Extracto
El cáncer sigue siendo una de las principales causas de muerte en todo el mundo, y la búsqueda de nuevos tratamientos sigue siendo una gran reto. Estudios anteriores demostraron que las formas modificadas de la pectina, un polisacárido complejo presente en la pared celular vegetal primaria, poseen propiedades contra el cáncer. Sin embargo, el mecanismo de acción de la pectina modificada y las rutas implicadas no son claros. Aquí, se muestra que la pectina cítrica modificada por tratamiento térmico la muerte celular inducida en HepG2 y células A549. La muerte celular inducida por apoptosis difiere de la clásica porque no se observó escisión de ADN. Además, Z-VAD-FMK, un inhibidor de pan-caspasa, no influyó en la muerte celular observada en las células HepG2, pero parecía ser parte de protección en las células A549, lo que indica que la pectina cítrica modificada por calor podría inducir la muerte celular independiente de caspasas. Un aumento en la abundancia de la proteína fosfatidiletanolamina conjugada con cadena ligera 3 (LC3) y una disminución en la abundancia de proteínas p62 se observó en ambos tipos de células cuando se incuban en presencia de la pectina cítrica modificada con el calor. Estos resultados indican la activación de la autofagia. Para nuestro conocimiento, este es la primera vez que la autofagia se ha revelado en las células incubadas en presencia de una forma modificada de la pectina. Esta activación autofagia parece ser protector, al menos para las células A549, ya que su inhibición con 3-metiladenina aumentó la citotoxicidad inducida por la pectina modificada observado. Este estudio confirma el potencial de la pectina modificada para mejorar los tratamientos quimioterapéuticos de cáncer
Visto:. Leclere L, M Fransolet, Costa M, Cambier P, T Arnould, Van Cutsem P, et al. Modificados-Heat (2015) pectina de cítricos induce la apoptosis-Al igual que la muerte celular y la autofagia en las células HepG2 y células cancerosas A549. PLoS ONE 10 (3): e0115831. doi: 10.1371 /journal.pone.0115831
Editor Académico: Daolin Tang, Universidad de Pittsburgh, Estados Unidos |
Recibido: 11 Agosto, 2014; Aceptó 2 de diciembre de 2014; Publicado: 20 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Leclere et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. L. Leclère era el beneficiario de una beca FRIA (Fonds pour la formación de la Recherche et dans l'Industrie dans l'Agricultura, Bruselas, Bélgica) . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer sigue siendo una de las principales causas de muerte en todo el mundo. A pesar de una amplia gama de enfoques terapéuticos, el cáncer no se puede curar fácilmente, y muchos tipos de cáncer todavía tienen una baja tasa de curación. Si bien es esencial para el tratamiento, la quimioterapia y la radioterapia son también fuentes de muchos efectos secundarios, ya veces la cirugía puede faltar metástasis. Estas son las razones por las cuales el desarrollo de nuevas terapias para mejorar los tratamientos existentes es un reto importante. Los compuestos naturales y fitoquímicos han alcanzado recientemente un gran interés por su capacidad para modular las vías de señalización implicadas en la proliferación del cáncer y la metástasis o por su potencial de protección en radioterapia, tal como fue revisado por Hazra [1].
Las pectinas son abundantes y complejo componentes de la pared celular vegetal primaria y son bien conocidos como fibra dietética. polisacáridos de pectina incluyen homogalacturonano (HG), galacturonanos sustituidos, ramnogalacturonano-I (RG-I) y ramnogalacturonano-II (RG-II). HG es un polímero de ácido α-1,4-linked-D-galacturónico, y residuos HG puede ser metil-esterificados en el carboxilo C-6 o acetilado en el O-2 o O-3, dependiendo de la fuente de pectina. La columna vertebral de HG es reticulado covalentemente a RG-I y RG-II. RG-I es un polímero ramificado con una cadena principal de disacárido (α-1,4-D-Gala- α-1,2-LRha) se repite en la que los residuos de Rha pueden estar sustituidos con β-1,4-galactano, ramificado arabinano y /o secundarios arabinogalactano cadenas. La estructura de RG-II es muy complejo: las cadenas laterales se unen a una columna vertebral de HG, y estas cadenas laterales complejos se componen de 12 tipos de residuos de glicosilo unidos entre sí por al menos 22 diferentes enlaces glicosídicos [2,3]
varios estudios in vitro han demostrado que las diversas formas de pectina modificada tienen propiedades antitumorales (para una revisión, ver [4]). La región RG-I de la pectina okra reduce la proliferación e induce la apoptosis en células de melanoma [5], y los oligosacáridos de pectina también inducen apoptosis en células de mieloma [6]. Jackson
et al demostraron que
diferentes protocolos de fragmentación de la pectina pueden dar lugar a diferencias en la actividad inductora de la apoptosis pectina, y que la pectina fragmentada tiene un efecto citotóxico en células de cáncer de próstata andrógeno-dependientes e independientes del. Además, estos autores mostraron que la pectina cítrica de pH modificado tenía poca o ninguna actividad apoptótica [7].
