Extracto
Nos propusimos estudiar los efectores clave de resistencia y sensibilidad a los inhibidores de la tirosina quinasa erbB2, tales como lapatinib en los cánceres de mama y de pulmón ErbB2 positivos. A base de células
vitro
mutagénesis dirigida modelo resistencia lapatinib en varias mutaciones identificadas, incluyendo el controlador de acceso ErbB2 mutación ErbB2-T798I, como la mediación de la resistencia. ErbB2-T798I diseñado modelos celulares de hecho muestran resistencia a lapatinib, pero siguen siendo sensibles a los inhibidores de EGFR /ErbB2 irreversible, PD168393, lo que sugiere posibles estrategias de tratamiento alternativo para superar la resistencia. Perfiles de expresión génica estudios identificaron un grupo selecto de abajo objetivos regulados por la señalización de ErbB2 y definen PHLDA1 como un gen regulado por disminución de inmediato a ErbB2 oncogénico inhibición de la señalización. Nos encontramos significativa baja regulación de PHLDA1 en el cáncer de mama primario y PHLDA1 es estadísticamente significativamente menor expresada en ErbB2 negativo en comparación con los tumores ErbB2 positivos consistentes con su regulación por ErbB2. Por último, PHLDA1 bloques de sobreexpresión de señalización AKT, inhibe el crecimiento celular y mejora la sensibilidad a lapatinib más el apoyo a una importante función de regulador de crecimiento negativo. Nuestros hallazgos sugieren que PHLDA1 podría tener funciones inhibidoras clave en ErbB2 pulmón accionado y las células de cáncer de mama y una mejor comprensión de sus funciones podría apuntar a nuevas opciones terapéuticas. En resumen, nuestros estudios definen formas novedosas de la modulación de la sensibilidad y resistencia a la inhibición ErbB2 en el cáncer dependiente de ErbB2
Visto:. Li G, Wang X, Hibshoosh H, Jin C, Halmos B (2014) Modulación de ErbB2 El bloqueo en los cánceres de ErbB2-positivo: El papel de ErbB2 mutaciones y PHLDA1. PLoS ONE 9 (9): e106349. doi: 10.1371 /journal.pone.0106349
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, China
Recibido: 17 Septiembre, 2013; Aceptado: 6 Agosto de 2014; Publicado: 19 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de la Sociedad Americana del cáncer (concesión no RSG-08-303-01-TBE al BH) y /Programa Nacional de cáncer de los NIH Instituto Especializado de Excelencia en la Investigación en cáncer de pulmón humano CA90578-04 P50 subvención (BH). asistencia histopatología fue proporcionado por la patología molecular de recursos compartidos, Herbert Irving Comprehensive Cancer Center. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ErbB2 es un receptor tirosina quinasa unida a la superficie de la membrana celular y está involucrada en las vías de transducción de señales que conducen al crecimiento y la proliferación celular. Este gen se amplifica en el 10-20% de los cánceres de mama, y los resultados de amplificación en la sobreexpresión de la proteína, que indica un fenotipo agresivo [1] - [4]. La sobreexpresión, amplificación y, ocasionalmente, la activación de mutaciones de ErbB2 también se producen en otros tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón de células no pequeñas [5], [6]. El anticuerpo humanizado trastuzumab (Herceptin) contra el ErbB2 sobreexpresada se ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de cáncer de mama y gástrico con la amplificación ErbB2 [7]. Además, las mutaciones somáticas en el dominio quinasa de ErbB2 se descubrieron en diversos cánceres sólidos incluyendo carcinomas de mama y de pulmón [8] - [12]. Más recientemente, los inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR /ErbB2 dual también se han mostrado prometedores en estudios clínicos. Un doble, reversible inhibidor de EGFR /ErbB2, lapatinib (Tykerb), en particular, ha demostrado una actividad significativa en los cánceres de mama ErbB2 positivos y ahora está aprobado para ser usado en esta indicación [13]. http://en.wikipedia.org/wiki/HER2/neu - cite_note-3Inhibition de ErbB2 autofosforilación de tirosinas por lapatinib abroga aguas abajo de Ras-Raf-ERK1 /2 y PI3K-AKT señalización en ErbB2 overexpressing líneas celulares de cáncer de mama de crecimiento /supervivencia y en pacientes con cáncer de mama que sobreexpresan ErbB2 [14].
