Extracto
sagopilona, una epotilona totalmente sintético optimizado , es un compuesto estabilizadores de microtúbulos que ha demostrado una alta
in vitro
y
in vivo
actividad frente a una amplia gama de modelos de tumores humanos. Se analizó el mecanismo diferencial de acción de sagopilona en líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas
in vitro
. Sagopilona inhibió la proliferación de líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas en menor concentración nanomolar. El tratamiento con sagopilona causó fuertes perturbaciones de la organización del citoesqueleto celular. Se observaron dos fenotipos dependientes de la concentración. A 2,5 sagopilona nM o 4 nM de paclitaxel un fenotipo aneuploides se produce mientras que un fenotipo arresto mitótico fue inducida por 40 sagopilona nM o paclitaxel. Curiosamente, el tratamiento con 2,5 nM de sagopilona proliferación celular inhibe eficazmente, pero - en comparación con altas concentraciones (40 nM) - Sólo la apoptosis inducida marginalmente. El tratamiento con una alta frente a una baja concentración de sagopilona o paclitaxel regula un conjunto no solapamiento de genes, lo que indica que ambos fenotipos difieren sustancialmente entre sí. Los genes implicados en la transición de la fase G2 /M y la asamblea de control de huso, como la ciclina B1 y BubR1 se upregulated por el tratamiento con 40 nM sagopilona. Inesperadamente, también genes implicados en la respuesta al daño del ADN se upregulated en dicho tratamiento. En contraste, el tratamiento de las células A549 con una baja concentración de sagopilona reveló una regulación por incremento de los genes diana transcripcional directa de TP53, como CDKN1A, MDM2, GADD45A, FAS. Desmontables de TP53, que inhibe la inducción transcripcional de genes diana TP53, condujo a un aumento significativo en la inducción de apoptosis en las células A549 cuando se trata con una baja concentración de sagopilona. Los resultados indican que la activación de TP53 y sus efectores aguas abajo como CDKN1A por bajas concentraciones de sagopilona es responsable de la resistencia a la apoptosis relativa de las células A549 y podría representar un mecanismo de resistencia a sagopilona
Visto:. Winsel S, Sommer A, Eschenbrenner J, K Mittelstaedt, Klar U, Hammer S, et al. (2011) Modo de acción molecular y función de TP53 en la sensibilidad a la novela epotilona sagopilona (ZK-EPO) en el A549 de células no pequeñas células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 6 (4): e19273. doi: 10.1371 /journal.pone.0019273
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Agosto, 2010; Aceptado: March 31, 2011; Publicado: 29 Abril 2011
Derechos de Autor © 2011 Winsel et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue financiado por el Bayer Healthcare (www.bayerhealthcare.com). Los donantes tenían un papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, y la preparación del manuscrito. Todos los autores son empleados o ex empleados de la Bayer Healthcare. Conceder una ayuda en detalle: S. Winsel, J. Eschenbrenner, K. Mittelstaedt recibió becas de investigación comerciales de Bayer Healthcare; A. Sommer, U. Klar, S. Hammer, J. Hoffmann son empleados actuales o anteriores de Bayer Healthcare y mantener las patentes de Bayer Healthcare, así como acciones de Bayer
Conflicto de intereses:. Los autores han leído el la política y de la revista tienen los siguientes conflictos: la empresa tuvo un papel en este estudio en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar y la preparación del manuscrito. Todos los autores son empleados o ex empleados de la Bayer Healthcare. Conceder una ayuda en detalle: S. Winsel, J. Eschenbrenner, K. Mittelstaedt recibió becas de investigación comerciales de Bayer Healthcare; A. Sommer, U. Klar, S. Hammer, J. Hoffmann son empleados actuales o anteriores de Bayer Healthcare y mantener las patentes de Bayer Healthcare, así como acciones de Bayer. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El cáncer de pulmón es una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo, ya que es a menudo sólo se diagnostica en etapas avanzadas y muestra un alto grado de resistencia a los regímenes quimioterapéuticos utilizados. [1] - [5]. Sagopilona (SAG) es una epotilona completamente sintético, actualmente en desarrollo clínico que fue optimizada para superar las limitaciones asociadas con frecuencia con taxanos, agentes de unión a tubulina convencionales (PT) como por mecanismos resistentes mediadas ejemplo MDR [6]. SAG ha demostrado una alta
in vitro en
y
in vivo
actividad en una gama de modelos de tumores en comparación con paclitaxel (PAC) y otros agentes quimioterapéuticos utilizados frecuentemente [6]. Con ha observado una fuerte actividad antitumoral en el CPNM líneas celulares (de células de cáncer de pulmón no microcítico)
in vitro y modelos de xenoinjertos de NSCLC humanos primarios de ratón, SAG puede proporcionar una potencial nueva oportunidad para el tratamiento de NSCLC [7].
