Extracto
Polygonatum odoratum
lectina (POL), aislado de hierba tradicional medicina china
(Mill.) Druce
, ha llamado la atención creciente debido a sus actividades biológicas de ancho. En el presente estudio, los efectos anti-tumorales, incluyendo apoptosis y propiedades autofagia inductor de POL, se determinaron mediante una serie de métodos de biología celular, tales como MTT, la observación morfología celular, citometría de flujo, inmunotransferencia. En este documento, se encontró que POL podría inducir la apoptosis y la autofagia de forma simultánea en las células A549 cáncer pulmonar de células no pequeñas humanas. POL inició la apoptosis a través de la inhibición de Akt-NF-kB, mientras que desencadenó la autofagia POL
a través de
Akt-mTOR supresión, lo que sugiere el papel interruptor molecular de Akt en la regulación entre la apoptosis y la autofagia inducida por POL. Por otra parte, ROS estaba involucrado en la inhibición POL-inducida de expresión Akt, y por lo tanto puede mediar tanto la apoptosis y la autofagia en las células A549. Además, POL muestra ninguna citotoxicidad significativa hacia las células de fibroblastos de pulmón embrionario HELF humanos normales. Debido a las actividades antitumorales, POL podría llegar a ser un medicamento potente contra el cáncer en la terapia del futuro, lo que podría allanar el camino para la exploración de las lectinas relacionadas con GNA en fármacos eficaces en el tratamiento del cáncer
Visto:. Li C, Chen J, Lu B, Shi Z, Wang H, Zhang B, et al. (2014) Molecular cambio de rol de Akt en
Polygonatum odoratum
inducida por apoptosis y la autofagia lectina humana en células no pequeñas Cáncer de pulmón A549 células. PLoS ONE 9 (7): e101526. doi: 10.1371 /journal.pone.0101526
Editor: P. Jin Cheng, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: Enero 15, 2014; Aceptado: June 8, 2014; Publicado: 3 Julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81373311, Nº 31300674, Nº 30970643, Nº 81173093 y No. J1103518), el Programa Especial de Ciencia Juvenil y el Grupo de Investigación innovadora de la provincia de Sichuan Tecnología, China (No. 2011JTD0026). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las lectinas son designados como proteínas de unión a carbohidratos que existen ampliamente en animales, plantas y microorganismos, y que podría obligar a los carbohidratos, las células aglutinadas o precipitar polisacáridos y glicoconjugados [1]. El rápido progreso se ha logrado en el aislamiento y caracterización de lectinas de plantas, y recientemente la clasificación de las lectinas se ha enmendado de 7 familias en 12 familias [2] - [4].
De nota, el cáncer está asociado con programada la muerte celular (PCD), que desempeña un papel importante en la conservación de la homeostasis, diferenciación celular, control de crecimiento, las células de defensa y etc, sellando conjuntamente el destino final de las células del cáncer [5]. En general, hay dos tipos principales de PCD, en referencia a la apoptosis y la autofagia. La autofagia es un mecanismo celular conservado evolutivamente para el despacho de las macro-complejos y orgánulos en las células eucariotas dañados o superfluos, lo que conduce a favor de la supervivencia, ya sea o pro-muerte efectos [6]. La apoptosis, que puede ser regulada por numerosas vías de señalización moleculares, se dirige principalmente para el suicidio tumor. La autofagia y apoptosis tienen distintas características morfológicas y fisiológicas proceso, sin embargo, aún existen complejas interrelaciones entre ellos [7].
Polygonatum odoratum gratis (Mill.) Druce, un representante típico de las Liliáceas familia, es una importante medicina herbal china tradicional debido a sus grandes variedades de compuestos biológicamente activos.
Polygonatum odoratum
lectina (POL), aislado de
Polygonatum odoratum gratis (Mill.) Druce, es un
Galanthus nivalis aglutinina
(GNA) -relacionado familia específica de unión a manosa lectina, y ejerce efectos notable inhibición del crecimiento frente a células A375 [8]. informe previo ha demostrado que induce POL L929 apoptosis de las células a través tanto de la muerte de los receptores y vías mitocondriales, así como amplificada apoptosis de células L929 inducida por TNF-[9]. Sin embargo, si POL podría inducir la apoptosis y la autofagia de forma simultánea en las células cancerosas se encuentran todavía en su infancia. Y hasta ahora, solamente
Polygonatum cyrtonema
lectina (PCL) puede inducir simultáneamente tanto la apoptosis y la autofagia en las células humanas de melanoma A375 [10] y las células L929 [11]. Por lo tanto, la apoptosis y la autofagia efectos inductores de POL necesita ser explorado.
