Extracto
Para confirmar la importancia clínica de la expresión de la proteína NF-kB y JNK de candidatos identificados experimentalmente para predecir el pronóstico para los pacientes con tratamiento con 5-FU, se evaluó la expresión de la proteína de especímenes extirpados quirúrgicamente. Un total de 79 muestras se obtuvieron de 30 gástrico y 49 pacientes con cáncer colorrectal que fueron sometidos a resección R0 seguido por postoperatoria 5-FU basado quimioterapia adyuvante. exámenes inmunohistoquímicos de NF-kappa B y JNK en microarrays de tejidos (TMA) revelaron que el tiempo de recaída significativamente más corto (TTR), en tanto NF-kappa B (+) y JNK (-) subgrupos en tanto gástrica (NF-kappa B (+) ,
p = 0,0002
, HR11.7 95% CI3 3,2-43,4;. JNK (-),
p = 0,0302
, HR4.4; IC del 95%: 1,2 a 16,6) y el colon (NF-kappa B (+),
p = 0,0038
, HR36.9, 95% CI 3,2 a 426,0; JNK (-),
p = 0,0098
, HR3.2, el 95% CI 1.3-7.7) tipos de cáncer. Estos patrones de expresión de proteínas también muestran un fuerte poder de forma discriminada en pacientes con cáncer gástrico para tasa de supervivencia global, lo que sugiere una utilidad potencial como marcadores de pronóstico o chemosensitivity. expresión de línea de base de estas proteínas utilizando líneas celulares de cáncer gástrico demostró los patrones recíprocos entre NF-kappa B y JNK, mientras que la exposición 5-FU de estas líneas celulares solamente induce NF-kappa B, lo que sugiere que NF-kB juega un papel dominante en la respuesta a 5 -FU. siRNA experimentos posteriores confirmaron que desmontables gen de NF-kB aumento de la sensibilidad a 5-FU específica, mientras que la de JNK no afectó a la quimiosensibilidad. Estos resultados sugieren que la expresión de estas proteínas puede ayudar en las decisiones involucradas con la quimioterapia adyuvante para el cáncer del tracto gastrointestinal
Visto:. Ishida K, Nishizuka SS, Chiba T, Ikeda H, K Kume, Endo F, et Alabama. (2012) Molecular marcador de identificación para la predicción de recaídas en-Basado en 5-FU quimioterapia adyuvante en los cánceres gástricos y colorrectales. PLoS ONE 7 (8): e43236. doi: 10.1371 /journal.pone.0043236
Editor: Anthony WI. He aquí, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: Marzo 22, 2012; Aceptado: 18 Julio 2012; Publicado: 14 Agosto 2012
Copyright: © Ishida et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de: Fundación de Investigación Keiryokai (101) por el número de seguro social; KAKENHI (21591676); Grant-en-Ayudas a la Investigación Científica (C) por S.S.N; y MIAST (innovación médica por Ciencia y Tecnología Avanzada) proyecto del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, JAPÓN por S.S.N, K.K, N.U., C. M., T. S. y G. W. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Aunque se han establecido varios regímenes quimioterapéuticos estándar, todavía hay una gran necesidad de identificar chemosensitivity o pronóstico marcadores que permiten la predicción de la eficacia de la quimioterapia del cáncer. La aplicación de biomarcadores con un alto poder discriminatorio puede ayudar a los médicos a evitar los regímenes de quimioterapia difíciles con efectos adversos innecesarios, así como para permitir una decisión anterior de utilizar regímenes alternativos. Sin embargo, a pesar del uso de varios métodos de cribado de alto rendimiento en este contexto, la identificación de biomarcadores ha sido difícil [1].
Durante la caracterización de las características moleculares y celulares de un panel de 12 líneas celulares de cáncer humano, hemos desarrollado un sistema en el que una convencional
in vitro se utilizó
ensayo de quimiosensibilidad en el uso de fármacos clínicamente aprobados combinados con expresión de la proteína cuantitativa de perfiles utilizando una matriz de lisado 'fase inversa' (RPA) para identificar las proteínas que pueden ser relevantes para la actividad de los agentes quimioterapéuticos [2]. Ambas tecnologías producen una salida cuantitativa, que permite el análisis de un gran número de combinaciones entre la potencia del fármaco y la expresión de proteínas [2], [3]. Además, este sistema plantea la hipótesis de que el perfil de expresión de una proteína puede ser un predictor de la quimiosensibilidad a un fármaco determinado. entonces se requiere la validación posterior para determinar si los marcadores son clínicamente relevantes con respecto a la quimiosensibilidad.