Varios estudios describen marcadores predictivos de respuesta para las líneas celulares de NSCLC, como la expresión del grupo de reparación por escisión de cross-complementación 1 (ERCC1) gen de compuestos de platino [8] o el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) estado mutacional para los inhibidores de la tirosina-quinasa de EGFR (gefitinib y erlotinib) [9]; [10]. Con respecto a la resistencia a las PT, los informes sobre las líneas de células seleccionadas para la resistencia PAC a través de cultivo a largo plazo en presencia del fármaco mostraron niveles de TUBB3 (beta III tubulina) expresión de la proteína [11] incrementaron. Por el contrario, su homólogo resistente patupilone (epotilona B), se incubaron de la misma manera, mostró expresión de la proteína TUBB3 baja [11]. Estos datos sugieren que TUBB3 contribuye a la resistencia celular hacia PAC, pero no a la epotilona. Como consecuencia hay una necesidad de otros marcadores que pueden predecir la respuesta SAG.
Las mutaciones en genes supresores de tumores, que desempeña un papel central en la respuesta celular al daño del ADN, regulación del ciclo celular y la apoptosis [12] , se encuentra en alrededor del 50% de todos los casos de NSCLC [13]. Sin embargo, el papel de TP53 en respuesta a las PT como PAC ha sido controvertida: Algunos grupos informaron de ninguna correlación entre TP53 estado mutacional y la sensibilidad al PAC [14]; [15], mientras que otros observaron que la falta de actividad TP53 produjo un aumento de la quimiosensibilidad al PAC [16]; [17]. Estos hallazgos sugieren que el estado mutacional TP53 y TP53 actividad alterada podrían influir en la sensibilidad de las células a la SAG. Para abordar esta cuestión, se ha analizado la influencia de TP53 en la capacidad de SAG para inducir la apoptosis en un modelo NSCLC
in vitro
.
La identificación de biomarcadores de estratificación o de destino de drogas o de medicamentos marcadores de respuesta relacionados con la PI podrían mejorar considerablemente los resultados de la terapia y conducirían a un cambio hacia terapias más personalizadas contra tipos específicos de la enfermedad [18]. El tratamiento óptimo para los pacientes que sufren de NSCLC dependerá cada vez más en el análisis de biomarcadores para identificar la población de pacientes que más se beneficiarán de un cierto monoterapia o combinación. Sin embargo, la identificación y validación de biomarcadores sigue siendo un reto importante [19] por lo que es importante acompañar el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para pacientes con CPNM con la investigación de la estratificación del paciente y la identificación y validación de biomarcadores clínicos que predicen la respuesta. Como parte de este proceso, es vital entender cómo la actividad de nuevos agentes prometedores está influenciada por las alteraciones en las vías celulares claves, y viceversa.
El objetivo de nuestro programa de traslación fue examinar la actividad del SAG
in vitro
en un panel de líneas celulares de cáncer, para analizar más a su mecanismo de acción y para compararlo con los efectos de la PAC y para investigar los posibles mecanismos de resistencia, así como factores predictivos de respuesta sobre la base de perfiles de expresión génica.
