1 detectado en las células que crecen en un cultivo de tejidos, mientras que en un tumor, una fuerte señal correspondiente a la enzima nativa estaba presente. fragmentos más cortos se detectaron en ambos homogeneizados con un fragmento de 47 presentes en las células que crecen de forma individual y un fragmento de 45 kDa presente en un tejido tumoral.
truncado músculo humano PFK1 ADNc codifica cortos fragmentos activos de la PFK-M en
E.coli
células con nativa interrumpido
PFK
un
en el siguiente paso, la eficiencia de los fragmentos activos más cortos humanos PFK-M se puso a prueba en un
E. coli
cepa que carecía de sus propias proteínas nativas PFK1. Aunque la masa molecular exacto de los fragmentos más cortos no pudo determinarse a partir de transferencias de Western, se prepararon una serie de genes truncados de músculo humano PFK1 cDNA. genes truncados se insertaron en el
E. coli
RL 257 [29] de deformación, y los transformantes se ensayaron para determinar las características de crecimiento alteradas en un medio que contiene glucosa. Las proteínas codificadas por genes truncados diferían en varios residuos de aminoácidos y las masas moleculares cubiertos que van de 45 kDa a 46 kDa y 47 kDa a 48 kDa (Tabla suplementaria S2). Dos transformantes capaces de crecer en glucosa suplementado medio mínimo se revelaron, uno de cada grupo de masas moleculares (Fig. 4). La primera cepa sintetizado número Fragmento 4 (suplementario S2 Tabla) con 422 residuos de aminoácidos y una masa molecular de 45.551 Da, mientras que la otra cepa codificada número Fragmento 9 (Tabla suplementaria S2) con 443 residuos de aminoácidos y una masa de 47.835 Da. Las células de ambas cepas se multiplicaron a una densidad óptica de 2 en aproximadamente 24 horas, lo que indica que ambas proteínas recombinantes fueron activos y capaces de participar de manera efectiva en el metabolismo bacteriano. No hay crecimiento de transformantes que codifican otros fragmentos PFK-M más cortos se puede observar, a pesar de proteínas recombinantes sintetizados se detectaron mediante transferencias de Western (suplementario. Fig S4). No hay crecimiento en medio de glucosa puede ser detectado por un control, la cepa parental RL257 que lleva el plásmido pALTER-Ex1 sin gen insertado. Sorprendentemente, el transformante que codifica la humana nativa PFK-M (85.051 Da) no fue capaz de proliferar en condiciones idénticas, aunque se detectó una elevada actividad enzimática (más de 600 mU /ml) en el extracto libre de células.
dos
E.coli
transformantes que codifican fragmento 4 (⧫) y el fragmento 9 (□) fueron capaces de crecer en glucosa en medio mínimo suplementado. No crecimiento de la cepa parental, RL 257, que lleva el plásmido pALTER-Ex-1 sin gen insertado (•) podía ser detectado. Los datos son representativos de tres mediciones independientes y se presentan como media ± desviación estándar.
En ambos transformantes que eran capaces de crecer en medio de glucosa, se detectó la actividad PFK1 en los homogeneizados. En ambos transformantes que eran capaces de crecer en medio de glucosa, se detectaron actividades PFK1 en los homogenados. En el transformante codifica para un fragmento 9, la actividad resistente a ATP y la inhibición de citrato fue grabado en 0,5 mM de F6P que está cerca de la concentración fisiológica [30]. El fragmento 9 mostró una alta afinidad hacia el ATP (K
m de aproximadamente 0,05 mM), mientras que a concentraciones superiores a 0,2 mM, ATP no inhibición podría ser detectado (Fig. 5A). Por el contrario, la recombinante humana nativa 85 kDa PFK-M aislado de
E.coli cepa
RL257 mostró un pico en las actividades de la enzima en concentraciones crecientes de ATP. A bajas concentraciones de ATP de las actividades aumentaron más lentamente en relación con el fragmento más corto, lo que indica baja afinidad de la enzima nativa hacia el ATP (K
m~0,3 mM). Sin embargo, por encima de las concentraciones de ATP 0,6 mM causó una fuerte disminución de la actividad de la enzima nativa y se detectó solamente una actividad modesta en PFK1 concentración de ATP de 1 mM (Fig. 5A). El citrato de sodio no inhibió la actividad del fragmento más corto PFK-M (Fig. 5B). Esto es en contraste a las características cinéticas de la enzima PFK-M nativa humana recombinante en donde una fuerte sensibilidad hacia el citrato se reveló [31]. No inhibición del fragmento más corto con lactato se pudo detectar ya sea (Fig. 5B), un metabolito que ha sido recientemente propuesto para regular hacia abajo las actividades PFK1 ratón [32].