Una reciente recopilación de datos de pacientes individuales de los casos de cáncer de colon se ha puesto de manifiesto que la quimioterapia adyuvante basada en 5-FU proporciona una significativa disease- la supervivencia libre (DFS) se benefician mediante la reducción de la tasa de recidiva, lo que conduce a un beneficio de supervivencia general a largo plazo (OS) [4]. En los países del Este de Asia, que ha sido bien aceptado que el cáncer gástrico resecable, localmente avanzado se beneficiará de la quimioterapia adyuvante basada en 5-FU como S-1, que es una fluoropirimidina oral, por una supervivencia prolongada y la supervivencia libre de recurrencia (SLR ) [5], [6]. Sin embargo, aproximadamente el 30-40% de los pacientes experimentan recurrencia incluso después de recibir una operación curativa y la quimioterapia adyuvante "estándar" [7], [8]. A pesar del uso intensivo de 5-FU para los cánceres gastrointestinales, hasta la fecha no se han logrado los marcadores de 5-FU de serie-de-práctica utilidad [9].
En el presente estudio, se recogieron 79 extirpado quirúrgicamente especímenes de cáncer de pacientes con cáncer gástrico y de colon que no habían recibido cualquier quimioterapia en el momento de la operación y posteriormente recibieron 5-FU quimioterapia adyuvante con base para determinar si alguno de los marcadores se asociaron con la TTR. Hemos producido un microarray de tejido (TMA) que representa los 79 especímenes en un portaobjetos de vidrio y los probaron con anticuerpos primarios [2] que reconocen una proteína específica identificada como un marcador candidato para la recaída. Para confirmar una asociación directa de la expresión de la proteína y el efecto antitumoral 5-FU, también se realizó gen desmontables de siRNA en varias líneas celulares de cáncer humano.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
el estudio ha sido aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad médica de Iwate, en cumplimiento de la Declaración de Helsinki. Un individuo consentimiento por escrito se obtuvo de todos los pacientes y la confidencialidad absoluta se conserva incluso después de que el paciente ha muerto. Todos los análisis se realizaron de forma anónima por lo que los pacientes individuales no fueron identificados.
Predicción de proteínas como marcadores candidatos de Pronóstico
En primer lugar, lleva a cabo un ensayo de quimiosensibilidad convencional mediante el cual 144 combinaciones de 12 medicamentos contra el cáncer y 12 líneas celulares se evaluaron para la quimiosensibilidad usando una inhibición del crecimiento de 50% (GI
50) valor (a matriz, Fig. 1A) [2]. El nivel de expresión de línea de base de 50 proteínas desde el panel de línea celular se analizó cuantitativamente mediante un 'de fase inversa' microarray lisado (RPA) [10], [11], que es una transferencia de Western en formato dot microescala, seguido de inmunodetección cuantitativa ( matriz P) [12], donde cada matriz se visualiza en base a-media de vinculación agrupación jerárquica (Fig. 1B) [2], [13]. A continuación, se estableció una correlación de correlación entre las matrices A y P (matriz AP) utilizando el algoritmo informado por Scherf et al. [14] (Fig. S1, S2). La matriz de AP nos permite predecir una asociación entre la expresión de la proteína y la quimiosensibilidad. Usando este método, hemos identificado ocho proteínas basado en 5-FU quimiosensibilidad (Fig. 1C, el cuadro S1) [2].
(A) Sobre la base de un ensayo de quimiosensibilidad de un panel de línea celular de cáncer, el A ( se ha creado la actividad) × C (células) = matriz de AC. (B) Datos cuantitativos de expresión de proteínas de cada línea celular determinada por "fase inversa" microarrays lisado genera el C × P (proteína) = matriz de CP. (C) Un mapa de calor con la representación de la agrupación jerárquica de la matriz de AP, que se genera a partir de CA y matrices CP. (D) Coloraciones de inmunohistoquímica de marcadores candidatos para el tratamiento con 5-FU.
extirpado quirúrgicamente muestras
Setenta y nueve especímenes extirpados quirúrgicamente, incluyendo 30 gástrico y colorrectal 49 casos, se obtuvieron de los pacientes que no habían recibido ningún agente contra el cáncer en el momento de la cirugía. Todos los casos quirúrgicos se llevaron a cabo en el Departamento de Cirugía en el Hospital de la Universidad Médica de Iwate entre 1997 y 2008. Después de la cirugía, se confirmaron todos los casos para cumplir con los criterios para la quimioterapia adyuvante basada en 5-FU junto con un diagnóstico clínico-patológico final (Tabla 1) .