Materiales y Métodos
Las células y los compuestos
líneas celulares de carcinoma de pulmón humano (A549, NCI-H1437, NCI-H23, NCI-H522, NCI-H226, NCI H460) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron de acuerdo con los protocolos recomendados. SAG fue sintetizado en laboratorios Bayer Healthcare través de síntesis totales. PAC se adquirió de Sigma-Aldrich (Munich, Alemania). El ZVAD.fmk inhibidor pan-caspasa se adquirió de Bachem, (Heidelberg, Alemania). Todos los medios y suplementos para el cultivo celular se adquirieron de Biochrom AG (Berlin, Alemania). Las soluciones madre se prepararon como se describe anteriormente [20]. Para la selección de líneas celulares establemente transducidas higromicina se adquirió de Roche (Mannheim, Alemania).
proliferación de células tumorales ensayo
El efecto de SAG o PAC sobre la proliferación de cáncer de pulmón se evaluó mediante una ensayo de proliferación celular basado en la tinción de células con cristal violeta como se ha descrito antes [20]. Los valores de IC50 se calcularon a partir de tres experimentos independientes utilizando el software Sigmaplot (SPSS, Friedrichsdorf, Alemania).
in vitro
análisis de los efectos sobre el citoesqueleto, el ciclo celular y la apoptosis
A549 células fueron incubadas con vehículo (etanol 0,1%), 2,5 nM o 40 nM SAG durante 20 h, fijadas con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con un anticuerpo de ratón monoclonal anti-α-tubulina (1:1000) (Sigma-Aldrich ), cabra Alexa Fluor® 488 vinculado-anti-IgG de ratón anticuerpo secundario (1:250) (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, EE.UU.) y DRAQ5 (Biostatus, Leicestershire, Reino unido), de acuerdo con protocolos estándar. Fijos y se analizaron las células teñidas utilizando un microscopio Zeiss LSM 510 META (Carl Zeiss AG, Jena, Alemania) equipado con un 63x /1.4 (DIC aceite) objetivo Plan-Apochromat®. Se empleó el software Zeiss LSM (versión 3.0 SP3) para la imagen confocal.
clasificador de células activadas por fluorescencia se realizó (FACS) para determinar la distribución del ciclo celular de las células tratadas o SAG-PAC. Las células se incubaron con SAG a las concentraciones indicadas o vehículo para 18 h, fijadas con 70% de etanol, y se tiñeron con 50 mg /ml de yoduro de propidio (PI) (Sigma-Aldrich). El contenido de ADN celular se determinó por citometría de flujo utilizando la BD FACSCalibur ™ (Becton, Dickinson and Company, San José, CA, EE.UU.) y los datos se analizaron con el software CellQuest ™ (Becton, Dickinson and Company). Para investigar la apoptosis por FACS, las células A549 se incubaron de forma continua durante 72 horas con las concentraciones indicadas de SAG o vehículo, tratadas con tripsina y se tiñeron con DIOC
6 (3) (yoduro de 3,3'-dihexyloxacarbocyanine) (Invitrogen Inc.) y PI como se describe antes [21].
cuantitativa en tiempo real PCR y Western Blot
ARN fue extraído por medio de RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania), se generó cDNA utilizando superíndices la primera cadena Sistema de síntesis (Invitrogen Inc.). PCR en tiempo real se realizó con ensayos de expresión de genes de Applied Biosystems: p21 (# Hs00355782_m1), TP53 (# Hs00153340_m1), ciclina B1 (# Hs00259126_m1), BubR1 (Hs00176169_m1), FAS (Hs00163653_m1), GADD45A (Hs00169255_m1), MDM2 ( Hs00242813_m1), y HPRT (# 4326321E) como control endógeno. Las reacciones se establecieron por triplicado utilizando la TaqMan PCR Universal Mastermix RÁPIDO y registrados en una PCR en tiempo-real-7500 Sistema Rápido (Applied Biosystems). La expresión relativa de cada gen se cuantificó según el método comparativa ciclo umbral (ΔΔ
Ct método) con eficiencias de amplificación iguales de la diana y el control endógeno.