In vivo
, se ha demostrado que angelan, un polisacárido derivado de pectina, podría prevenir el crecimiento de células de melanoma y metástasis, y angelan También se informó a ser un inmunomodulador que mejora la función inmune de las células B, macrófagos y células asesinas naturales [8]. La ingesta oral de fragmentos de pectina soluble inhibe el crecimiento y la metástasis de tumores trasplantados en ratones [9,10], y se ha demostrado que la pectina cítrica modificada inhibe el crecimiento de cáncer de colon y metástasis hepática [11]. Sin embargo, los mecanismos por los que la pectina modificada ejerce no se conocen estos efectos
El objetivo de este estudio es caracterizar los efectos citotóxicos de la pectina cítrica fragmentado por el calor (HFCP) en líneas celulares tumorales: dos. Células HepG2 de hepatocarcinoma y A549 células humanas de carcinoma de pulmón humano. Nos informan de que la pectina cítrica fragmentado por el calor induce una muerte celular apoptótica similar al que se debe en parte independiente de caspasas y activa la autofagia en estas dos líneas celulares.
Materiales y Métodos
El fraccionamiento de la pectina cítrica de se obtuvo tratamiento térmico
Heat-fragmentado pectina cítrica (HFCP) de acuerdo con el método descrito por Jackson
et al
[7]. Una solución de 0,1% de pectina cítrica (Sigma P9135, que se compone principalmente de ácido homopolygalacturonic) en agua doblemente destilada se calentó durante 60 min a 123 ° C y bajo una presión de 17,2 a 21,7 psi. Después, la solución se congeló a -80 ° C y se liofiliza. El material seco se almacenó a 4 ° C. soluciones frescas en medio de cultivo se prepararon justo antes de ser añadido a las células durante las incubaciones.
Cultivo de células y pectina incubación
HepG2, A549, se obtuvieron células MCF-7 y MCF10A de la American las células tipo Culture Collection HepG2 y células MCF-7 se cultivaron en medio DMEM (Gibco 31825-023) y células A549 en medio MEM (Gibco 41090-028). Para el cultivo de rutina, los medios se complementaron con 10% de suero fetal bovino (Gibco 10270), y las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO
2. las células MCF10A se cultivaron en medio DMEM /F12 (Gibco 11320-074) que contiene 5% de suero de caballo (Gibco 16050-122), 20 mg /ml de EGF, 0,5 mg /ml de hidrocortisona, 10 mg /ml de insulina y 100 cólera ng /ml toxina. Para el tratamiento, se dejó que las células se adhirieran durante 24 h después de la siembra. El medio se retiró y las células se lavaron dos veces con PBS (Lonza BE17-516F) y se coloca en un medio sin suero que contiene lo siguiente: 3 mg /ml de HFCP esterilizada por filtración, 3 mg /ml de pectina cítrica esterilizada por filtración 3 mg /ml o 50 mM etopósido, utilizado como control positivo. Los controles negativos fueron células incubadas en medio solo. En algunos experimentos, cuando se indica, se añadió la estaurosporina (Sigma S4400), pan-caspasa inhibidor Z-VAD-fmk (BD Pharmingen 550377), 3-metiladenina (Sigma M9281) o bafilomicina (Sigma B1793) al mismo tiempo como etopósido, HFCP o pectina.