TMA
un área de tumor ricos de cada muestra de tejido fue marcado en un hematoxilina y eosina (H & amp; e) sección teñida con un microscopio. El cilindro de núcleo de la zona-tumor rico de cada muestra se troquela desde el bloque de parafina usando un microprocesador tejido manual (KIN-1, Azumaya, Japón) con una aguja de acero que tiene un diámetro interior de 2 mm [15]. Los núcleos cilíndricos fueron dispuestos en bloques de parafina receptor. TMA secciones (4 m de espesor) se obtuvieron utilizando una preparación estándar. En el presente estudio, un núcleo se perforó para cada muestra en el bloque de parafina, sino que también se examinaron algunas secciones adyacentes de muestras fuertemente positivas o negativas para evaluar cualquier heterogeneidad considerable.
La inmunohistoquímica
Las muestras de tejido se incubaron a 97 ° C en 1 mM EDTA pH 9,0 durante 30 minutos en un horno de microondas para la recuperación de antígeno. Posteriormente fueron incubadas con los anticuerpos primarios p65 NF-kB (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA) y JNK /SAPK1 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) durante la noche a 4 ° C. La inmunotinción se realizó usando un sistema DAKO Envision + (DakoCytomation, Dinamarca) y un sistema de tinción automática. Para la evaluación de tinción NF-kappa B, las muestras con más de 10% claro tinción nuclear fueron designados como positivo (Fig. 1D). Para la evaluación de la tinción de JNK, dividimos por primera vez la fuerza de tinción en 4 grados, y, posteriormente, los dividimos en dos grupos (negativos y positivos). La evaluación tinción se concentró en el núcleo de NF-kappa B, y en el citoplasma de JNK, en los componentes epiteliales, tanto para tinciones [16]. La información sobre los anticuerpos primarios utilizados en el estudio se proporciona en la Tabla S2. El marcador final tinción se tabulan de manera binaria para los análisis estadísticos.
Análisis estadístico
Las asociaciones entre las características clínico-patológicos y datos de inmunohistoquímica se utilizaron para evaluar la significación entre las variables categóricas mediante la prueba exacta de Fisher o χ
2 test. TTR y OS se calcularon a partir de la fecha de la operación ya sea a la fecha de la recaída, la muerte o la censura con la estimación de Kaplan-Meier mediante la agrupación de las puntuaciones de expresión de proteínas. Un estimador Kaplen-Meier entre los grupos de grados de inmunohistoquímica se comparó con una prueba de log-rank. análisis de subconjunto multivariante mediante un modelo de riesgos proporcionales de Cox se realizó para explorar la interacción entre TTR /OS e identificar los factores independientes. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando JMP 7.0 (SAS Institute, Cary, NC).
Marcador Molecular inducción por 5-FU
Cinco líneas celulares de cáncer gástrico humano (GSS, huG1-PI, KATOIII , KE39, y MKN45) se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS. De línea de base los niveles de expresión de proteínas de los marcadores identificados (NF-kB /p65 y JNK) se midieron mediante transferencia Western. Las células se trataron con tripsina para la preparación de lisado celular de acuerdo con un protocolo publicado [17]. Las membranas de nitrocelulosa se incubaron con los anticuerpos primarios utilizados para inmunohistoquímica seguido por el desarrollo de la señal quimioluminiscente (SuperSignal West Pico, Thermo Scientific, EE.UU.). Para determinar si los respectivos niveles de proteína fueron mejoradas por 5-FU, se añadieron dos concentraciones diferentes de 5-FU (50 y 100 mM) en el medio de cultivo durante cuatro horas. La inmunocitoquímica también se realizó en cuatro cámaras diapositivas de cultivo celular utilizando los mismos anticuerpos primarios descritos anteriormente seguido de anticuerpos secundarios conjugados 564 Alexa488 o, respectivamente. Un microscopio de fluorescencia estándar se utilizó para examinar la localización celular de las proteínas.