El desarrollo uniforme de la resistencia adquirida a lapatinib desgracia limita su eficacia clínica. En la configuración de análogos, mutaciones secundarias, tales como el exón 17 KIT mutaciones en GIST resistentes a imatinib y EGFR T790M en los cánceres de pulmón EGFR mutado son mecanismos comunes de resistencia [8], [15]. No hay datos in vivo actualmente disponible sobre los posibles mecanismos de resistencia a lapatinib. En un sistema de modelo in vitro, la mutación secundaria, ErbB2 T798I imparte el efecto de resistencia lapatinib más fuerte en las células Ba /F3 y es análogo al receptor del factor de crecimiento epidérmico T790M [16] - [18]. Un estudio reciente sugiere que, en sistemas de modelos in vitro el desarrollo de la co-dependencia de las vías de señalización de ER-podría ser otro mecanismo potencial para la resistencia lapatinib [19]. También hay datos que sugieran la implicación de la activación de AXL en lapatinib-resistencia en cáncer de mama ErbB2 positivo [20]. Claramente, existen otros mecanismos también. Teniendo en cuenta las dificultades de obtener muestras de pacientes primaria, es importante para la construcción de sistemas celulares experimentales para la detección de mecanismo de resistencia relevante que entonces permite el ensayo de inhibidores de alternativas para superar la resistencia. Es tajante que la AKT /PI3K y vías ERK /MAPK son los efectores inmediatos clave de la señalización oncogénica ErbB2. Sin embargo, su focalización tiene serias deficiencias en términos de toxicidad y un índice terapéutico estrecho debido a sus importantes funciones fisiológicas. Por lo tanto, una mejor comprensión de toda la gama de cambios descendentes debe permitir la identificación de nuevas dianas de acciones concretas y el desarrollo de estrategias más efectivas y duraderas para el tratamiento de los cánceres de ErbB2 positivos.
En nuestro estudio, nos propusimos hacia el doble objetivo de mejorar nuestra comprensión de estas dos áreas fundamentales de ErbB2 oncogénico SEÑALIZACIÓN adquirido resistencia y efectoras y moduladores de las vías descendentes. En primer lugar, hemos establecido la sensibilidad al tratamiento con lapatinib de líneas de células de pulmón y el cáncer de mama ErbB2 positivos, identificamos una serie de putativa adquirió mutaciones de resistencia y demostró que las mutaciones de plomo ErbB2-T798 a la resistencia que se pueden superar por el inhibidor de ErbB2 irreversible, PD168393. A continuación, hemos completado un estudio de perfiles de expresión génica identificación de un grupo clave de los genes diana temprana ErbB2 e identificamos PHLDA1 como objetivo abajo novela de ErbB2 señalización con un papel funcional en mecanismos de retroalimentación negativa para afinar la salida de la señalización de ErbB2 y de ese modo mejorar significativamente la sensibilidad de las células de cáncer de mama ErbB2 positivos a lapatinib. Nuestros estudios proporcionan varias nuevas vías para extender los beneficios de la inhibición de ErbB2 en el tratamiento de cánceres dependientes de ErbB2.
Materiales y Métodos
Paciente material
El tejido de cáncer de mama y el tejido mamario normal que rodea el tumor se obtuvieron de un mismo paciente. Los tejidos fijados en formalina se utilizaron para el estudio de inmunohistoquímica. El proyecto fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Presbiteriano de Nueva York de la Universidad de Columbia, y los pacientes dieron su consentimiento por escrito de conformidad con la Declaración de Helsinki.