Materiales y Métodos
El modelado molecular
estructura tridimensional de POL se construyó usando SWISS -Modelo servidor (http://swissmodel.expasy.org/) con la estructura de PCL (AP ID: 3A0E). como plantilla [12], [13]
cultivo de células
líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón A549 fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, EE.UU.), mientras que las líneas celulares embrionarias humanas normales CAES de fibroblastos de pulmón fueron adquiridos de banco de células (Academia de Ciencias de china, Shanghai, china). las células A549 de cáncer de pulmón de células no pequeñas humanas se cultivaron en medio RPMI-1640 (Gibco), que contiene 10% de SFB, 100 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen), 100 U /ml de penicilina (Invitrogen), y se mantuvieron a 37 ° C con 5% de CO
2 en un ambiente humidificado. Y las células de fibroblastos de pulmón HELF embrionarias humanas, que se utiliza como grupo de control correspondiente, se cultivaron en medio esencial mínimo de Dulbecco (Gibco) que contiene los mismos materiales.
Reactivos
POL se purificó y mantenido por nuestro laboratorio [8]. suero bovino fetal (FBS), 3- (4,5-dimetrylthiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT), 3,3-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB), monodansylcadaverine (MDC), inhibidor de la autofagia 3- metiladenina (3-MA), naranja de acridina (AO), rodamina 123 y z-VAD-fmk fueron adquiridos de Sigma Chemical (St. Louis, MO, EE.UU.). citocromo
c
cóctel de anticuerpos apoptótica WB (ab110415) se obtuvo para MitoSciences (Eugene, Oregon, Estados Unidos). ARNs pequeños de interferencia (siRNAs) contra Beclin1 humana (# 6222), LC3 (# 6212) y el control de siRNA (# 6568) fueron adquiridos de Tecnologías de Señalización Celular, EE.UU.
A raíz de anticuerpos fueron adquiridos de Santa Cruz Biotech.: pro-caspase3 (# SC-7148), pro-caspase9 (# SC-56073), Bax (# SC-493), Oferta (# SC-6538), Bcl-2 (# SC-492), Bcl-X
L (# SC-8392), PARP (# SC-7150), el NF-kappa B (# SC-109), fosfo-NF-kB (Ser536) (# SC-136548) y β-actina (# SC- 47778). Además, los anticuerpos incluyendo fosfo-Beclin1 (Ser234) (ab183335), mTOR (ab2732) y fosfo-mTOR (Ser2448) (ab109268) eran de Abcam. Los anticuerpos para LC3 (mAb#12741), Akt (pan) (mAb#4685), fosfo-Akt (Thr308) (mAb#2965), fosfo-Akt (Ser473) (mAb#4060), fosfo-p70S6K (Thr389) ( mAb#9234) y fosfo-4EBP1 (Thr37 /46) (mAb#2855) fueron adquiridos de Tecnologías de señalización Celular, EE.UU.. Las proteínas se visualizaron utilizando anti-conejo o anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa (HRP) y tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobencidina (DAB) como sustrato HRP.
constitutivamente activado Akt (Myr-Akt, Addgene plásmido 9008 ), NF-kappa B (T7-Rela Addgene plásmido 23251), mTOR (Bandera-mTOR, Addgene plásmido 26603), el vector vacío (pcDNA3, Addgene plasmid10792) fueron adquiridos de Addgene.
ensayo de inhibición del crecimiento
células A549 se sembraron en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante el tiempo indicado, y se realizaron los efectos citotóxicos de diversas concentraciones de POL como se describe anteriormente [14]. La absorbancia a 570 nm se midió con un espectrofotómetro (Modelo 3550 lector de microplacas, Bio-Rad).