Target de Gene Knockdown
cinco líneas celulares de cáncer gástrico humano fueron cultivadas a 70% de confluencia en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS en una placa de 96 pocillos. Las células se trataron luego con un reactivo catiónico lipofección (
Trans
IT-TKO reactivo de transfección, Mirus, WI) en presencia de siRNA específico para cualquiera de NF-kB p65 o JNK transcripciones de genes (Silencio de Señal, Cell Tecnologías de señalización, MA) durante 48 h. Después de la transfección de ARNsi, cada fármaco (5-FU, cisplatino, docetaxel y paclitaxel) se añadió a una concentración que inhibía el 50% del crecimiento celular (GI
50) para cada línea celular [2] y después se incubó durante un adicional de 48 h para el ensayo de inhibición del crecimiento (WST-1, Dojindo, Japón). Se evaluó el efecto de NF-kappa B en la supresión del crecimiento si el crecimiento se redujo a menos del 50% de siRNA con una concentración de fármaco en el GI
50. El efecto de la JNK siRNA se evaluó si el crecimiento celular fue de más de 50% del control. Todos los experimentos fueron repetidos al menos tres veces. Para comprobar el efecto específico de genes de siRNA, también hemos realizado un experimento utilizando diferentes siRNAs dirigidos p65 y JNK (SignalSilence siRNAI y siRNAII de NF-kB y SAPK /JNK, respectivamente; Cell Signaling Technology). Se obtuvo la misma tendencia para ambas siRNAs. Las muestras de control se corresponden con las líneas celulares de siRNA transfección sin medicamentos contra el cáncer.
Resultados
Los pacientes
La edad media de los 79 pacientes fue de 68 años (rango, 37-83 años ), con 30 cáncer gástrico y 49 pacientes con cáncer colorrectal. Los 79 pacientes fueron sometidos a una gastrectomía o bien colorectomy con disección de ganglios linfáticos. La capacidad de curado operativa hubo tumor residual (R0) para todos los casos. Los hallazgos patológicos revelaron que todos los tumores invadieron más allá de la propia mascularis. Veintiséis (33%) de los pacientes tenían metástasis en ganglios linfáticos negativos patológicamente regionales, mientras que los pacientes no mostraron metástasis a distancia. Todos los pacientes cumplieron con los siguientes criterios para la quimioterapia adyuvante basada en 5-FU: histológicamente confirmado gástrica (& gt; Etapa II) o colorrectal (& gt; T2) del cáncer con cirugía R0 aparente; sin hepática, peritoneal o metástasis a distancia; la edad del paciente entre 20 y 85; sin quimioterapia previa; y la función del órgano adecuado. La quimioterapia se consideró para ser completado si un paciente era capaz de seguir los regímenes basados en los siguientes 5-FU: (i) S-1 (60 mg /m
2 /cuerpo) durante 1 año por cáncer gástrico; y (ii) ya sea doxifluridina (800-1200 mg /día), 5-FU (370 mg /m
2 /día), o UFT-E gránulos (300 mg /m
2 /día) durante seis meses para el cáncer colorrectal. Sesenta (76%) pacientes la quimioterapia completado, 15 (19%) de los pacientes suspendió el tratamiento, y 4 (5%) pacientes tenían información que falta.
La mediana de tiempo de observación después de la operación fue de 3,41 y 5,04 años en el estómago y el colon , respectivamente (rango, 1.41-7.00 años en el estómago, y 0.99-10.24 años en el colon). En los casos en los no-recidivante, el tiempo mínimo de observación fue de 2,43 y 2,36 años en el estómago y el colon, respectivamente. La mediana TTR fue 1,56 y 1,52 años en el estómago y el colon, respectivamente (rango, 0.72-3.33 años en el estómago, y 0,27 a 4,47 en el colon). Entre 77 casos de que se confirmó la condición de la supervivencia, la tasa de supervivencia general a 3 años en los grupos de recaída y no recidivas fue de 0,60 y 0,65 en el estómago y 0,97 y 0,96 en el colon, respectivamente. Los parámetros clínico sobre la base del estado de recaída se muestran en la Tabla S3.