Reactivos
EGF fue adquirido de Sigma Aldrich (St. Louis, MO), PD168393 y CL387,785 se adquirieron de Calbiochem (Billerica, MA), lapatinib se adquirió de Selleck Químicos (Houston, TX). Los fármacos se disolvieron en DMSO para dar una /L solución de 10 mmol y la concentración final de DMSO en todos los experimentos fue. & Lt; 0,1%
Cell Cultura y
Calu3, HCC827, H1975, HCC202, células HCC1569, HCC1937 y T47D se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, las células SKBR3 se mantuvieron en medio de McCoy suplementado con 10% FBS. MDA-MB-468 y las células MDA-MB-436 se mantuvieron en medio L-15 de Leibovitz suplementado con 10% FBS, células MCF-7 se mantuvieron en medio DMEM suplementado con 10% FBS. Todas las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2 y estaban en la fase de crecimiento logarítmico en el inicio de todos los experimentos. Se proporcionan las células MCF-7, MDA-MB-468 y MDA-MB-436 aquí por cortesía del Dr. Matthew Maurer (Universidad de Columbia). Todas las líneas celulares se adquirieron originalmente a partir de ATCC (Manassas, VA)
mutagénesis ErbB2, la generación de bibliotecas, y la resistencia a fármacos pantalla
El plásmido pcDNA3.1 constructo. (-) - ErbB2-HA fue generada como se ha descrito previamente [8]. Hemos introducido una nueva enzima sitio AgeI en la posición 1457 en el ADNc de ErbB2. Luego arrastró todo el dominio transmembrana tirosina quinasa y la unión de ErbB2 mediante digestión AgeI-AfeI AFEI (sitio- posición 3191). Uso de la pcDNA3.1 mutado (-) - ErbB2-HA plásmido, se realizó la mutagénesis aleatoria usando los cebadores que abarcan la región de 1.457 a 3.191, en presencia de 50 mmol /L MnCl
2. Subclonación en p-GEM-T Easy vector y la secuencia de las colonias individuales mostró que esencialmente todos los productos de la PCR contenían mutaciones, con 50% de los productos que contienen un cambio 1-bp. La piscina de fragmentos de ADN amplificado se digirió con AgeI y AfeI y volvió a ligar en la cadena principal pcDNA3.1 (-) - ErbB2-HA vector. células SKBR3 parentales fueron transfectadas con las bibliotecas mutagenizadas. clones de células se seleccionan por medio fresco que contiene 500 mg /ml G418 y 1 mol /L lapatinib después de la transfección 24 horas. Un mes más tarde, las colonias de células se aislaron y se amplificaron adicionalmente en presencia de ambos G418 y lapatinib y luego se resequenced el dominio tirosina quinasa de ErbB2. alineación y análisis de la secuencia se realizó con el software DNASTAR y Mutación Surveyor (SoftGenetics, State College, PA).
Generación del plásmido ErbB2 T798I construir
El vector de expresión de ErbB2 T798I fue generada por sitio- mutagénesis dirigida (kit de mutagénesis QuickChange, Stratagene, Santa Clara, CA) de la pcDNA3.1 (-) - ErbB2-HA plásmido constructo. Los cebadores utilizados para la mutagénesis dirigida al sitio eran T798I, 5'-CACGGTGCAGCTGGTGATACAGCTTATGCCCTATG-3 '(sentido) y 5'-CATAGGGCATAAGCTGTATCACCAGCTGCACCGTG-3' (antisentido). La secuencia apropiada del constructo generado se confirmó mediante resecuenciación. También se construyó un tipo salvaje expresión ErbB2 construir como el control para los ensayos de transfección. estudios de transfección transitoria se realizaron utilizando células COS-7 con estos plásmidos reconstruidos. Se utilizó el análisis de transferencia de Western para confirmar el éxito de la transfección con el uso de un anticuerpo anti-etiqueta de hemaglutinina. se utilizó G418 (500 mg /ml) para seleccionar las células transfectadas de forma estable y las colonias aisladas se recogió usando anillos de clonación y continuó siendo cultivadas en presencia de G418. La expresión de la proteína mutante T798I ErbB2 se confirmó por la detección de la expresión de la etiqueta de hemaglutinina como anteriormente.
Cell Growth Análisis Inhibición
Las células se sembraron en cada pocillo de placas de 96 pocillos en medio celular que contiene 10% de FBS. 24 horas después de la siembra, las células se trataron con concentraciones especificadas de los inhibidores. La concentración de DMSO en el medio se ajustó a 0,1%. Después de 72 horas de incubación, el número de células viables se midieron mediante el uso de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2
H
-tetrazolium, sal interna (MTS; absorción de formazan a 490 nm; CellTiter96, Promega, Madison, WI) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cada ensayo consistía en tres pocillos replicados de la misma concentración de fármaco. La IC50 se determinó a partir de las curvas de dosis-respuesta.
Immunoblotting
Para evaluar la activación de señalización de ErbB2, se mueren de inanición las células durante 12 horas y después se incubaron con lapatinib o PD168393 durante 3 horas, seguido de EGF ( 100 ng /ml) o heregulina (/ml) estimulación 20 ng por 15 minutos. Lisados de células enteras se separaron en 8% en geles de SDS-poliacrilamida, se transfirieron a nitrocelulosa, y expresión de la proteína se detectó mediante el uso de Western relámpago quimioluminiscencia reactivo (Perkin-Elmer Life Science, Wellesley, MA). Fosfo-Akt (Ser473), fosfo-ERK 1/2 (T202 /Y204), el total de Akt, anticuerpos totales-ERK y GAPDH fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA). Los anticuerpos contra ErbB2 (C-18), PHLDA1 [21] - [23] y la etiqueta de hemaglutinina (F-7) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anticuerpo dirigido contra fosfo-ErbB2 (Y1248) se adquirió de R amp y; D Systems (Minneapolis, MN). anticuerpos anti-ratón secundaria y anti-conejo se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology. Los experimentos se repitieron tres veces.