viabilidad de las células de ensayo
células HepG2 fueron sembradas a 50 000 células /pocillo y las células A549 a 30 000 células /pocillo en placas de 24 pocillos antes de los tratamientos de 6, 24 o 48 h. MTT (3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5- difeniltetrazolio bromuro, Sigma M2128) solución se preparó a una concentración de 2,5 mg /ml en solución salina tamponada con fosfato, y 500 l por pocillo . Después de 2 h a 37 ° C y 5% de CO
2 atmósfera, el medio y la solución de MTT se eliminaron antes de la adición de tampón de lisis. La densidad óptica se midió 1 h más tarde a 570 nm usando un espectrofotómetro de microplacas (Bio-Rad x Marcos microplaca espectrofotómetro) y
Gestor de microplacas 6
software.
ensayo de citotoxicidad celular
células HepG2 se sembraron a 50 000 células /pocillo y las células A549 a 30 000 células /pocillo en placas de 24 pocillos antes de la incubación durante 24 o 48 h. Para cada pocillo, se midió la actividad lactato deshidrogenasa en el sobrenadante, en células separadas y en las células adherentes después de la lisis en PBS que contenía 10% de Triton X-100 (Merck 9036-19-5). La actividad de lactato deshidrogenasa se detectó mediante un ensayo colorimétrico usando un kit de citotoxicidad (Roche 11644 793 001) y un espectrofotómetro de microplacas. porcentajes de citotoxicidad se calculó por la relación de la cantidad de LDH presente en el sobrenadante y en las células independientes de la cantidad total de LDH, como en la siguiente fórmula: 100 * (a + b) /(a + b + c), donde a = sobrenadante LDH; b = LDH células desprendidas; c = células adherentes LDH.
se sembraron
ensayo de fragmentación del ADN
p>
caspasa-3 actividad
p>
et al
[12].
análisis de transferencia de Western
Los lisados celulares se prepararon en tampón de lisis (Tris 40 mM ; pH 7,5, KCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de Triton X-100) que contiene un cóctel inhibidor de la proteasa (Complete de Roche Molecular Biochemicals; 1 tableta en 2 ml de H
2O, añadido a una dilución 1: 25 ) y tampón inhibidor de la fosfatasa (mM Navo 25
3, PNPP 250 mM, 250 mM de α-glicerofosfato y NaF 125 mM, en una dilución 1: 25) de acuerdo con Cosse
et al
[12]. El medio se centrifugó, y se añadieron células sedimentadas a lisados celulares. Los lisados se centrifugaron a 12 000 x g durante 5 min, y se recogieron los sobrenadantes. Las proteínas (15 mg) se desnaturalizaron con la adición de tampón de muestra LDS (Invitrogen NP0007) y se calentó a 70 ° C durante 10 min. Las proteínas se resolvieron en un gel NuPAGE al 4-12% (Invitrogen) y se transfirieron a una membrana de baja fluorescencia (Millipore IPFL00010). Las membranas se mantuvieron durante 1 h en solución de bloqueo LiCor y se sondaron durante la noche con un anticuerpo de conejo anti-caspasa-3 (Cell Signaling#9662S) que reconoce el de longitud completa y formas escindidos de caspasa-3 en una dilución de 1/500 , un anticuerpo de ratón anti-PARP (BD Biosciences#551024) a una dilución de 1/1000, un anti-caspasa-8 anticuerpo de ratón (Cell Signaling#97465) a una dilución de 1/1000, un anticuerpo anti-ubiquitina ratón ( LifeSensor VU101) a una dilución de 1/1000, un anticuerpo de ratón anti-LC3 (Nanotools 0260-100 /LC3-2G6) a una dilución de 1/600 o un anticuerpo de ratón anti-p62 (AB Nova#H00008878-M03) a una dilución de 1/500. Un anticuerpo de ratón anti-ß-actina (Sigma T5168) se utilizó a una dilución de 1/30 000 para la inmunodetección ß-actina como control de carga. Todos los anticuerpos se diluyeron en solución LiCor que contiene 0,1% de Tween 20 (Sigma P1379). Las membranas se enjuagaron con PBS + 0,1% Tween 20 y se incubaron con anticuerpos anti-ratón o anti-conejo conjugados con fluorocromo (BD Bioscience#926-32221) a una dilución de 1/10 000 de 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente . Para el etiquetado anti-ubiquitina, las membranas se lavaron en PBS después de la transferencia, se fijaron en PBS que contenía 0,5% de glutaraldehído (pH 7) y se enjuagaron tres veces en PBS antes de bloquear. Las membranas se lavaron una vez más con PBS + 0,1% Tween 20 y se secan antes de ser escaneado y se analizaron usando software Odyssey.