En la figura 5A actividades relativas PFK1 específicos detectados en el homogeneizado del transformante codifica para un fragmento 9 (□) y con la enzima nativa PFK-M aislado de
E. coli
transformante (○) se muestran, que se mide a concentraciones crecientes de ATP. En la figura se midieron 5B actividades PFK1 específicas en el homogeneizado del transformante codifica para un fragmento 9 sin inhibidor (□), en presencia de mM Na 5
3-citrato (◊), y con 5 mM Na-lactato (Δ) . Todas las mediciones se realizaron con 0,5 mM de F6P. Los datos son representativos de al menos tres mediciones independientes y se presentan como media ± desviación estándar.
curvas de saturación fructosa-6-fosfato sin y con F-2,6-BP mostraron un cambio en PFK- M actividades tanto de la enzima nativa (Fig. 6A) y el fragmento de 9 (Fig. 6B). Mediante la adición de F-2,6-BP al sistema de medición, una parcela sigmoide se convirtió a la cinética de Michaelis-Menten, caracterizadas por un fuerte aumento en las actividades con respecto a la concentración de sustrato. Aunque F-2,6-BP aumentó la afinidad de ambas enzimas hacia el F6P como sustrato, el activador también causó un marcado aumento en la velocidad máxima de la más corta Fragmento 9 (Fig. 6B), mientras que este efecto no podía ser registrada con el se presentan enzima nativa (Fig. 6A).
En la figura 6A curvas de saturación F6P de la enzima nativa aislada PFK-M con (○) y sin (◊) 4 micras, de F-2,6-BP. En la figura 6B F6P curvas de saturación detectan en el homogeneizado del transformante codifica para un fragmento 9 con (□) y sin (Δ) 4 M de F-2,6-BP se muestran. Las mediciones se llevaron a cabo con 1 mM de ATP. En ambos gráficos se muestran las actividades relativa específicos. Los datos son representativos de al menos tres mediciones independientes y se presentan como media ± desviación estándar.
Los fragmentos más cortos PFK-M parecían ser extremadamente inestable en las condiciones in vitro. La actividad puede ser estabilizado en cierta medida en un extracto libre de células que contenía aproximadamente 10 mg de proteínas por ml mediante la adición de fructosa-6-fosfato a una concentración final de 6 mM. Sin embargo, la desactivación rápida se registró en el vial de medición (suplementario. Fig S5) cuando la cantidad de proteínas disueltas se redujo significativamente. Después de aproximadamente 10 minutos de incubación a 30 ° C, sin consumo de NADH puede ser detectada en el sistema.
La expresión de h
PFK
MFrg9 en células HEK no tumorigénicos 293 que promueve el crecimiento, el consumo de glucosa y lactato
producción
Para determinar si las enzimas PFK-M modificados tienen efectos fisiológicos similares en las células humanas no tumorigénicas (Flp-in T-Rex línea celular HEK 293), se prepararon transfectantes estables que permitieron la expresión constitutiva de h
PFK
M nativa que codifica la PFK-M y h
PFK
MFrg9 que codifica la tasa de crecimiento 9. PFK-M Fragmento, el consumo de glucosa y la acumulación de lactato fueron comparados con los de los transfectantes que porta plásmido vacío integrado en condiciones de crecimiento idénticas. Las células que expresan h
PFK
M y H
PFK
MFrg9 proliferaron más rápidamente en comparación con las células de los padres, como se observa en el gráfico semilogarítmico, sin embargo los análisis detallados de una trama lineal de los mismos datos sugerido una fase de retardo ligeramente más corta de las células transfectadas con respecto a la cepa parental (Fig. 7A). Se observó que la diferencia más drástica entre los transfectantes probados para la excreción de lactato. A las 24 horas de incubación, la cantidad de lactato acumulado en el medio y normalizado a 1 millón de células reveló cuatro pliegues mayor productividad por la cepa sintetizar Fragmento 9 con respecto a la cepa que codifica la nativa PFK-M y seis pliegues más altos en comparación con el cepa parental. Al día dos, la cantidad de lactato acumulado era todavía aproximadamente 30% mayor por las células con el fragmento de 9, mientras que más tarde, valores similares fueron obtenidos por las tres líneas celulares analizadas (Fig. 7C). El aumento de la producción de lactato por las células que expresan el h
PFK
gen MFrg9 se reflejó también en las tasas de consumo de glucosa. A las 24 horas, la cantidad más alta de glucosa, normalizados al número de células fijo, ha sido tomado por las células que codifica el fragmento 9, alrededor del 40% menos glucosa fue consumida por las células que sintetizan la enzima nativa PFK-M, mientras que el parental Las células metabolizan la glucosa incluso menos (Fig. 7B).
En el crecimiento 7A figura de Flp-In T-Rex células HEK 293 con h integrados
PFK
MFrg9 (h
PFK
MFrg9 /HEK - ▪) que codifica el fragmento 9; integrada h
PFK
M (h
PFK
M /HEK - •) que codifica la enzima nativa PFK-M; y células con plásmido vacío integrado (HEK - ◊) se presentan en modo logarítmico. En la figura 7B el consumo de glucosa por transfectantes normalizados a 1 millón de células se muestra. En la figura 7C producción de lactato recalculado a 1 millón de células que se presenta. Se utilizan símbolos idénticos para transfectantes individuales en todas las figuras. Los datos son representativos de tres mediciones independientes y se presentan como media ± desviación estándar.