Ensayos
Anexina /yoduro de propidio y BrdU
En ambos ensayos, las muestras fueron analizadas en un celular activado por fluorescencia escanear citómetro EPICS XL MCL (Beckman Coulter, Miami, FL ). yoduro de propidio (PI) ensayo de apoptosis anexina /se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (kit de tinción de Annexin V-FLUOS, Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Las células se sembraron a 1 x 10
6 células /pocillo en placas de 10 cm; 24 horas después de medio de siembra se actualiza a concentraciones especificadas de los inhibidores, a continuación, se incubaron durante 72 horas adicionales. Las células fueron tripsinizadas, lavadas con PBS, se resuspendieron en Anexina /propidio tampón de tinción de yoduro de (Roche Applied Science), y después se analizaron por citometría de flujo. Los datos se analizaron con el software FlowJo (Árbol Star, Ashland, Oregón). Bromo-desoxiuridina (BrdU) ensayo de proliferación celular se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (FITC BrdU Flow Kit, BD Pharmingen, San Diego, CA). Brevemente, las células Calu3 fueron tratados con lapatinib a diferentes concentraciones (concentración final: 0, 0,1, 1, 3, y 10 mmol /L) durante 3 días, a continuación pulso etiquetados para 60 min con 10 M BrdU, se recogió mediante tripsinización y se permeabilizaron con tampón BD cytoperm, se tiñeron con anticuerpo anti-BrdU fluorescente, a contratinción con 7-amino-actinomicina D para el contenido de ADN total y se analizó por citometría de flujo. Los experimentos se repitieron al menos tres veces.
Oligonucleótido Análisis
células
Calu3 y SKBR3 fueron cultivadas a 60% de confluencia en medio de cultivo y luego se trataron con lapatinib (1 m), o DMSO ( 0,01%) como control durante 6 horas. El ARN celular total fue aislado utilizando el RNAeasy mini kit (Qiagen, Germantown, MD). la calidad del ARN se evaluó mediante la estación de electroforesis automatizada Experion (Bio-Rad) y se cuantificó por espectrofotometría de fibra óptica utilizando el Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Inc., Wilmington, DE, EE.UU.). Se sintetizó ADNc, etiquetados y hibridizada a los microarrays de Affymetrix HG-U133A y escaneado. El valor de la expresión para cada gen se calculó utilizando el software de Affymetrix GeneChip y el método robusto multichip media (RMA) para la extracción de la señal.
preprocesamiento, filtrado y análisis estadístico
Se analizaron los datos de microarrays y la tasa de falso descubrimiento se calculó utilizando SAM (Universidad de Stanford, CA). la normalización de la matriz y el cálculo de los valores de expresión del chip se realizaron utilizando ADN-Chip Analyzer (dChip). Para la anotación de los genes resultantes, se utilizó el navegador gen ontología NetAffymetrix (http://ww.affymetrix.com). Los genes expresados diferencialmente con ≥2 o ≤0.5 cambio veces, q-valor ≤ 1% se analizaron mediante la prueba t y agrupados con el clúster paquete de software 3.0 [24].
PCR cuantitativa Ensayo
ARN total de muestras por triplicado fue aislado mediante el uso de RNAeasy mini kit (Qiagen). El ADNc se sintetizó con M-MLV transcriptasa inversa (transcriptasa inversa SuperScipt III, Invitrogen, Grand Island, NY) con el uso de oligo (dT) cebadores a partir de Invitrogen. Todas las muestras se analizaron por Roche LightCycler usando las sondas verdes Syber. Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla S1. Los niveles de expresión de GAPDH se utilizaron como referencias internas para normalizar cDNA de entrada. a continuación, se calcularon las proporciones de nivel de cada gen de GAPDH.