La inmunohistoquímica
Las puntuaciones de inmunotinción de todas las proteínas candidatas fueron evaluables (Fig. 1D y Fig. S3). NF-B mostró tinción nuclear distinta que se dispersa a través de los núcleos y no forman agrupaciones. Algunas células mostraron tinción citoplásmica, pero no fue tan distintos como los que tienen la tinción nuclear. La tinción de JNK no era tan fuerte como la de NF-kappa B, pero estaba claramente localiza en el citoplasma. Los restantes seis proteínas candidatas y tres proteínas de interés estaban en sus lugares subcelular esperados (Fig. S3). Después de determinar la localización subcelular de las proteínas, la intensidad de la tinción se puntuó de forma binaria.
Correlación entre la expresión proteica y conclusiones Clinicopathological
Un análisis de parámetros de contingencia de cada proteína en términos de recaída revelaron que los niveles de proteína de NF-B y JNK se asociaron significativamente con la recaída en el estómago (
p = 0,0004
y 0,029 para la NF-kB y JNK, respectivamente; Tabla S4). Cuando se combinó la expresión de estas dos proteínas, el análisis de contingencia demostró un poder más fuerte que discriminar cada proteína individual.
A partir de un análisis de Kaplan-Meier, JNK y NF-kB niveles de expresión se asociaron con diferencias significativas en la tasa de no recaída (Fig. 2). Una prueba de log-rank del análisis de Kaplan-Meier mostró una diferencia significativa en las tasas de recaída no entre la JNK (+) y JNK (-) grupos, tanto en el estómago (
p = 0,0302
, HR4.4 , 95% IC 1,2-16,6) y colon (
p = 0,0098
, HR3.2, IC del 95% 1.3 a 7.7); y también entre el NF-kappa B (+) y NF-kappa B (-) grupos, tanto en el estómago (
p = 0,0002
, HR11.7; IC del 95%: 3,2 a 43,4) y colon (
p
= 0,0038, HR36.9, 95% 3,2 a 426,0 CI, Fig. 2). Curiosamente, en el estómago, todos los casos (+) NF-kappa B eran JNK (-), mientras que 58% de JNK (-) casos fueron NF-kappa B (+). La probabilidad de recaída cuando estos marcadores se combinaron mostró mayor diferencia de que el uso de los marcadores individuales, tanto en el estómago y el colon (Fig. 2).
p53 también filtrada, timidina sintetasa, y la MDR-1 de expresión en muestras de estómago y de colon agrupados porque se ha sugerido que estas proteínas o genes que codifican pueden estar asociados con 5-FU potencia del fármaco [18], [19], [20], [21]. . Sin embargo, no se observó una asociación significativa entre la tasa de recaídas y el nivel de expresión de estas proteínas (Fig. S4)
De la tasa de SG a 3 años de cáncer gástrico, el NF-kappa B (-) y (+ ) de los casos fue de 0,94 y 0,77, respectivamente, y 0,82 y 1,00 para JNK (-) y (+), respectivamente. De la tasa de SG a 3 años de cáncer de colon, el NF-kappa B (-) y (+) de los casos fue de 0,79 y 1,00, respectivamente, y 0,72 y 0,90 para la JNK (-) y (+), respectivamente. Sin embargo, hubo una diferencia significativa en la tasa de SG por estimación de Kaplan-Meier en el cáncer gástrico (NF-kappa B (+), HR 7,9, IC 95% 2,1 a 30,3; JNK (-), HR 0,25, IC del 95%: 0,06- 1,09, Fig. S5).
análisis de subconjuntos
Para identificar las relaciones generales entre los marcadores y los hallazgos clínico-patológicos, un subconjunto de análisis se realizó con el estómago y colorrectal muestras mezcladas. Se observó una asociación significativa entre el estado de NF-B y T factor /Etapa de TTR (Fig. S6), pero no se observó una asociación significativa entre el estado de JNK y cualquier variable para TTR (Fig. S7). Curiosamente, sin embargo, hubo una asociación significativa entre el estado combinado marcador: y T-Factor /Etapa de TTR, y el estado de finalización de la quimioterapia para el sistema operativo (Fig S8, S9.). La asociación entre el sistema operativo y el estado de cada factor también se analizó de acuerdo con el sexo, la edad, lesiones, clasificación TNM, y el estado de finalización de la quimioterapia (Fig. S10, S11). Un análisis multivariado reveló que la expresión de NF-kB y el factor T fueron factores independientes tanto para las recaídas y la supervivencia.
respuestas moleculares por 5-FU
expresión de la proteína de referencia de NF-kB y JNK era medida por transferencia de Western. Curiosamente, el patrón de expresión era recíproco; líneas de células con alta expresión de NF-kB mostraron una expresión relativamente baja JNK (Fig. 3A). El patrón de expresión recíproca era concordante con la direccionalidad de estas proteínas como biomarcadores. También probamos la inducción de proteínas de 5-FU. expresión de NF-kB fue inducida y el aumento en la fracción de proteína total por 5-FU de manera dependiente de la dosis (Fig. 3B). inmuno análisis posterior reveló que la energía nuclear NF-kB se visualizó prominente después de la exposición de 5-FU, mientras que JNK no mostró un cambio notable en la localización (Fig. 3C).