La viabilidad celular (%) = (OD
570 nm (fármaco) /OD
570 nm (control )) x 100%.
se determinó la inhibición manosa ensayo
ensayo MTT como se ha mencionado anteriormente, excepto que las lectinas se preincubaron a 37 ° C durante 30 min con diferentes tipos de manosas, tales como manosa α (1,3), manosa α (1,6) y manosa α (1,3:1,6), que puede inhibir completamente la actividad hemaglutinante a diferentes concentraciones de POL.
ensayo de apoptosis
células A549 y HELF fueron tratados con PBS y 23 mg /ml POL durante 12 h, 24 h, 36 h y 48 h. La morfología celular Se obtuvieron imágenes de contraste de fase por microscopía (Leica, Wetzlar, Alemania), así como microscopía de fluorescencia (Olympus, Tokio, Japón) con Hoechst 33342 tinción. Entonces, total de 6 × 10
5 células A549 /pocillo en placas de 6 pocillos y se incubaron durante 24 h, y se trataron con PBS o 23 mg /ml POL durante otras 12 h, 24 h, 36 h ó 48 h de incubación. Las células recogidas se analizaron por citometría de flujo ensayo como se describe antes [15]. Para clasificar más temprano y apoptosis tardía en células A549 POL-tratada, ensayo de tinción doble con anexina V-FITC /PI se realizó mediante el kit isotiocianato de Anexina V-fluoresceína (FITC) de detección de apoptosis de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BD Pharmingen, San Diego , CA, EE.UU.).
la autofagia ensayo
Después de la incubación con 23 mg /ml para POL indicada tiempo, A549 y las células se cultivaron HELF con MDC 0,05 mM a 37 ° C durante 60 minutos. La intensidad de fluorescencia de las células se analizó por citometría de flujo. Además, las células A549 incubadas con PBS o 23 ug /mL POL de tiempo indicado se tiñeron con naranja de acridina (10 ng /ml) durante 15 min y se sometieron a citometría de flujo. Las células fueron transfectadas, respectivamente, con Beclin1 siRNA, LC3 siRNA y control de siRNA a 33 nM usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se utilizaron las células transfectadas para los experimentos posteriores 24 h más tarde.
caspasa ensayo
La apoptosis se evaluó mediante la medición de la actividad de la caspasa-3 usando el kit de la actividad de caspasa-3 (Beyotime Instituto de Biotecnología Haimen, china) siguiendo las instrucciones del fabricante.
la detección de potencial de membrana mitocondrial potencial
membrana mitocondrial se midió usando el colorante fluorescente rodamina-123 como se ha descrito anteriormente [15]. La intensidad de la fluorescencia de las células A549 interfería con 23 mg /ml POL durante 12 h, 24 h, 36 hy 48 h se analizó mediante citometría de flujo.
Determinación de ROS intracelulares
Después del tratamiento con diversas concentraciones de POL para los períodos de tiempo indicados, las células A549 se incubaron con 10 M 2 ', 7'-diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA) durante 60 min a 37 ° C. La intensidad de fluorescencia de las células A549 se midió por citometría de flujo con una longitud de onda de excitación de 480 nm y una longitud de onda de emisión de 525 nm. Intracelular contenido de GSH y la actividad enzimática GPX se midieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
transfecciones
Las células A549 se sembraron en placas de 60 mm con medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina llegado a una densidad de 1 × 10
6 células /placa. Luego, las células A549 cultivadas en forma continua PRMI 1640 sin 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina durante otras 2 h. Con el fin de formar complejo de plásmido-Lipofectamine LTX, los plásmidos se mezclaron con 25X diluyente Lipofectamine LTX, y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. A continuación, las transfecciones se llevaron a cabo, respectivamente, en medio OptiMEM de suero reducido (Invitrogen) que contiene 1 mg /ml de ADN, 0,1% más de reactivos y 0,3% de reactivo de transfección Lipofectamine LTX, y añaden el medio con el plásmido en platos de 60 mm para otro 48 h de cultivo de células A549. Por último, la eficiencia de transfección se detectaron por análisis Western Blot.
Western blot análisis
células A549 se trataron con 23 mg /ml POL durante el tiempo indicado, y posteriormente tanto adherente, así como las células flotantes fueron recolectados. Se realizó un análisis de transferencia Western de lisados de células como se ha mencionado anteriormente [16], [17].
El análisis estadístico de los datos
Todos los datos se expresan como media ± SEM de al menos tres experimentos independientes . Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante ANOVA de dos vías y ANOVA de una vía con la prueba post hoc de Bonferroni. Un value≤0.05 p fue considerado significativo.
Resultados
familia relacionada con GNA El modelado molecular de POL
Las lectinas de soportar diferentes secuencias de aminoácidos constitución, pero todos ellos exhibía estructura tridimensional similar. -GNA relacionados lectinas familia de los osos estricta la actividad de unión a manosa, y conservado motivo de aminoácidos de 'QXDXNXVXY' juega un papel importante en el reconocimiento de manosa. POL poseía tres subdominios conservadas 'QXDXNXVXY', y por lo tanto, POL era estricto lectina de unión a manosa. Como se muestra en la Fig. 1A, la estructura tridimensional de POL fue construido, y el monómero de POL exhibió una estructura β-barril que comprende tres subdominios (I, II, III), cada subdominio se compone de tres o cuatro hebras de hoja β antiparalela interactuar por Ω bucle.