La inmunohistoquímica
fijado en formol secciones de tejido del tumor de mama primario se deparaffinized y rehidratada y se incubaron con peróxido de hidrógeno al 0,6% en metanol. solución de recuperación diana, pH 9,0 (Dako, Carpinteria, CA) fue utilizado para la recuperación de antígenos. Los portaobjetos se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C seguido de tinción utilizando el Kit Vectastain R.T.U universal rápida (Vector Laboratories, Burlingame, CA) con hematoxilina contratinción nuclear. Por último, los portaobjetos se deshidrataron en etanol de forma secuencial, se aclaró con xilenos. El anticuerpo anti-PHLDA1 se utilizó en una dilución 1:50 (Santa Cruz Biotechnology). La intensidad de la tinción de PHLDA1 fue marcado por un patólogo certificado por la junta cáncer de mama como 0 (sin expresión), 1+ (expresión débil), 2+ (expresión moderada) y 3+ (fuerte expresión) y el porcentaje (0-1,0 también se evaluó) de las células tumorales teñidas positivamente para generar una H-puntuación compuesta (intensidad puntuación X por ciento positivo, rango de valores posibles 0-3.0). se utilizó plata hibridación in situ (SISH) para determinar el estado de ErbB2 en las muestras de cáncer de mama humano [25]. La relación de ErbB2 /cromosoma 17 se calculó dividiendo la puntuación total de ErbB2 por la puntuación total para el cromosoma 17. Una proporción de & lt; 1,8 indica que el gen ErbB2 no fue amplificado, mientras que una proporción de & gt; 2,2 amplificación indicado del gen . Para los casos con una proporción entre 1.8 y 2.2, las señales procedentes de 20 más núcleos tumorales fueron contados en cada diapositiva y se calculó una nueva relación.
Construcciones de plásmidos y transfección celular
ADNc de longitud completa de la secuencia de PHLDA1 humano se amplificó a partir de ADN genómico de las células HCC827. entonces PHLDA1 se modificó con un HA-tag en el extremo C-terminal por la superposición de PCR para distinguir plásmido derivado de proteína nativa y se subclonó en el pcDNA3.1 (-) del esqueleto del vector. La precisión de la construcción se confirmó por secuenciación directa del ADN. células SKBR3 fueron transfectadas transitoriamente con pcDNA3.1 vacío (-) (pcDNA3.1 (-) - EV) o PHLDA1 (pcDNA3.1 (- PHLDA1 -)) vectores de expresión utilizando Fugene 6 (Roche Applied Science). De manera estable se seleccionaron subclones transfectadas con G418 a una concentración de 500 g /ml a partir de 48 h después de la transfección
Anchorage independiente ensayo de ensayo de crecimiento y la migración
Para el ensayo de crecimiento independiente de anclaje, pcDNA3.1 (. - ) -EV y pcDNA3.1 (-) - PHLDA1 se tripsinizaron las células transfectadas estables, contados dos veces usando un hemocitómetro, y se sembraron a 5000 células /ml en tapones superiores que consta de 0,4% de agarosa SeaPlaque (FMC Bioproducts, Rockland, ME) en McCoy de medio 5A. Después de 25 días, las colonias se fotografiaron y se contaron. El experimento se repitió tres veces con triplicados cada uno. Se representaron promedio de número de colonias de cada experimento. Para los ensayos de migración, monocapas confluentes de pcDNA3.1 (-) - EV y pcDNA3.1 (-) - PHLDA1 células transfectadas estables se rayan con una punta de pipeta de 10 l estéril. A continuación, las placas se lavaron y se incubaron a 37 ° C en 10% de medio FBS 5A /de McCoy durante 48 horas
supervivencia clonogénico ensayo
Dos mil pcDNA3.1. (-) - EV y pcDNA3 0.1 (-) - PHLDA1 células SKBR3 en placas de 6 cm y se dejaron recuperar durante 24 horas. Las células se trataron a continuación con 0,1 M o 0,5 M lapatinib y se dejaron crecer durante 10 días. A continuación, las placas se tiñeron con azul de metileno durante 4 horas y se determinaron el número de colonias con más de 50 células en cada placa. Un conjunto de placas no tratados se incluyeron como controles para determinar la eficiencia de plaqueo de líneas de células individuales. Se determinó el número efectivo de células /placa en la base de la eficiencia en placas de cada línea celular y el número de células cultivadas en placas por placa. Estos números se utilizaron para calcular el porcentaje de supervivencia. Además, cada tratamiento se realizó por triplicado con el fin de determinar la SD para cada punto de datos.
El análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba de chi-cuadrado o de dos muestras
t
: pruebas en su caso, con
P
-valor de & lt; 0,05 considerado estadísticamente significativo. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. Los datos son representativos de tres experimentos separados.
Resultados
El lapatinib y PD168393 inducir la inhibición del crecimiento y la apoptosis en Calu3 ErbB2-positivo y las células SKBR3
En primer lugar, realizamos el crecimiento celular MTS Los ensayos para examinar si la inhibición de ErbB2 por lapatinib, una doble EGFR reversibles /ErbB2 inhibidor de tirosina quinasa, o PD168393, que inhibe de forma irreversible ErbB2, puede conducir a la inhibición del crecimiento de células de cáncer de ErbB2 positivos, como el cáncer Calu3 pulmonar ErbB2-positivo y RBSK líneas celulares de cáncer de mama -3. Se encontró que tanto lapatinib y PD168393 inhibieron significativamente el crecimiento de células SKBR3 y Calu3 (Fig. 1A). Nuevas investigaciones utilizando anexina V tinción mostró que tanto lapatinib y PD168393 apoptosis inducida prominente tanto en las células Calu3 y SKBR3 (fig. 1B y 1C). Se realizó un análisis incorporación de BrdU para mostrar reducida la proliferación de estas dos líneas de células por tratamiento lapatinib. El lapatinib células tratadas Calu3 mostró un mayor G
1 población coherente con G
1 arresto en comparación con las células control (Fig. 1D) y esto se confirmó en las células SKBR3 (Figura S1). Estos resultados sugieren que lapatinib induce la detención del ciclo celular en el G
1 fase y la posterior apoptosis en las células Calu3 y SKBR3. Con el fin de determinar el efecto sobre las vías de señalización corriente abajo, los niveles de fosforilación de las vías de MAP quinasa y Akt se evaluaron en estos dos modelos celulares ErbB2 positivos, y se encontró bloqueo robusta de las dos vías de señalización (Fig. 1E, la figura S2). Este hallazgo se correlacionó con los resultados de los ensayos de inhibición de crecimiento de hecho, lo que sugiere que la inhibición del crecimiento causada por lapatinib y PD168393 puede ser regulada a través del bloqueo eficaz de la MAP quinasa y Akt.
A. La proliferación celular de las células Calu3 y SKBR3 tratadas con diferentes concentraciones de lapatinib y PD168393 según lo determinado por el ensayo de MTS. B. El lapatinib y PD168393 inducen la apoptosis celular en las células Calu3 y SKBR3. Anexina Representante V /yoduro de propidio citometría de flujo; los números representan el porcentaje de células en el cuadrante correspondiente. C. Cuantificación de apoptosis. D. Lapatinib induce la detención del ciclo celular en las células Calu3 como se detecta por BrdU y el ensayo de 7-ADD. fase R1-G1; R2-fase G2; fase R3-S; R4-fase G0. respuesta E. dosis de lapatinib y PD168393 sobre la fosforilación de ErbB2, AKT y ERK en las células SKBR3 Calu3 y en respuesta al tratamiento EGF. p-ErbB2: ErbB2 fosforilados; t-ErbB2: Total-ErbB2; p-AKT: AKT fosforilada; t-AKT: AKT total, p-ERK: ERK fosforilado; t-ERK:. ERK total de
Caracterización de la resistencia mutante T798I-ErbB2
A continuación, se llevó a cabo una estrategia de mutagénesis al azar con el fin de evaluar las mutaciones secundarias de ErbB2 que puede conducir a funcional resistencia a lapatinib. En primer lugar, todo el dominio transmembrana y la tirosina quinasa de ErbB2 (posiciones 1.457 a 3.191) se mutagenizó azar. A continuación, el ErbB2 mutagenizado se remodeló en un pcDNA3.1 (-) - ErbB2-HA columna vertebral y se transfectó en células SKBR-3. Hemos generado clones de células SKBR-3 resistentes a los medicamentos en la presencia de ambos /ml de G418 y 1 mol /L lapatinib y identificados 9 sustituciones de aminoácidos distintas 500 g afectan a 5 residuos de derivados clonales aisladas. Se identificaron cinco sustituciones en las posiciones: P944L (3 casos), T798I (2 casos), T798M (1 caso), C576S (1 caso), R487P (1 caso), y E542G (1 caso). El residuo treonina gatekeeper crítico en el caso de ErbB2 es T798- que corresponde a T790 de EGFR así como T315 de la quinasa ABL. Basándose en la secuencia de nucleótidos de ErbB2, es significativamente más probable que una mutación alteraría la secuencia para T798I (requiere una base de cambio de pares) versus T798M (requiere dos cambios de pares de base). Por lo tanto, T798I se eligió para estudios adicionales.