(A) expresión de la proteína de referencia de NF-kB y JNK en cinco líneas celulares de cáncer gástrico. Tublin se utilizó como control de carga. (B) Inducción de biomarcadores candidatos en respuesta al tratamiento con 5-FU en diferentes concentraciones en MKN45 y KE39. (C) El examen de localización de la proteína fluorescente por inmunocitoquímica utilizando MKN45. (D) El aumento del efecto inhibidor del crecimiento de los agentes contra el cáncer en líneas celulares de cáncer gástrico después de la transfección de ARNsi de p65 NF-kappa B y JNK transcripciones. Las muestras de control son las correspondientes líneas celulares transfectadas con los siRNAs indicados sin agentes anticancerígenos. Las abreviaturas son: CIS, cisplatino; DTX, docetaxel; y PXL, paclitaxel; y 5FU, 5-fluorouracilo. *
p
. & Lt; 0,05, Estudiante
t-test
El Efecto de p65 NF-kB y JNK génica derribo sobre el crecimiento celular
Cuatro de cada cinco líneas celulares (GSS, KATOIII, KE39, y MKN45) mostraron la supresión del crecimiento significativo después de NF-kappa B siRNA transfección y tratamiento con 5-FU (
p Hotel & lt; 0,05, Estudiante
t
-test; Fig. 3D, Fig S12).. La supresión del crecimiento 5-FU-dependiente, estadísticamente significativa se observó en GSS, KATO-III, y MKN45. Se espera que el tratamiento JNK siRNA para inducir un efecto anti-apoptótico basado en estudios previos [22], que se planteó la hipótesis de aumentar la tasa de crecimiento en la presencia de medicamentos contra el cáncer. Cuatro de cada cinco líneas de células tratadas con siRNA JNK demostraron la inducción del crecimiento mediada por 5-FU o ningún cambio. Estos experimentos revelaron que siRNA NF-B y JNK parecen tener papeles recíprocos en cuanto a la supresión del crecimiento mediada por 5-FU.
Discusión
Aunque la elección de la quimioterapia adyuvante después de la resección del cáncer gástrico es ligeramente diferente entre los países, 5-FU se ha demostrado que es la opción de tratamiento más eficaz. Validación de la quimioterapia postoperatoria y la cirugía por sí solo ha demostrado tasas de SG a 3 años de 80,1% y 70,1%, respectivamente, en Japón [23]. quimiorradioterapia postoperatoria (CRT) se ha realizado en los Estados Unidos para el cáncer gástrico avanzado, y el sistema operativo después de la TRC ha sido informado de que el 50%, mientras que la de la cirugía sola fue del 41% [24]. En Europa, el juicio MAGIC reveló la eficacia de la quimioterapia perioperatoria y demostró que la SG a 5 años fue de 36,3% y 23,0% en los grupos de cirugía y quimioterapia por sí solos perioperatorias, respectivamente [25]. Por otra parte, se demostró que la quimioterapia adyuvante (5-FU /LV) para el cáncer colorrectal avanzado para mejorar OS en la década de 1990, y más recientemente una mejora adicional de DFS y OS se ha observado con la adición de oxaliplatino [26]. En general, la quimioterapia adyuvante para el cáncer colorrectal es administrado solamente por seis meses, pero se ha demostrado que proporciona beneficios a largo plazo, incluyendo prolongada de 5 años DFS y OS [4], [26].
Con una nivel de atención establecido, ahora nos enfrentamos a la cuestión de cómo tratar a los pacientes que no estas terapias estándar. De hecho, el 30-40% de los pacientes tratados con el estándar de quimioterapia adyuvante experiencia de recurrencia después de la cirugía dentro de los cinco años en los carcinomas gástricos y de colon avanzados [8], [27]. Por lo tanto, ha sido un objetivo importante para mejorar los regímenes de tratamiento para la población subconjunto donde la terapia estándar puede ser ineficaz.