Discusión
Una variedad de oncogenes, incluyendo Akt [33], BCR-Abl [34], c-Myc y HIF [35], promover el metabolismo de la glucosa en las células cancerosas. Sin embargo, la activación de Akt solo, que codifica una serina /treonina quinasa que está bajo el control de PI3K phosphatidylinositide-3-quinasa, se ha demostrado suficiente para estimular el cambio a la glucólisis aeróbica [36]. Sin embargo, los cambios moleculares subyacentes a nivel de las enzimas glucolíticas reguladoras siguen siendo poco conocidos. La activación constitutiva de Akt se ha implicado en la regulación de la proliferación celular [37] y sugerido para participar en la promoción de la actividad del transportador Glut1 [4]. Además, el papel estimulante de la vía de señalización de PI3K /Akt se ha informado en la inducción proteolítica dependiente de hormonas (la expresión de genes de la calicreína) en cáncer de mama [38] y de próstata [39] líneas celulares de cáncer. calicreínas de tejidos humanos pertenecen a un subgrupo de serina proteasas que son similares a la proteinasa K, que hemos demostrado aquí para escindir enzimas PFK1 nativas para formar, más cortos fragmentos PFK1 inhibición resistente citrato activos. Por lo tanto la inducción, mediada por Akt de la glucólisis aeróbica también podría estar implicada en la modificación postraduccional de PFK1 mediante la activación de enzimas proteolíticas
.
Esta hipótesis está apoyada por los resultados similares obtenidos con las células transfectadas que expresan constitutivamente Akt [36] y la las células que sintetizan fragmentos altamente activos PFK1 más cortos en este estudio. Ambos tipos de células consumen glucosa más rápidamente y lactato en rendimientos más altos en comparación con las células transfectadas con la ONU excretan.
Con los experimentos de transferencia Western de células oncogénicas y normales sin enzima nativa de 85 kDa pudo detectar en las células neoplásicas, mientras un fragmento de 47 kDa fue característicamente presente. Sin embargo, algunos otros fragmentos más pequeños fueron vistos también. Lo más probablemente se originaron de la PFK1 nativo ya que el anticuerpo utilizado, ha demostrado ser lo suficientemente específico y no péptidos de bajo peso molecular apareció en el lisado de linfocitos y células HEK. Además, se sabe poco sobre la actividad proteolítica citosólico en las células cancerosas, por lo tanto, es difícil especular sobre el número de proteasas que podrían atacar la enzima PFK1. Sin lugar a dudas, una mejor información acerca de la modificación postraduccional se lograría mediante el uso de un alelo PFK1 epítopo de etiquetado. De hecho hemos probado AU1 etiqueta de epítopo [40] que fue el N-terminal fusionado a la nativa PFK-M. Aunque etiquetadas
PFK
-M gen se expresó y se detectó la proteína, se pudo detectar ninguna actividad de la enzima (datos no mostrados). Creemos que la extensión de seis residuos de aminoácidos influyó en el plegamiento de la proteína en las células e impidió la asociación correcta de monomeres en una holoenzima tertameric activo. Desafortunadamente, la enzima inactiva no se podría emplear para los estudios de modificación postraduccional por escisión proteolítica.
Curiosamente, se detectaron ligeramente diferentes fragmentos más cortos en las células B16-F10 que crecen individualmente y en un tejido tumoral. Sin embargo, en experimentos in vivo realizados en
E.coli
transformantes reveló que ambos 45 y 47 kDa fragmentos PFK-M podrían asociar a una holoenzima activa. Esta observación sugiere que las diferentes condiciones ambientales podrían influir en la modificación postraduccional de PFK-M en las células B16-F10.
Después de la modificación postraduccional de PFK-M, se conserva la actividad enzimática, ya que el sitio activo de la PFK1s eucariota es situado en el N-terminal [12]. Sin embargo, las características cinéticas de los fragmentos más cortos PFK-M se cambian (Fig. 5-6). enzimas modificadas más importantes se vuelven insensibles a la inhibición de citrato y ATP. Por una escisión proteolítica de la parte C-terminal de la molécula nativa algunos componentes del sitio de unión de citrato se pierden, así como un motivo responsable de la inhibición por ATP (suplementario. Fig S1). cambios cinéticos similares de los fragmentos PFK1 modificados también se observaron después de la modificación postraduccional de la enzima PFK1 nativo en el hongo filamentoso
Aspergillus niger
[24]. 5′-AATTATGGATCCATGACCCATGAAGAGCACC-3′.
doi:10.1371/journal.pone.0019645.s006
(TIF)
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