etiquetado inmunofluorescencia
células HepG2 se sembraron a 50 000 células /pocillo y A549 células a 30 000 células /pocillo en placas de 24 pocillos 24 h antes de la incubación con HFCP, pectina o etopósido para 24 h. Después de la incubación, las células se fijaron y se permeabilizaron por 10 min con una solución fría de 80% de metanol y 20% de acetona, se enjuagaron tres veces con PBS-BSA al 2% y se incubaron durante 2 h con anticuerpos primarios. El anticuerpo primario para la tinción LC3 era de conejo anti-LC3 (L7543 Sigma) (1/250 dilución), y el anticuerpo primario para la tinción LAMP1 era de ratón anti-LAMP1 (H4A3 recibió de agosto & amp; Hildreth, Baltimore [13]). Las células se lavaron tres veces con PBS-BSA al 2% y después se incubaron durante 1 h con los anticuerpos secundarios. Alexa Fluor 488-conjugado anticuerpo anti-IgG de conejo y Alexa anticuerpo IgG anti-ratón Fluor-568-conjugado (Molecular Probes) se utilizaron a una dilución 1/1000. Después de 1 h de incubación, las células se enjuagaron tres veces con PBS. Para el marcaje nuclear, se incubaron las células durante 30 min con TOPRO-3 (Molecular Probes,. Dil 1/80) en presencia de 2 mg /ml de RNAsa y luego se enjuagaron tres veces con PBS. Por último, los cubreobjetos se montaron utilizando Mowiol (Sigma, St Louis, EE.UU.), y se observaron las células con un microscopio confocal de fluorescencia (Leica SP5).
Resultados
Heat-fragmentado induce pectina cítrica HepG2 y células A549 muerte
para estudiar los efectos de células que inducen la muerte de HFCP, dos líneas celulares de cáncer, HepG2 y células A549, se expusieron durante diferentes períodos de tiempo a HFCP. La concentración de 3 mg /ml fue elegido después de probar varias concentraciones de HFCP en ambos tipos de células durante 24 h (S1 Fig.). El etopósido a una concentración de 50 mM se utilizó como control positivo. La morfología celular se analizaron mediante microscopía de contraste de fases mostró que el etopósido induce una ligera mortalidad en las células A549, mientras que las células HepG2 parecieron ser más sensibles a este fármaco. Además, la muerte celular aumentó con el tiempo de incubación. HFCP a una concentración de 3 mg /ml también indujo la muerte celular en ambos tipos de células, pero en un grado mucho más alto que el etopósido en una concentración de 50 mM; su efecto también era dependiente del tiempo. Por el contrario, la pectina no modificada a una concentración de 3 mg /ml no afectó la morfología celular (S2 Fig.).
ensayos de MTT se realizaron después de 24 y 48 h (Fig. 1A y 1B). Los resultados mostraron que HFCP disminuyó la viabilidad de HepG2 y células A549 en ambos tiempos de incubación, mientras que la pectina cítrica modificada no lo hizo. toxicidad HFCP aumentó con el tiempo de incubación y fue más severa que la inducida por etopósido, especialmente para las células HepG2. Para confirmar estos datos, la liberación de LDH se ensayó después de 24 y 48 h (Fig. 1C y 1D), y los resultados confirmaron el efecto citotóxico de HFCP en células HepG2 y A549, con un efecto más fuerte en la primera.