En el presente estudio, para validar la utilidad de los marcadores identificados, se recogieron los tejidos archivados de pacientes que tenían sufrido una resección curativa para el cáncer gástrico y colorrectal. Todos los pacientes fueron elegibles para recibir quimioterapia adyuvante, incluyendo pacientes con estadio I /II del cáncer colorrectal. Un informe anterior mostró que entre los 769 casos MP de una cohorte retrospectiva de pacientes japoneses, la tasa de recurrencia de la etapa I (punto de fusión, N0) de los pacientes fue de 7% [28]. Aunque el número de pacientes era limitado, el estudio QUASAR informó de que un mayor porcentaje de pacientes en estadio I (25%) que habían recibido cirugía sola murió dentro de los cinco años en comparación con los pacientes que recibieron quimioterapia adyuvante [29]. Por otra parte, se ha informado de que se encontraron células tumorales circulantes en 6% de la etapa I colorrectal pacientes de cáncer después de la operación curativa [30]. Estos hallazgos clínicos y biológicos deben hacer razonable la inclusión de la Etapa I en el presente estudio.
Se ha informado de que aproximadamente el 25% de los pacientes con tumores en estadio II se considera que tienen un mayor riesgo de recurrencia debido : (a) la penetración de la serosa (T4); (B) la invasión venosa extramural; (C) la histología pobremente diferenciado; (D) la presentación de una obstrucción; o (e) que tiene un rendimiento de menos de 10-12 ganglios linfáticos [31]. En el presente estudio, la mayoría de los casos colorrectal en estadio II poseía uno de estos criterios de riesgo, excepto en un caso en el que el paciente era joven (37 años de edad), para lo cual el estudio QUASAR justificó la elegibilidad. Aunque no se recomienda el uso de la quimioterapia en la etapa I y etapa casos II ha sido motivo de controversia, se realizó la validación porque su objetivo era seleccionar a un individuo que no puede beneficiarse de la quimioterapia "estándar" o que tienen un riesgo potencial en las etapas inferiores, que es en contraste con el enfoque de los estudios epidemiológicos.
informes anteriores han demostrado la importancia de NF-kB en el pronóstico, la angiogénesis y la quimiorresistencia en carcinomas de estómago y de colon [32], [33], [34], [ ,,,0],35], [36]. Nuestros datos actuales demuestran que la localización nuclear de NF-kB podría predecir el resultado de los pacientes en el momento de la operación que posteriormente reciben quimioterapia adyuvante. Curiosamente, no se encontraron células tumorales NF-B (+) dispersos en las secciones en las que había una clara distinción entre las células positivas y negativas. experimentos moleculares revelaron una relación recíproca clara entre NF-kB y la expresión de JNK, lo que sugiere una posible asociación con el tratamiento con 5-FU y los hallazgos patológicos. Para aclarar el papel de NF-kB y JNK en la respuesta del tumor a 5-FU, se realizaron experimentos de genes desmontables. Knockdown del gen NF-kappa B (p65) reveló que la mayoría de las líneas celulares de cáncer de prueba demostró la supresión del crecimiento 5-FU-específica clara, mientras que otros medicamentos, incluso inducen el crecimiento celular. Este resultado sugiere una asociación directa entre la sensibilidad al 5-FU y la expresión de NF-kB y apoya la aplicación de diagnóstico de este análisis para la quimioterapia adyuvante basada en 5-FU. También hay que señalar que taxanos e inhibidores de topoisomerasa activan la vía NF-kappa B, lo que conduce a la proliferación celular a través de MYC y la activación de IKK, respectivamente [33]. Las implicaciones clínicas de estos mecanismos aún no se han dilucidado.