Las proteínas se extrajeron mediante M-PER proteínas de mamíferos reactivo de extracción (Pierce, Ciencia Perbio, Bonn, Alemania). Las concentraciones de proteína de los lisados se determinó con el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce) según las instrucciones del fabricante. Igual cantidad de proteínas se separaron en un gel de Bis-Tris al 4-12% (Invitrogen) en una cámara de electroforesis XCell SureLock (Invitrogen) lleno de MOPS SDS funcionamiento de amortiguación y se transfirió a una membrana de PVDF (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Después del bloqueo de los sitios de unión no específica, la membrana se sondeó con anticuerpos específicos para CDKN1A (Abcam,#16767), TP53 (BD Pharmingen,#15801A), BUB1B (BD Transduction Laboratories,#612502), ciclina B1 (BD Pharmingen,#554176 ), γH2AX (upstate,#05-636), PARP (BD Pharmingen,#551024), fosfo-Ser /Thr-MPM-2 (upstate#05-368), y GAPDH (Avanzado inmunoquímica,#RGM2 /clon 6C5) como control de carga.
extracción de ARN para el análisis de la expresión génica
células A549 se sembraron en placas de cultivo celular de 10 cm y se dejaron unir durante la noche. Las células se trataron a continuación con medio que contenía 2,5 nM SAG, 40 nM SAG, 4 PAC nM o 40 nM PAC, respectivamente, del vehículo (etanol 0,1%), o se dejaron sin tratar durante 18 horas. El ARN total se extrajo usando el kit RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemania) que incluye una I (Qiagen) paso para eliminar el ADN genómico DNasa. El ARN total se comprueba la integridad usando los LabChips de ARN en el Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.) y se determinó la concentración en un NanoDrop (Peqlab, Erlangen, Alemania). Todas las muestras de ARN tenían números de alta integridad de ARN [22] mayor que 9,5.
análisis de Affymetrix GeneChip ®
El Uno-Ciclo eucariótica Target Labeling Kit (Affymetrix Inc, Santa Clara, CA, EE.UU. ) se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 2 g de ARN total de alta calidad fue transcrito de forma inversa usando un T7 etiquetados oligo-dT para la reacción de síntesis de ADNc de primera cadena. Después de la síntesis mediada por RNasa H de segunda hebra de ADNc, el ADNc de doble hebra fue purificado y sirve como molde para la
reacción subsiguiente in vitro
transcripción que genera ARN complementario marcado con biotina (cRNA). A continuación, la biotina cRNA fue limpiado, fragmentada y hibridizada a arrays de expresión GeneChip HGU133Plus2.0 (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, EE.UU.)., que contienen 54675 sonda fija. El GeneChips se lavaron y se tiñeron con estreptavidina-ficoeritrina en una estación de fluidos GeneChip 450 (Affymetrix). Después del lavado, las matrices fueron digitalizadas en un escáner Affymetrix GeneChip 3000 con cargador automático. Un total de 30 conjuntos HGU133Plus2.0 fueron procesados con n = 5 repeticiones biológica para todos los grupos de tratamiento.