células HepG2 y células A549 se incubaron con medio solo (CtL-), 50 M etopósido (Etop), 3 mg /pectina cítrica fragmentado-calor ml (HFCP) o 3 mg /ml pectina cítrica (pectina). (A) y la viabilidad celular (B) se ensayó con el ensayo de MTT en células HepG2 (A) y células A549 (B) después de 24 y 48 h. (C) y (D) La citotoxicidad se ensayó en células HepG2 (C) y células A549 (D) utilizando un kit de detección de citotoxicidad LDH después de 24 y 48 h de incubación. Los datos son las medias de al menos 3 repeticiones de experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado +/- SD (n = 3-8). Los análisis estadísticos se realizaron fueron la prueba y la prueba de Hartley ANOVAII. Los valores de p en comparación con el control correspondiente son *: P ≤ 0,05; **: P ≤ 0,01; ***: P ≤ 0,001
Para investigar si el suero podría tener un efecto protector contra esta citotoxicidad inducida por HFCP, como se observa para algunos otros inductores de apoptosis tales como etopósido, las células HepG2 fueron incubadas 24 h en el. presencia de HFCP en un medio suplementado con 10% de suero de ternera fetal la estaurosporina se utilizó como el control positivo ya que su efecto apoptótico no se inhibe por el suero. Sin embargo, el efecto citotóxico de HFCP no se inhibió en absoluto por el suero en estas condiciones (S3 Fig.). Los experimentos también se han realizado con concentraciones más bajas para un tiempo de incubación más largo (72 h) usando células HepG2. Esto se realizó con y sin suero. En comparación con 24 h de incubación, 1 mg /ml HFCP indujo una disminución más importante en el número de células viables después de 72 h de incubación. Suero parecía ser ligeramente protectora después de 72 h de incubación, lo cual no era el caso después de 24 h de incubación (Figura S4.).
El efecto de HFCP también ha sido probado en las células normales. Esto se realizó con altas concentraciones de un corto tiempo de incubación (24 h), así como con bajas concentraciones de un largo tiempo de incubación (72 h), con y sin suero. células MCF-10A se han utilizado para estos experimentos. MCF10A células son una línea inmortalizada, no transformado células epiteliales derivadas de tejido mamario humano fibroquística. A menudo se consideran como un control normal de las células cancerosas. Los resultados mostraron que HFCP también indujo un efecto citotóxico fuerte en estas células. Estos resultados indican que HFCP probablemente no es específica para las células cancerosas (S5 Fig.). Se ha de señalar que el etopósido y estaurosporina también eran tan tóxicos para las células MCF10A como para las células HepG2, mientras que el etopósido se utiliza actualmente en las clínicas para tratar varios tipos de cáncer.
induce fragmentación de la pectina cítrica apoptosis no canónica en HepG2 y A549
Para investigar si los fragmentos de pectina inducen la apoptosis, se analizó la activación de la caspasa-3 mediante un análisis de transferencia Western. La activación de la caspasa-3 se produjo a través de la escisión, dando como resultado fragmentos de 14 kDa y 17 kDa, como se observa cuando las células se incubaron con etopósido durante 24 o 48 h (Fig. 2A). células HepG2 se incubaron durante 24 o 48 h con HFCP muestran diferentes formas de la caspasa-3 de las células incubadas con etopósido escindido. A las 24 h, bandas adicionales de pesos moleculares aparentes mayor, aproximadamente 20 y 60 kDa, aparecieron; a las 48 h, los fragmentos escindidos de caspasa-3 eran menos abundantes en las células incubadas con HFCP, pero la forma 60 kDa de la caspasa-3 todavía estaba presente (Fig. 2A). Después de 48 h de incubación, un fragmento de 20 kDa apareció en las células expuestas a medio solo, etopósido y pectina no fragmentada, muy probablemente debido a que estas células se incubaron sin suero. Independientemente, la banda 60 kDa era específico para las células HFCP-incubadas.