(A) estructura molecular del monómero POL. (B) El carcinoma de colon Caco-2 células, las células HeLa de carcinoma de cuello uterino, células A549 del cáncer de pulmón de células no pequeñas, el carcinoma hepatocelular HepG
2 y 7721 células, las células MCF-7 de carcinoma de mama, células de melanoma A375 fueron tratados con diferentes concentraciones de POL durante 24 h, y el CI
50 valores se cuantificaron mediante el ensayo de MTT (media ± SEM,
n
= 3). células A549 (C) se trataron con diferentes concentraciones de POL, y luego la viabilidad celular se determinó por el ensayo de MTT en el tiempo indicado (media ± SEM,
n
= 3). (D) Various concentración de POL se preincubó a 37 ° C durante 30 min con manosa (1-3), manosa (1-6) y manosa (1-3; 1-6), y después se trató con células A549 para 24 marido. La relación de inhibición celular se midió mediante el ensayo de MTT (media ± SEM,
n
= 3).
Los efectos citotóxicos de POL sobre células A549
El inhibidor del crecimiento efectos de POL se evaluaron mediante el ensayo de MTT en células cancerosas humanas, incluyendo células de carcinoma de colon Caco-2, células HeLa de carcinoma de cuello uterino, células A549 cáncer pulmonar de células no pequeñas, el carcinoma hepatocelular HepG
2 y 7721 células, carcinoma de mama MCF 7 células, células de melanoma A375, y el IC
50 valores se 47 mg /ml, 30 mg /ml, 23 mg /ml, 42 mg /ml, 38 mg /ml, 50 mg /ml y 26 mg /ml , respectivamente (Fig. 1B). Este resultado mostró que POL fue más sensible a las células A549 cáncer pulmonar de células no pequeñas, y por lo tanto, se eligieron las células A549 para una mayor exploración.
POL inducida por la muerte celular A549 de la dosis y forma dependiente del tiempo, y 0 mg /ml a 100 mg /ml POL ejerce potentes efectos inhibidores sobre el crecimiento de las células A549 (Fig. 1C). Después de 24 h de incubación con 23 mg /ml POL, la tasa de inhibición alcanzó casi el 50%.
La correlación entre la actividad de unión a azúcar y anti-proliferativa de POL
El ensayo de inhibición de manosa se realizado para determinar la relación entre la actividad de unión de azúcar de POL y su propiedad anti-proliferativa. Diferentes concentraciones de POL se pre-incubó con manosa α (1,3), manosa α (1,6) y α manosa (1,3:1,6) durante 30 min, respectivamente. Debido a la actividad de unión a manosa de POL, los tres tipos de manosas inhibió completamente la actividad hemaglutinante de POL. Como se muestra en la Fig. 1D, los efectos inhibidores del crecimiento de diversas concentraciones de POL se perdieron en el nivel correspondiente con el perder de la actividad de unión a manosa, que indica que puede haber una relación estrecha entre la actividad hemaglutinante y la propiedad anti-proliferativo de POL.