Expresión análisis se realizaron con el software expresionista Pro 4.0 (Genedata AG, Basilea, Suiza). La calidad de los archivos de datos (formato CDA) que contienen datos de nivel de expresión sonda fue comprobado y refinado usando el software expresionista Refinador (Genedata AG). El proceso refinador se llevó a cabo por la agrupación de las muestras en función de nivel de intensidad. Esto permite la identificación de posibles valores extremos en el nivel de intensidad característica. Posteriormente, CEL archivos refinados se condensaron con el algoritmo MAS5.0 (Affymetrix) y LOWESS normalizado utilizando todos los experimentos como referencia. Los conjuntos de datos de expresión normalizada fueron cargados en la base de datos Cobi (Genedata) y se analizaron con el software Genedata expresionista. Principio de análisis de Componentes Principales (ACP) y la agrupación jerárquica se realizó con el software Pro 4.0 expresionista Analyst (Genedata). Un análisis del valor proporción válida se realizó para cada grupo (4 de 5 conjuntos de sondas tenían que mostrar una señal) y los grupos resultantes de la sonda fija fueron unidas. Estos datos fueron sometidos a una serie de comparaciones por pares utilizando el software Pro 4.0 expresionista Analyst (Genedata). Los análisis estadísticos incluyeron comparaciones por pares entre los SAG o PAC muestras tratadas y las muestras tratadas con vehículo. Se consideraron los conjuntos de sonda está regulada cuando estaban fuera de la región elipsoide en la trama Volcán aplicación de los siguientes umbrales: volcán parcela: & gt; el cambio 5x veces y valor de p & lt; 1 × 10-5 de T-test para 40 nM SAG y PAC; de 2,5 nM SAG y 4 nM PAC & gt; 3 veces el cambio y el valor de p & lt; 5 × 10-3. Venn intersección de los análisis se realizaron significativamente genes regulados para identificar genes regulados comúnmente por los diferentes tratamientos que usan el software expresionista Analista Pro 4.0. Pathway análisis se realizaron con el GeneGo MetaCore (St. Joseph, MI, EE.UU.) de bases de datos y herramientas de software. Están disponibles todos los datos en archivos de Affymetrix cel a través del número de acceso ArrayExpress E-MTAB-377.
Clonación de shRNA construye
El bloque-iT RNAi algoritmo Designer (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU. ) se utilizó para analizar TP53 ARNm (GenBank número de acceso, NM_000546.4) e identificar tres secuencias diana para shRNA, es decir shTP53_1 (sentido) 5 'GCATCTTATCCGAGTGGAAGG-3' y 5'-CCTTCCACTCGGATAAGATGC-3 '; shTP53_2 (sentido) 5 'GACTCCAGTGGTAATCTAC-3' y 5'-GTAGATTACCACTGGAGTC-3 '; shTP53_3 (sentido) 5 'GCGCACAGAGGAAGAGAATCT-3' y 5'-AGATTCTCTTCCTCTGTGCGC-3 '. Las secuencias diana para un control no específico shRNA (no la orientación shRNA) eran shCtrl1 (sentido) 5 'TAAGGCTATGAAGAGATAC-3' y 5'-GTATCTCTTCATAGCCTTA-3 'y shCtrl2 (sentido) 5' TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 'y 5 '-ACGTGACACGTTCGGAGAA-3'.
complementarias oligonucleótidos de ADN sintéticos se hibridaron y se insertaron en pENTR /vector U6 (Invitrogen). casetes shRNA se recombinan por Gateway clonación en un PLENTI-6 destino vector modificado (pGT3, Invitrogen) para generar shRNA expresión lentiviral construye shCtrl1, shCtrl2, shTP53_1, shTP53_2, y shTP53_3. Todas las construcciones fueron confirmadas por secuenciación del ADN en los Servicios de Biología Molecular (SMB), Berlín, Alemania.
Producción de lentivirus y la transducción de las células A549
293FT células fueron transfectadas con vectores de expresión diferentes pGT3 que contiene TP53 shRNAs o control no-objetivo shRNA. producción Lentivirus se llevó a cabo de acuerdo con la U6 RNAi Entrada Vector Kit Manual del usuario BLOCK-iT (Invitrogen). Las células A549 se infectaron con lentivirus recombinante para shTP53_1, shTP53_2, shTP53_3, o el control no objetivo shRNAs shCtrl1 y shCtrl2, respectivamente, y se seleccionaron con higromicina (100 g /ml). Los clones individuales se expandieron y se ensayaron para la eficiencia TP53- caída de QRT-PCR (datos no mostrados) e inmunotransferencia.