células HepG2 y A549 se incubaron con medio solo (CtL-), 50 M etopósido (Etop), 3 mg /ml de calor fragmentada pectina cítrica (HFCP) o 3 mg de pectina /ml cítricos (pectina) para 24 y 48 h. (A) y (B) Detección de la caspasa-3 activada y PARP escindida en HepG2 (A) y células A549 (B) por análisis de transferencia Western. La inmunodetección de α-tubulina se utilizó como control de carga. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. (C) y la actividad (D) de la caspasa-3 fue ensayada usando un sustrato fluorogénico específico después de 6, 24 y 48 h de incubación en células HepG2 (C) y células A549 (D). (E) y (F) la fragmentación del ADN se ensayó usando un kit de detección de ELISA después de 6, 24 y 48 h de incubación en células HepG2 (E) y en células A549 (F). Los datos son las medias de triplicados +/- SD (n = 3). Los datos son las medias de triplicados +/- SD (n = 3). Los análisis estadísticos se realizaron fueron la prueba y la prueba de Hartley ANOVAII. Los valores de p en comparación con el control correspondiente son *: P ≤ 0,05; **: P ≤ 0,01; ***:. P ≤ 0,001
caspasa división y bandas adicionales también fueron notables en las células A549 después de 24 o 48 h de tratamiento HFCP (Figura 2B.). Además, el patrón de escisión de caspasa-3 en células A549 incubadas con HFCP muestra un frotis intrigante 30-60 kDa (Fig. 2B). Un análisis de transferencia Western para la proteína PARP (Fig. 2A y 2B), un sustrato de la caspasa-3, mostró la escisión de esta proteína en ambos tipos de células incubadas con HFCP o etopósido para los dos períodos de tiempo. la escisión de PARP también se detectó en las células HepG2 se incubaron durante 48 h con medio solo o pectina no modificada, aunque PARP escindido fue menos abundante en estas células que en las células HFCP-incubadas. las células A549 incubadas durante 24 o 48 h con la pectina no modificada mostraron una cantidad apenas detectable de PARP escindida, lo más probable porque la incubación fue en medio libre de suero.
Para determinar si la escisión no convencional de la caspasa-3 dirigido a la enzima de activación, la actividad de caspasa-3 fue ensayada en HepG2 y células A549 incubadas con 50 mM etopósido, 3 mg /ml HFCP o 3 mg /ml de pectina de 8, 24 y 48 h (Fig. 2C y 2D). Los resultados mostraron que, después de 24 h de incubación, etopósido aumentó fuertemente la actividad de la caspasa-3 en células HepG2 en comparación con las células control. Las células HepG2 tratadas con HFCP también mostraron una mayor actividad de la caspasa-3 que aumentó con el tiempo de incubación. Las células A549 tratadas con etopósido mostraron un pequeño aumento en la actividad de caspasa-3 en comparación con las células de control, aunque este aumento de la actividad de la caspasa-3 fue menos importante que la observada en las células HepG2, pero era, sin embargo, estadísticamente significativa. Las células A549 HFCP expuestas también muestran activación de la caspasa-3, que aumentó con el tiempo.
Para confirmar que HFCP induce la apoptosis, la fragmentación del ADN, una característica de la apoptosis tardía, se evaluó. Un kit ELISA nucleosoma libre se utilizó para medir la liberación de nucleosomas libres de DNA (Fig. 2E y F), y los resultados revelaron que las células HepG2 y A549 tratadas con etopósido mostraron fragmentación del ADN que conduce a la liberación nucleosoma. En el contraste con lo observado para el etopósido, la fragmentación del ADN no se observó en las células incubadas con HFCP, lo que indica que las células HepG2 y A549 tratados con pectina fragmentado no muestran características apoptóticas clásicos. Esto es consistente con la morfología nuclear observada después de la tinción DAPI, lo que no se vea características fragmentados típico de apoptosis pero parecía estar encogido.
A ensayo de viabilidad también se realizó en las células MCF7 de caspasa-3-deficiente (S6 Fig. ). Los resultados mostraron una disminución de la viabilidad de estas células cuando se incuban en presencia de HFCP durante 24 o 48 h, lo que sugiere que no es necesario que la activación de la caspasa-3 para la inducción de la muerte celular en respuesta a la exposición HFCP.