POL induce la apoptosis en las células A549
marcados cambios morfológicos de apoptosis como la formación de ampollas en la membrana, la reducción del volumen celular y el redondeo, se observaron en las células A549 POL-tratada /ml 23 mg por microscopía de contraste de fase (Fig. 2A). Además, se observó considerable fragmentación del ADN en los núcleos en células A549 POL-inducida, mientras que el grupo control tratado con PBS mostró normales redondos y núcleos homogéneamente teñidas (Fig. 2B). Sin embargo, 23 mg /ml POL no dio lugar a la morfología apoptótica aparente en células HELF no cancerosas después de 24 h o 48 h de tratamiento (Fig. 2C y Fig. 2D). Estos resultados sugieren que POL podría inducir selectivamente las células A549 apoptosis, pero no pudo desencadenar la apoptosis de las células normales HELF. Además, como se muestra en la Fig. 2E, 23 mg /ml POL marcadamente dio lugar a la mejora de la Sub-G
proporción 1 fagos de las células A549 en un tiempo-dependiente manera (b: 27.34 ± 4.1%, c: 39.27 ± 5.8%), lo que indica que POL apoptosis inducida en células A549. Además, anexina V-FITC y PI doble tinción se realizó para clasificar entre células vivas (anexina V- /PI), temprano apoptótica células necróticas (anexina V + /PI-), apoptótica tardía (anexina V + /PI +) y (Anexina V - /PI +). Como se muestra en la Fig. 2F, después de /mL tratamiento POL 23 mg, el porcentaje de células vivas se reduce gradualmente (a: 98,25 ± 1,3%, b: 74,63 ± 4,7%, c: 55,71 ± 3,9%) mientras que la relación de la primera (b: 15,34 ± 2,6%, c: 23,75 ± 2,8%) y tardía (b: 13,94 ± 3,6%, c:. 22,14 ± 4,5%) de las células apoptóticas se mejoraron con el tiempo cada vez mayor
(células A549) a fueron tratados con PBS (24 h) o 23 mg /ml POL durante el tiempo indicado, y las variedades morfológicas se detectaron con microscopía de contraste de fase y (B) microscopía de fluorescencia (200 ×). (C) Después de tratar con células HELF con PBS (24 h) o 23 mg /ml POL durante el tiempo indicado, se detectaron las variedades morfológicos con microscopía de contraste de fase y (D) microscopía de fluorescencia (200 ×). (E) Las diferentes fases porcentaje de células A549 interferido con 23 mg /ml POL durante 24 h o 48 h se midió por citometría de flujo. El grupo de control se trató con PBS durante 24 h. (F) células A549 se expusieron a 23 g /ml POL durante 24 h o 48 h, las relaciones de apoptosis temprana y tardía de la apoptosis se midió por citometría de flujo usando el V-FITC /PI ensayo de doble tinción con anexina. El grupo de control fue tratado con PBS durante 24 h.
POL desencadena la autofagia en las células A549
Con el fin de detectar la formación de vacuolas autofágicos, la intensidad de fluorescencia MDC de 23 mg /ml POL A549 tratado con y células HELF durante 24 h o 48 h se analizaron por citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 3A, vacuolas autofágicos se formaron en las células A549 que fue presentado por el aumento de la intensidad de fluorescencia del MDC, lo que indica la presencia de la muerte celular por autofagia. Sin embargo, en la Fig. 3B, no se incrementó la intensidad de fluorescencia de las células HELF MDC tratados con POL ni después de las 24 h 48 h ni, lo que sugiere vacuolas autofágicos no se formaron en las células HELF POL-inducida. Podríamos incluir que POL podría inducir selectivamente la muerte celular autofágica en células A549, pero no en células HELF. Por adicionalmente usando tinción con naranja de acridina, la formación de orgánulos vesiculares ácidos (AVO) en células A549 POL-triggered se demostró (Fig. 3C). Desde la mejora y transformación de LC3I a LC3II Beclin1 eran las características de la autofagia, se detectaron las expresiones de Beclin1 y LC3 en células A549 POL-inducida. Como se muestra en la Fig. 3D, POL indujo el aumento dependiente del tiempo de nivel Beclin 1 y la acumulación de la LC3-II en las células A549. Posteriormente, las expresiones de Beclin1 y LC3 fueron derribados por el uso de siRNAs específicos (Fig. 3E). La transfección con Beclin1 o LC3 siRNA disminución de la inhibición del crecimiento celular POL-inducida (Fig. 3F). Todos estos resultados indican que POL autofagia en células A549 inducida.
células A549 (A) y células HELF (B) fueron tratados con PBS (24 h) o 23 mg /ml POL durante el tiempo indicado, y la MDC la intensidad de fluorescencia se analizó mediante citometría de flujo. células A549 (C) se trataron con PBS (24 h) o 23 mg /ml POL durante el tiempo indicado, y la intensidad fluorescente naranja de acridina se midió por citometría de flujo. (D) células A549 se trataron con 23 mg /ml POL durante el tiempo indicado, seguido por análisis de transferencia Western para la detección de los niveles de fosforilados-Beclin1 y LC3. β-actina se utilizó como control de carga igual. células A549 (E) fueron transfectadas con Beclin1, LC3 o ARNsi de control durante 24 h, la niveles LC3 Beclin1 y se examinaron por análisis de transferencia Western. (F) células A549 se transfectaron con Beclin1, LC3 o ARNsi de control durante 24 h seguido de la estimulación con o sin 23 mg POL /ml durante 24 h, la relación de inhibición del crecimiento celular se midió mediante el ensayo de MTT (media ± SEM,
n
= 3).