T798I se regeneró mediante mutagénesis dirigida al sitio y se utiliza para estudios de transfección transitoria en células Cos-7. En pcDNA3.1 (-) - células ErbB2-WT Cos7, 1 mol /L lapatinib fosforilación significativamente inhibida de ErbB2. En contraste, en pcDNA3.1 (-) - transfectantes ErbB2-T798I, la fosforilación de ErbB2 persistente se observó en la presencia de lapatinib en concentraciones que van de 0,1 a 10 mol /L, confirmando el cambio en la sensibilidad a los fármacos correspondientes a los resultados de la MTS ensayos (Fig. 2A). Para confirmar esta observación, también generó un clon de células Calu3 establemente transfectadas con el pcDNA3.1 (-) - ErbB2-T798I-HA plásmido constructo y encontramos resultado muy consistente (Fig 2B.). Se evaluó el nivel de resistencia que pcDNA3.1 (-) - ErbB2-T798I confirió a lapatinib generando curvas de dosis-respuesta mediante ensayos de MTS en pcDNA3.1 (-) - ErbB2-T798I transfectantes estables. Las células se cultivaron en presencia de concentraciones crecientes de lapatinib que van de 0 a 10 mol /L. pcDNA3.1 (-) - ErbB2-WT células Calu3 se potentemente inhibidas por lapatinib (IC
50, 2.3 mol /L). las células que expresan Calu3 pcDNA3.1 (-) - ErbB2-T798I eran menos sensibles a lapatinib con una CI
50, 6.5 mol /L (Fig 2C).
A.. Respuesta a la dosis de lapatinib y PD168393 en la fosforilación de ErbB2 en células Cos-7 después de 24 horas de la transfección transitoria con vectores de ErbB2 en peso y ErbB2-T798I. ErbB2 total, HA y nivel de expresión de GAPDH como control. B. Respuesta de la dosis de lapatinib y PD168393 sobre la fosforilación de ErbB2, AKT y ERK en clones de células estables Calu3 ErbB2 en peso y ErbB2-T798I. ErbB2 total, AKT total, el total ERK, HA y expresión de GAPDH como control de nivel. inhibición del crecimiento C. dependiente de la dosis inducida por el tratamiento de lapatinib y PD168393 durante 72 horas en clones de células Calu3 estable ErbB2 en peso y ErbB2-T798I tal como se detecta mediante el ensayo de MTS. D. El lapatinib y PD168393 inducen la apoptosis celular en clones de células estables Calu3 ErbB2 en peso y ErbB2-T798I después del tratamiento de 72 horas. E. La cuantificación de la apoptosis.
Asimismo, analizaron las consecuencias funcionales de T798I mediante la evaluación de la apoptosis celular inducida por lapatinib como se define por ensayos de apoptosis yoduro de Anexina /propidio. El tratamiento de pcDNA3.1 (-) - ErbB2-WT células Calu3 con 1 mol /L de lapatinib resultaron en un aumento importante en el porcentaje de células apoptóticas, mientras que las mismas concentraciones habían inducido significativamente menos apoptosis en pcDNA3.1 (-) - ErbB2-T798I transfectantes estables (Fig. 2D y 2E). Estos resultados fueron consistentes con estudios de transfección transitoria se persiguen en las células SKBR3 (Figura S3, S4 y S5).