Papel de caspasas en HFCP muerte celular inducida por
Para investigar si las caspasas juegan un papel importante en la muerte celular inducida por HFCP, las células fueron incubadas con HFCP en presencia de un inhibidor de pan-caspasa (Z-VAD-fMK) , y la viabilidad de y la citotoxicidad de las células HepG2 y A549 se analizaron después de 24 h. El inhibidor de la caspasa condujo a un pequeño aumento en la viabilidad en ambos tipos de células incubadas con etopósido (Fig. 3A y 3B), una pequeña disminución de la citotoxicidad en células HepG2 incubadas con etopósido y una marcada disminución en la citotoxicidad en las células A549 incubadas con etopósido (Fig . 3C y 3D). Este conjunto de datos sugiere que la Z-VAD-fmk fue capaz de prevenir, al menos en parte, la muerte celular asociada con la actividad de caspasa. Sin embargo, las células HepG2 se incubaron con HFCP en presencia de Z-VAD-fmk no mostraron ningún aumento en la viabilidad en comparación con las células incubadas con HFCP solo. Un ensayo de citotoxicidad confirmó estas observaciones (Fig. 3A y 3C), lo que indica que las caspasas no contribuyen a la muerte de las células HepG2 inducida por HFCP. Sin embargo, las células A549 incubadas con HFCP y caspasa inhibidor mostraron una viabilidad superior y mucho menos la citotoxicidad de las células A459 incubadas con HFCP solo, lo que sugiere que las caspasas podrían estar implicados en la muerte inducida por HFCP en células A549 (Fig. 3B y 3D). células
HepG2 y A549 se incubaron con medio solo (CTL), 50 M etopósido (Etop), 3 mg /pectina cítrica fragmentado por el calor ml (HFCP) o 3 mg /ml de pectina cítrica (pectina) en la presencia o ausencia de Z-VAD-FMK, un inhibidor de la caspasa, a 20 mM. (A) y (B) La viabilidad celular de las células HepG2 (A) y células A549 (B) se midió con el ensayo MTT después de 24 h de incubación. (C) y (D) La citotoxicidad se ensayó en HepG2 (C) y en A549 (D) después de 24 h de incubación utilizando un kit de detección de citotoxicidad LDH. Los datos son las medias de triplicados +/- SD (n = 3). Los análisis estadísticos se realizaron fueron la prueba y la prueba de Hartley ANOVAII. Los valores de p en comparación con el control correspondiente son *: P ≤ 0,05; **: P ≤ 0,01; ***: P ≤ 0,001. (E) y (F) Un análisis de transferencia Western de la caspasa-3 activada y PARP escindida se realizó en 15 g de proteína a partir de células HepG2 (E) y células A549 (F) después de 24 h de incubación. La inmunodetección de ß-actina se utilizó como control de carga. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.
En un intento de comprender el efecto diferencial del inhibidor de caspasas en estos dos tipos de células, se verificó que la Z-VAD-FMK inhibió la actividad de la caspasa en el concentración utilizado en este trabajo (S1 Tabla). De hecho, los resultados mostraron que Z-VAD-fmk inhibió completamente la activación de caspasa etoposide- y HFCP inducida. A continuación analizaron la caspasa-3 de escisión y la escisión de PARP en ausencia o en presencia de Z-VAD-fmk por transferencia de western (Fig. 3E y 3F). La fragmentación de la caspasa-3 que se observó cuando las células fueron expuestas a etopósido ya no se observó cuando se añadió Z-VAD-fmk, un resultado que está en concordancia con la literatura [14]. La fragmentación no canónica de la caspasa-3 que se observó cuando las células HepG2 y A549 se trataron con HFCP también fue inhibido, y el patrón de la caspasa-3 escisión se convirtieron comparable a la observada para las células expuestas a etopósido en presencia de Z-VAD -fmk, a excepción de la banda de 60 kDa que aún se detectó en ambos tipos de células incubadas con HFCP y Z-VAD-fmk.
Estos datos plantean la posibilidad de que la caspasa-3 escisión "no convencional" observamos podría ser debido a otras caspasas o proteasas y por lo tanto puede ser que no sea imputable a la apoptosis clásica. En efecto, corte de la proteína PARP HFCP inducida se inhibió sólo parcialmente por Z-VAD-fmk, lo que indica que podría haber otro mecanismo de activación de la caspasa que podrían estar involucrados. Además, el corte de la proteína PARP inducida por etopósido no fue inhibida por Z-VAD-fmk en las células A549, mientras que el corte de la proteína PARP inducida por el tratamiento HFCP se inhibió completamente.