POL induce la apoptosis dependiente de caspasa en las células A549
Tal como se muestra en la Fig. 4A, después de autophagic inhibidor de tratamiento 3-MA, 23 mg /ml POL mejora de forma significativa la actividad de caspasa-3 en una manera dependiente del tiempo, lo que indica la apoptosis inducida por POL ocurre a través de la activación de los ejecutores de apoptosis comunes, tales como la caspasa-3. Además, análisis de transferencia Western después de se inhibió la autofagia mostraron que después de tratamiento con 23 mg /ml POL durante el tiempo indicado, se escindieron de la caspasa-3 y -9, ya que la procaspasa-3 y -9 se redujeron mientras exfoliados caspasa-3 y -9 eran aumento (Fig. 4B a). También, sobre regulación de las proteínas Bax y Oferta pro-apoptóticos, así como la baja regulación de anti-apoptótica Bcl-2 y Bcl-X
se observaron proteínas L después del tratamiento POL. Además, 23 g /ml POL condujo a la escisión de PARP a partir de una banda de 116 kDa a un fragmento de 89 kDa con el tiempo cada vez mayor (Fig. 4B b), y el citocromo
c
fue liberado de las mitocondrias en el citoplasma después del tratamiento POL (Fig. 4B c). Como se muestra en la Fig. 4C y la Fig. 4D, cuando la autofagia fue suprimida por 3-MA, POL disminuyó la intensidad de fluorescencia de rodamina 123 en una manera dependiente del tiempo. Además, la escisión de la caspasa-3 y -9 pudieran ser rescatados en presencia de 10 mM z-VAD-fmk en células A549 POL inducida (Fig. 4E). Y, Sub-G
1 Análisis de la proporción de células y Anexina V /PI tinción doble también se demostraron que inhibidor de caspasas Z-VAD-FMK podría proteger a las células A549 de la muerte celular por apoptosis (Fig. 4F y la Fig. 4G). Todos estos resultados indican claramente que POL induce apoptosis a través de vía mitocondrial mediada en células A549.
(A) Efectos de 23 mg /ml POL sobre la activación de caspasa-3 con el tiempo cada vez mayor (media ± SEM,
n
= 3) (* p & lt; 0,05
vs
0 h grupo).. (B) 23 mg /ml de escisión inducida POL de la caspasa-3, caspasa-9 (a). POL dio lugar a la escisión de PARP, sobre regulación de pro-apoptótica Bax y la subasta, así como la baja regulación de anti-apoptótica Bcl-2 y Bcl-X
L con tiempo de cultivo (b). Los lisados celulares se fraccionaron para aislar citoplásmica y las mitocondrias crudo, y la presencia de citocromo
c
en las fracciones citosólicas y mitocondriales se evaluó por análisis WB usando el cóctel de anticuerpos ApoTrack. β-actina se utilizó como control de carga igual citosol, mientras que la prohibitina se utilizó como control mitocondrias de carga (c). (C) La influencia de 23 mg /ml POL sobre la integridad de las membranas mitocondriales se midió mediante tinción con rodamina 123, y la intensidad de fluorescencia se analizó mediante citometría de flujo. (D) Las variedades de potencial de membrana mitocondrial se presentaron además como diagrama de barras (media ± SEM,
n
= 3) (** p & lt; 0,001
vs grupo control
, ns:. Sin significativo
vs
. El grupo de control). (E) Análisis de transferencia Western de pro-caspasa 3, se escindió de la caspasa 3, pro-caspase9 y los niveles de caspase9 escindidos en las células A549 tratadas con 23 mg /ml solo o en combinación con 10 mM inhibidor de caspasa z-VAD-fmk durante 24 h. (F) células A549 se trataron con 23 mg /ml POL solo o combinado con 10 mM caspasa inhibidor z-VAD-fmk para 24 h y se tiñeron con yoduro de propidio (PI), la cuantificación de los datos de tinción PI presentados como los porcentajes de células en subG
1 fase. (G) La influencia de la caspasa en 23 mg /ml POL-inducida subG
relación de fase 1 fue representado como diagrama de barras (media ± SEM,
n
= 3) (## p & lt; 0,001
vs grupo POL
, ns:.. sin
vs
grupo POL significativo)
La inhibición de la autofagia reduce parcialmente POL-apoptosis inducida por
a medida. se muestra en la Fig. 5A, después de que se suprime la autofagia, célula inhibición del crecimiento inducida por POL se redujo significativamente. La inhibición de la autofagia por 3MA o desmontables de Beclin1 por el pretratamiento con Beclin1 siRNA (Fig. 5B) se redujo la proporción de células positivas MDC (Fig. 5C a), lo que indica que la autofagia fue suprimida por 3MA y Beclin1 siRNA. Además, deprimiendo de la autofagia POL inducida inhibió la apoptosis POL-inducida en las células A549, que se caracteriza por la reducción de la sub-G
1 el contenido de ADN de fagos (Fig. 5C b), así como parte temprana y tardía de apoptosis (Fig . 5C c). Por ello, la supresión de la autofagia por cualquiera 3MA o Beclin1 siRNA también condujo a la disminución de la expresión de PARP división y LC3-II en células A549 tratadas POL (Fig. 5D y la Fig. 5E). Todos estos resultados indican que la inhibición de la autofagia reduce parcialmente la apoptosis POL-inducida en células A549.