Resultados
sagopilona inhibe eficazmente la proliferación de líneas celulares de cáncer en el rango nanomolar
La actividad anti-proliferativa de SAG y PAC se examinó en 6 no pequeñas líneas celulares de cáncer de pulmón de células de diferentes subtipos (adenocarcinoma: A549, NCI-H1437, NCI-H23, NCI-H522; carcinoma de células escamosas: NCI -H226; gran carcinoma de pulmón de células: NCI-H460) usando un
in vitro
ensayo de proliferación in (figura 1A).. SAG inhibió la proliferación de células tumorales de pulmón en todas las líneas celulares, con valores de IC50 que van desde 0,2 hasta 3,3 nM, y fue eficaz a concentraciones sub-nanomolares (≤ 1 nM) en cinco de las seis líneas celulares. Por otra parte, el SAG fue consistentemente más eficaz que la PAC.
1A, SAG y el PAC inhiben la proliferación de líneas celulares de cáncer de pulmón. Seis líneas celulares de cáncer de pulmón diferentes fueron tratados con SAG o PAC durante 72 horas. La proliferación se midió con el ensayo de cristal violeta. Se muestran los valores de IC50 media como medida de la inhibición del crecimiento media máxima y las desviaciones estándar. 1B, Inmunofluorescencia tinción de α-tubulina (verde) y ADN (rojo) en células de cáncer de pulmón A549 después de la incubación con vehículo (0,1% de etanol), 2,5 nM, o 40 SAG nM. Barra de escala = 20 micras. se muestran imágenes representativas de interfase y células mitóticas. 1C, el análisis FACS de células A549 tratadas con vehículo, 2,5 y 40 nM SAG o 4 nM y 40 nM PAC durante 18 horas revelaron G2 /M detención a 40 nM SAG o PAC y el número de células con CH aumentaron; 2 N y & gt; 2N el contenido de ADN y el enriquecimiento de G
0 /G
1 fase del ciclo celular en 2,5 nM SAG o 4 nM PAC. 1D, la inducción de apoptosis mediante el aumento de las concentraciones de SAG en células A549. A549 células fueron incubadas durante 72 horas con vehículo, o 2,5 nm, 5 nm, 10 nm, 40 nm o 100 nm SAG. Además, las células se tiñeron con yoduro de 3,3'-dihexyloxacarbocyanine (DiOC6 (3)) y yoduro de propidio para FACS medición. Las barras blancas indican el porcentaje medio de células caracterizadas por la disminución de ΔΨm (ΔΨm baja) y las barras negras indican las células con ΔΨm señal de baja y alta de yoduro de propidio (PI + y ΔΨm baja) debido a la ruptura de la membrana de plasma. Se da la media de tres experimentos independientes y desviación estándar.
sagopilona interfiere con las funciones del citoesqueleto e induce la apoptosis en células A549
Otros experimentos en el modo general de acción del SAG se realizaron con el A549 como modelo de línea celular. A549 células tratadas con vehículo mostraron un margen normal de los microtúbulos en las células en interfase y husillos bipolares típicos con cromosomas congressed en la placa de la metafase de la mitosis en las células (fig. 1B). Por el contrario, cuando las células A549 se incubaron con 40 nM SAG marcados agrupación de microtúbulos en las células en interfase era visible que condujo a una organización husillo anormal en las células en metafase, con múltiples polos del huso, varias placas de cromosomas congressed, y un alineamiento cromosómico irregular. Estos efectos celulares eran dependientes de la dosis y también se observa tras la incubación con 2,5 nM SAG, pero en menor medida.
Efectos de SAG y PAC en la progresión del ciclo celular se midieron en células A549
in vitro
con el análisis FACS (Fig. 1C y complementaria. Fig S1). Se observaron dos fenotipos diferentes: Las bajas concentraciones de SAG o PAC (0,5-5 nM y 2-7 nM, respectivamente) inducidas división celular aberrante que resulta en la formación de un mayor porcentaje de células aneuploides con un contenido de ADN & lt; 2N o & gt; 2N, pero sólo un ligero aumento en el porcentaje de células en fase G2 /M. Se observó un fenotipo diferente a mayores concentraciones de SAG y PAC (& gt; 10 nM): Aquí, un aumento dramático en el porcentaje de células en la G2 /M fase se observó (Fig 1C y Fig complementario S1..). Para todos los nuevos análisis de los dos fenotipos diferentes, se emplearon dos concentraciones que inducen o bien el fenotipo aneuploides, es decir, 2,5 nM SAG o 4 PAC nM o el fenotipo de detención de la mitosis, es decir, 40 nM SAG o PAC.