Un inhibidor PD168393 ErbB2 alternativa puede superar la resistencia
A continuación, probamos los clones T798I Calu3 contra la PD168393 inhibidor de ErbB2 /EGFR irreversible. Hemos llevado a cabo ensayos de MTS estándar siguientes 72 horas de tratamiento con fármacos usando un intervalo de concentraciones de 0 a 10 mol /L. Nuestros datos muestran que PD168393 pudo superar la resistencia inducida contra T798I lapatinib (Fig. 2C). Este inhibidor era tan eficaz contra pcDNA3.1 (-) - ErbB2-T798I como contra pcDNA3.1 (-) - ErbB2-WT transfectantes. En los estudios de señalización, se encontró que PD168393 inhibe completamente AKT y la fosforilación de ERK en concentraciones tan bajas como 0,03 mol /L de modo que con el fin de mostrar mejor el cambio de señalización corriente abajo, se utilizó una gama de concentraciones de 0 a 0,1 mmol /L. estudios de señalización mostraron que el tratamiento con PD168393 puede inhibir potentemente la señalización aguas abajo se correlaciona tal como fosfo-AKT y ERK (Fig. 2B). nivel de fosforilación de ErbB2 en células con ErbB2 mutante fue alterado pero en menor grado por la inhibición PD168393 sugestivo de una inhibición parcial (Fig. 2B). estudios Anexina /yoduro de propidio mostró aún más la inducción de apoptosis por este compuesto, tanto en pcDNA3.1 (-) - ErbB2-en peso y pcDNA3.1 (-) - clones de células ErbB2-T798I Calu3 (Fig. 2D y 2E). Estos resultados sugieren que T798I podría ser un mecanismo de resistencia importante en los tumores tratados con lapatinib-pero también sugieren el potencial eficacia de los inhibidores irreversibles ErbB2.
perfiles de expresión génica de las células tratadas con lapatinib
A continuación, nos propusimos para estudiar una gama completa de cambios aguas abajo como consecuencia de la inhibición efectiva de ErbB2. Anteriormente, en estudios similares hemos demostrado que tan pronto como a las 6 horas de la inhibición de la señalización, el inhibidor de EGFR irreversible, CL-387785 podría inducir un cambio significativo de la transcripción en un grupo pequeño y representante de los efectores clave de la señalización de EGFR oncogénica, incluyendo vía de los componentes importantes, tales como la ciclina D1, DUSPs etc en los cánceres de pulmón EGFR mutantes [1], [26], [27]. De una manera análoga, nos propusimos identificar los primeros efectores de ErbB2 inducida por los cambios de expresión génica en las células ErbB2 positivos. Para identificar los genes clave expresados diferencialmente en las células SKBR3 tratadas con lapatinib (1 mol /L) durante 6 horas, un estudio del perfil de expresión génica se llevó a cabo por triplicado en el ARN celular total utilizando Affymetrix HG-U133A virutas. Los datos de expresión primas fueron preprocesados, reajustarán, se filtraron, y se analizaron como se describe en Materiales y Métodos. Los genes alterados por el tratamiento lapatinib se muestran en la Tabla S2. Este análisis mostró que 110 genes marcadores se redujeron reguladas y 73 genes fueron reguladas con los estrictos criterios establecidos de un factor de cambio al menos 2 y el valor Delta & gt; 5 cuando las muestras lapatinib tratados se compararon con las células tratadas con vehículo (la valor delta es un parámetro de ajuste que puede cambiar dinámicamente los umbrales de significación) guía.
una comparación de esta lista de genes con nuestros datos anteriores que identifican cambios en los genes sobre la inhibición del EGFR en células de cáncer de pulmón EGFR-dependiente [27], [28 ] mostró una notable superposición entre los genes modulados de manera significativa en los dos experimentos independientes (Tabla 1). Más de la mitad de los genes identificados en nuestro estudio anterior de la regulación de genes por el bloqueo de EGFR se modula significativamente la inhibición ErbB2 en células de cáncer ErbB2-positivas, así que sugieren vías oncogénicas altamente compartidos. Seis de los ErbB2 genes superiores /EGFR-regulada, dusp6, DUSP4, PHLDA1, se seleccionaron PHLDA2, CCNG2 y DRE1 y confirmó estar fuertemente regulada por el análisis cuantitativo PCR con transcripción inversa del ARN obtenido de células lapatinib tratados (Fig. 3) . análisis
PCR cuantitativa de la regulación de genes por tratamiento lapatinib durante 6 horas en las células SKBR3 y Calu3. Doblar la inducción con respecto al control de 0 horas se trazó después de la normalización de GAPDH. Δ: p & lt; 0,05; ×: p & lt; 0,01; †: p & lt; 0,005; *: P & lt; 0,001
PHLDA1 es el regulado por la inhibición del EGFR /ErbB2
A continuación, decidimos centrarnos en la novela gen diana aguas abajo, PHLDA1 como una proteína. que anteriormente no fue identificado para participar en /EGFR impulsado vías ErbB2. Este gen pertenece al grupo de las proteínas de dominio de homología pleckstrin-y se especula para funcionar a través de interferir con la función de la activación de AKT PI3-quinasa inhibiendo de este modo basado en el trabajo en otro miembro de la familia, PHLDA3 [29]. P.ej.