NF-kappa B ha sido implicado en el desarrollo de resistencia a los fármacos en una amplia gama de células cancerosas. La inhibición de la activación de NF-kappa B reduce la quimiorresistencia en líneas celulares de cáncer gástrico y colorrectal, que es consistente con nuestros resultados actuales [6], [32], [37], [38]. La activación constitutiva de NF-kappa B se ha sugerido como un posible factor pronóstico en el cáncer gástrico [39], [40], [41] y se correlaciona con la progresión y la quimioterapia resistencia de los carcinomas de colon [42], [43].
proteínas JNK tienen diversas funciones en la proliferación celular y en la inducción de apoptosis a través de vías de la proteína quinasa activadas por estrés, y a menudo son regulados hacia abajo en tipos de cáncer [44], [45]. En el presente estudio, el papel de JNK en el contexto de la respuesta de 5-FU parece ser pasivo con respecto a la quimiosensibilidad, de acuerdo con nuestro experimento siRNA. El análisis inmunohistoquímico en este estudio mostró que el NF-kappa B y JNK eran indicadores recíprocos de pronóstico. Sin embargo, desmontables de NF-kB sensibilizado 5-FU, mientras que JNK no tenía células resistentes a 5-FU. la activación de NF-kappa B por TNF-α está estrechamente regulada por JNK en el contexto de una respuesta proinflamatoria, que se produce inmediatamente después de la estimulación [46], [47], [48], [49]. Por otra parte, la activación de NF-kB en malignidad o quimiorresistencia parece ser constitutiva en una parte del tumor gastrointestinal progresión [47], [50]. En el presente estudio, aunque NF-kB tinción nuclear fue visto sólo en una pequeña fracción de las células tumorales, JNK se tiñó relativamente ubicua en todo el tejido. Por lo tanto, nuestros resultados actuales pueden indicar que JNK tinción refleja un grado de fondo respuestas inflamatorias o de estrés crónico de la mucosa gástrica [51], mientras que la activación constitutiva de NF-kappa B se asocia con el potencial maligno de las células tumorales [39], [40] , [41], [52]. Además del potencial maligno intrínseca, nuestros resultados también demostraron que NF-kB juega un papel específico en la respuesta de 5-FU. Tomados en conjunto, aunque se requiere una mayor investigación clínica, NF-kB expresión nuclear puede ser un buen candidato como marcador de predicción de la quimiosensibilidad 5-FU, mientras que la JNK puede ser un marcador de apoyo que refleja los antecedentes de la mucosa.
Aunque el resultado actual es aún preliminar desde un punto de vista práctico, estos resultados pueden proporcionar una oportunidad para los regímenes alternativos a considerar para los casos que indican una baja probabilidad de una respuesta quimioterapéutico basado en 5-FU. Un estudio inmunohistoquímico más amplio que incluye NF-kB /JNK análisis será necesario probar la utilidad en el cáncer gástrico y colorrectal.
Apoyo a la Información
Figura S1.
flujo de Quimiosensibilidad marcador de identificación. (A) Sobre la base de un ensayo de quimiosensibilidad de un panel de línea celular de cáncer, el A (actividad) × C (células) = matriz de CA fue creado. La izquierda dos paneles muestran las curvas de crecimiento de células sobre la base de la concentración del fármaco. El panel central muestra la inhibición del crecimiento del 50% los valores (GI
50) en un gráfico de barras. Todos los datos se centran por concentración plasmática máxima (PPC) los valores que son únicos para cada medicamento. El panel de la derecha representa el GI
50 valores y las células en un mapa de calor con un formato de agrupación jerárquica. (B) "fase inversa" microarray de proteínas de lisado (izquierda) y C (células) × P (proteína) = matriz de CP en un mapa de calor con un formato de agrupación jerárquica (derecha). (C) Un mapa de calor con la representación de la agrupación jerárquica de la matriz de AP, que se genera a partir de CA y matrices CP. El dendrograma indica la distancia basado en el coeficiente de correlación del conjunto de datos junto a la otra. Por lo tanto, la matriz de AP muestra la correlación entre la expresión de la proteína y la eficacia del fármaco a través de todas las líneas celulares. Citado con permiso de referencia#2
doi:. 10.1371 /journal.pone.0043236.s001 gratis (TIF)
figura S2.
Correlación entre proteínas candidatas y sensibilidad a los fármacos. Izquierda: diagrama de dispersión basa en la sensibilidad a 5-FU y la expresión de NF-kB. El coeficiente de correlación es positiva, pero es negativo (
r = -0,304
) cuando se analizaron las líneas de células gastrointestinales (CW2, HCT116, GSS, KATOIII, MKN45, huG1-PI, y KE39), lo cual es consistente con el resultado de la validación del TMA. Derecha: diagrama de dispersión basa en la sensibilidad y la expresión de JNK 5-FU. Ha sido bien aceptado que las herramientas de detección, tales como las técnicas basadas en microarrays, pueden descubrir biomarcadores útiles, pero también se pueden aislar los falsos positivos.