(A) las células A549 se trataron previamente con 2 mM 3MA 1 h antes de la administración de 23 mg /ml POL durante el tiempo indicado , y la relación inhibidora de las células se midió mediante el ensayo de MTT. El grupo de control se trató con PBS. (Media ± SEM,
n
= 3) (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,001
vs
grupo de control, ns:. No significativa
vs
de control. grupo,#p & lt; 0,05, ## p. & lt; 0,001
vs
grupo POL). (B) células A549 se transfectaron con ARNsi de control y específica Beclin1 siRNA durante 24 h, el nivel Beclin1 se examinó por análisis de transferencia Western. células A549 (C) se trataron previamente con 3MA 2 mM o transfectadas con siRNA Beclin1 específica antes de la administración de 23 mg /ml POL de 24 h, y la intensidad fluorescente MDC (a), subG
relación de células 1 fagos (b ) y principios, así como fines de la apoptosis (c) se analizaron mediante citometría de flujo. El grupo de control se trató con PBS durante 24 h. Los datos se representan como diagrama de barras. (Media ± SEM,
n
= 3) (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,001
vs
grupo de control, ns:. No significativa
vs
de control. grupo,#p & lt; 0,05, ## p & lt; 0,001
grupo POL
vs).. (D) escindido de PARP y LC3-II expresiones en células A549 tratadas con 23 mg /ml POL durante 24 h en ausencia o presencia de 3MA (2 mM) se midieron. Se muestran las figuras representativas. (E) células A549 se transfectaron preferentemente con el control de siRNA o específica Beclin1 siRNA para el tratamiento 24 horas antes de 23 mg /ml POL durante otras 24 horas, y la división de PARP así como la expresión de LC3II se midieron.
POL desencadena la apoptosis a través de la supresión de Akt-NF-B e inicia la autofagia
a través de la inhibición de
Akt-mTOR
análisis de Western blot mostró que el tratamiento de células A549 con 23 mg /ml para POL hora indicada dio como resultado una disminución de la expresión de fosforilados-NF-kappa B (p65) (Ser536), fosforilada-Akt (Ser473), fosforilada-Akt (Thr308), fosforilada-mTOR (Ser2448), fosforilada 70S6K (Thr389) y fosforilados-4E -BP1 (Thr37 /46) (Fig. 6A). Y los sustratos de aguas abajo de mTORC1, p70S6K (70 kDa ribosomal S6 quinasa) y 4E-BP1, también se desfosforilan de manera eficiente mediante el tratamiento POL en células A549 (Fig. 6A). Con el fin de confirmar la vía de señalización en las células A549 tratadas con POL, se utilizó enfoque genético para células A549 respectivamente POL-tratado a más de Akt-express, NF-KB y mTOR (Fig. 6B) en. Como se muestra en la Fig. 6B, hubo una fuerte activación de Akt, NF-kB y mTOR en células A549 transfectadas comparación con las transfectadas con el vector, lo que confirma la eficacia de transfección. La transfección de Myr-Akt en células A549 (sobre-expresión de Akt) invierte reducción POL-inducida de fosforilados-NF-kappa B (p65) (Ser536) y fosforilado-mTOR (Ser2448) (Fig. 6B). Sin embargo, la transfección de T7-de RelA (sobre-expresión de NF-KB) o Flag-mTOR (la sobre-expresión de mTOR) no dio lugar a ninguna inverso de las proteínas (Fig. 6B), indicando que Akt podría ser el de aguas arriba de NF-kB y mTOR en las células A549 POL-tratada.