Debido caspasas efectoras se activan por caspasas iniciadoras , caspasa-8 de escisión se analizó en las células HepG2 por un análisis de transferencia Western (Fig. 4A). El resultado mostró que la incubación de células HepG2 en presencia de etopósido o HFCP hizo generar fragmentos escindidos de caspasa-8 con un peso molecular de 43 y 41 kDa (Fig. 4A). La escisión de la caspasa-8 en las células expuestas al etopósido es coherente con la literatura [15], y esta escisión fue impedido por la presencia de Z-VAD-fmk tanto en las células etoposide- y expuestos al HFCP (Fig. 4A). Además, la abundancia de la procaspasa de longitud completa se redujo en las células HepG2 incubadas con HFCP y no fue impedida por la adición de Z-VAD-fmk. Por lo tanto, la disminución de la abundancia de procaspasa-8 no era debido a la escisión causada por otras caspasas porque Z-VAD-fmk no prevenirla.
células HepG2 se incubaron con medio solo (CtL-), 50 M se añadió etopósido (Etop), 3 mg /pectina cítrica fragmentado-calor ml (HFCP) o 3 mg /ml pectina cítrica (pectina) (a) Z-VAD-fmk a 20 M o no a las células durante la incubación. La detección de la caspasa-8 activada en las células HepG2 por análisis de transferencia Western se realizó sobre 15 g de proteína después de 24 h de incubación. La inmunodetección de ß-actina se utilizó como control de carga. (B) la ilustración teórica de escisión α-fodrin resultante de la activación de la caspasa (casp), calpaína (calp) o la combinación de la caspasa y la calpaína (casp + calp). (C) y las células HepG2 y A549 (D) se incubaron con medio solo (CtL-), 50 M etopósido (Etop), 3 mg /pectina cítrica fragmentado-calor ml (HFCP) o 3 mg /ml pectina cítrica (pectina) , se añadió y 20 mM Z-VAD-fmk o no a las células durante 6 ó 24 h de incubación. La detección de α-fodrin en las células por análisis de transferencia Western HepG2 (C) y A549 (D) se realizó en 15 g de proteína.
Las calpaínas son proteasas que también se activan en respuesta al estrés y pueden participar en la muerte celular. Como el estudio del patrón de escisión α-fodrin podría informar sobre la caspasa o la activación de la calpaína [16,17], la fragmentación de α-fodrin se evaluó mediante un análisis de transferencia Western en las células HepG2 y A549 después de 6 y 24 h de incubación con o con la adición Z-VAD-fmk para determinar si las calpaínas se activaron durante la muerte celular inducida por HFCP (Fig. 4 C, D). El patrón de escisión teórica de α-fodrin se muestra en la Fig. 4B. De longitud completa α-fodrin tiene un peso molecular de 280 kDa; a-fodrin escindido por la caspasa muestra bandas de 150 y 120 kDa, y α-fodrin escindido por la calpaína muestra bandas de 150 y 145 kDa. En ambos tipos de células expuestas a etopósido o HFCP (Fig. 4C y D), la forma de longitud completa de la proteína se detectó, como era un fragmento de 150 kDa. Este fragmento puede representar a la escisión de α-fodrin en un sitio hipersensible por bajos niveles de proteasas endógenamente activas [18]. Después de 24 h de incubación, el patrón de escisión α-fodrin en células HFCP-incubadas era similar al patrón de escisión en las células de etopósido-incubadas, y ambos presentan un fragmento de 120 kDa. Como el producto α-fodrin 120-kDa se asocia con la caspasa-3 de activación [19] y la formación de este fragmento fue inhibida cuando se añadió Z-VAD-fmk, en ambos casos, los resultados indican que HFCP indujo la activación de algunas caspasas en ambos tipos de células.
caspasa 8 de activación se ha demostrado ser inducida de una manera independiente del receptor debido a la inhibición del proteasoma [20]. Debido a que ningún receptor de momento no se ha reportado para HFCP e investigar si HFCP podría activar una vía de ejemplo, ubiquitinación de proteínas se evaluó mediante un análisis de transferencia Western en HepG2 y en células A549. Se observó un aumento temprano en la ubiquitinación cuando las células se incubaron en presencia de HFCP de 6 h, pero no en presencia de medio solo, etopósido o pectina no modificada que todavía era detectable después de 24 h de incubación (Fig. 5A y B).