Una concentración la inducción de la apoptosis dependiente de la SAG se observó en el análisis FACS después de 72 horas de incubación. Curiosamente, el tratamiento con bajas concentraciones de SAG (2,5, 5, y 10 nM) la proliferación celular inhibe eficazmente pero inducida solamente poco apoptosis, mientras que los tratamientos SAG de alta concentración (40 nM y 100 nM) condujo a la inducción pronunciada de la apoptosis en células A549 ( Fig. 1D).
efectos fuertes de alta concentración, pero no por la baja concentración sagopilona tratos en los cambios en la expresión de genes en todo el genoma en células A549
se aisló ARN de las células A549, sin tratar , vehículo de control-tratado, así como tratar con dos concentraciones de cada uno de SAG (2,5 nM y 40 nM) y PAC (4 nM y 40 nM) durante 18 horas, y se hibridó a arrays Affymetrix HGU133Plus2.0. se obtuvieron de alta calidad de los datos de expresión génica. Un principio de análisis de componentes (PCA) basado en la expresión de todos los genes reveló dos grupos principales: Un grupo contenía el, SAG no tratado tratado con vehículo y baja concentración (2,5 nM) - o-tratada PAC (4 nM) muestras, mientras que las muestras tratadas con altas concentraciones (40 nM) de SAG o PAC formado un grupo aparte (Fig. 2A, 2B) que indica que el tratamiento con una baja concentración de fármaco de SAG o PAC indujo solamente relativamente pequeños cambios de expresión génica en comparación con las muestras no tratadas, mientras que una alta concentración de fármaco de la SAG o PAC induce fuertes cambios de expresión génica.
2A y 2B. Análisis de componentes principales (PCA) de los microarrays de datos de las células A549 tratadas (gris), tratado con vehículo (gris oscuro), o se trataron con 2,5 nM (azul) o 40 SAG nm (azul oscuro) y 4 nm (verde) o 40 nM PAC (verde oscuro) durante 18 horas. Cada esfera trazada representa el perfil de expresión de una muestra individual con n = 5 repeticiones biológicos independientes sobre la proyección de los datos de los tres primeros componentes principales, que representan la mayor parte de la variabilidad de los datos (ejes marcados). Las vistas desde dos ángulos diferentes (Fig. 2A, 2B) se muestran para visualizar la agrupación.
pruebas t emparejadas que comparan cada grupo de tratamiento con los grupos tratados con vehículo fueron realizadas y los resultados que se muestran como Volcán parcela (suplementario Fig. S2) que representa el significado como una función del factor de cambio. Cuatro listas de genes se generaron con los parámetros de umbral para el valor P y doble cambio de los tratamientos de alta y baja concentración de ambos compuestos fueron como se describe en la Tabla 1, junto con el número total y el número de genes regulados hacia arriba y hacia abajo. Las listas de genes obtenidos a partir de las pruebas estadísticas se compararon mediante diagramas de Venn. Del total de 503 genes regulados por 40 nM PAC y 593 por 40 nM SAG, 391 genes fueron regulados por tanto ambos tratamientos, lo que indica un conjunto similar de genes afectados por una alta concentración de ambas las PT. Un análisis de ontología de genes (GO) de los 391 genes regulados con el software GeneGo MetaCore reveló una orden de ocurrencia y rango similar de procesos biológicos (datos no mostrados), indicando un mecanismo muy similar de acción tanto para las PT a alta concentración. Por el contrario, al comparar los 593 genes regulados por 40 nM SAG con los 221 genes afectados por el tratamiento con 2,5 nM del mismo fármaco, sólo los 41 genes fueron regulados comúnmente por ambas concentraciones de fármaco y un escaso nueve genes fueron comúnmente regulados por 40 nM ( [35]. [15].