(a) Después tratados con 23 mg POL /ml durante el tiempo indicado, los niveles de fosforilados-Akt, Akt, fosforilada-NF-kB (p65) , se detectaron NF-kB (p65), fosforilada-mTOR, mTOR, fosforilada y fosforilada p70S6K-4E-BP1. β-actina se utilizó como control de carga igual. (B) células A549 se transfectaron con el vector vacío, Myr-Akt (activado), T7-de RelA (activado) y Flag-mTOR (activado), y se trató con 23 mg /ml POL para 0 h o 24 h. Los niveles de fosforilados-Akt, Akt, fosforilada-NF-kB (p65), NF-kappa B (p65), se midieron fosforilada-mTOR y mTOR. β-actina se utilizó como control de carga igual. (C) la activación continua de Akt, NF-kB y mTOR prio a /mL tratamiento POL 23 mg durante 24 h, se detectaron las variedades morfológicos con microscopía de contraste de fase. El grupo de control se trató con PBS durante 24 h. (D) Después de la activación continua de Akt, NF-kB y mTOR, 23 mg /ml POL se trató con células A549 durante 24 h, la subG
1 relación de fagos (a), temprano, así como la relación de la apoptosis tardía (b ), la intensidad fluorescente MDC (c), y AVO intensidad de fluorescencia (d) se analizaron por citometría de flujo. El grupo de control se trató con PBS durante 24 h. Los datos se representan como diagrama de barras. (Media ± SEM,
n
= 3). (* P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,001
vs grupo
de control, ns:. No significativa
vs grupo
POL,#p & lt; 0,05, ## p & lt; 0,001
. vs.
grupo POL).
a fin de verificar si estas proteínas están participaron en la apoptosis o la autofagia inducida por POL, la detección de la morfología y citometría de flujo ensayo se aplicaron. Como se muestra en la Fig. 6C, la sobre expresión de Akt invertido muerte celular POL-inducida, mientras que la sobre expresión de NF-kappa B y mTOR aún se mantiene parcialmente la muerte celular inducida por POL. Se indica que Akt podría estar a cargo de POL inducida por tanto la apoptosis y la autofagia en las células A549. Además, Akt sobre-expresión dio lugar a la disminución de subG
1 porción (Fig. 6D a), a principios de apoptosis (anexina V + /PI-) y apoptótica tardía (anexina V + /PI +) de las células (Fig. 6D b), intensidad fluorescente MDC (Fig. 6D c), así como orgánulos vesiculares ácidos formación (AVO) (Fig. 6D d). Estos resultados demostraron que la sobre expresión de Akt podría revertir la apoptosis y la autofagia POL-inducida de forma simultánea, lo que indica la proteína Akt podría implicar tanto en la apoptosis y la autofagia POL-inducida. Sin embargo, la sobre expresión de NF-kappa B solamente dado lugar a la supresión de características apoptóticas, incluyendo significativamente disminuido porciones de subG
1 (Fig. 6D a), así como células apoptóticas tempranas y tardías (Fig. 6D b). Si bien, la sobre expresión de mTOR solamente invertido autofagia POL-inducido, tal como se caracteriza por la reducción de intensidad de fluorescencia de MDC (Fig. 6D c) y AO (Fig. 6D d). Tomados en conjunto, podemos concluir que la apoptosis inducida POL través de la supresión de Akt-NF-B, mientras que la autofagia iniciada
a través de la inhibición de
Akt-mTOR. Akt acciona el interruptor de la autofagia y apoptosis en células A549 POL-tratada.
papel interruptor molecular POL-inducida de Akt es ROS dependiente
niveles de ROS se detectaron usando detección de ROS-colorante fluorescente DCFH DA. Se demuestra que la acumulación de ROS se mejoró en células A549 POL inducida en la dosis y de manera dependiente del tiempo (Fig. 7A). Además, la incubación de las células A549 con 23 mg /ml POL condujo a la reducción del contenido de GSH y la actividad enzimática GPX de una manera dependiente del tiempo, lo que sugiere que POL abrogó el sistema antioxidante GSH y finalmente resultó en la acumulación masiva de ROS en células A549 (Fig . 7B). Y, este 23 mg /ml aumento POL-inducida de ROS puede ser inhibida por el pretratamiento con el eliminador de ROS, NAC (Fig. 7C). Además, este aumento también pudo ser inhibida por el pretratamiento con el inhibidor de la apoptosis z-VAD-fmk o autofagia inhibidor de 3-MA (Fig. 7D). β-actina se utilizó como control de carga igual.