Extracto
El cáncer de páncreas se ha encontrado con la expresión anormal o mutación en las proteínas Ras. activación oncogénica Ras explota su amplio alcance de señalización para afectar a múltiples procesos celulares, en el que la señalización activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK) ejerce un papel importante en la tumorigénesis. Ras terapias dirigidas son por lo tanto de gran beneficio para el cáncer de páncreas. Aunque pequeña molécula APY606 ha sido recogido con éxito por la detección de drogas virtual basada en receptor diana Ras, su mecanismo en profundidad que queda por esclarecer. En esta revisión se evaluó la actividad antitumoral de APY606 contra cáncer pancreático Capan-1 y células SW1990 líneas humanos y exploramos el efecto de Ras-MAPK y la vía de señalización relacionada con la apoptosis sobre la actividad de APY606. tratamiento APY606 resultó en una inhibición de la dosis y dependiente del tiempo de la viabilidad de células de cáncer. Además, APY606 exhibió una fuerte actividad antitumoral, como se evidencia no sólo por la reducción de invasión de células tumorales, migración y potencial de membrana mitocondrial, sino también por la alteración en varios índices de apoptosis. Ras-GTP Además, el tratamiento APY606 directamente inhibida y la activación de abajo de la MAPK, que dio lugar a la baja regulación de la proteína anti-apoptótica Bcl-2, lo que lleva a la sobre regulación de las proteínas relacionadas con la vía de la apoptosis mitocondrial (Bax, citocromo citosólica
c
y caspasa 3) y de CDK2 y ciclina a, E. Estos datos sugieren que alterar la señalización de Ras-MAPK es un nuevo mecanismo de acción para APY606 durante la intervención terapéutica en el cáncer de páncreas.
Visto: Guo N, Z Liu, Zhao W, E Wang, Wang J (2016) de moléculas pequeñas APY606 Muestra una amplia actividad antitumoral en cáncer de páncreas a través de menoscabe en Ras-MAPK señalización. PLoS ONE 11 (5): e0155874. doi: 10.1371 /journal.pone.0155874
Editor: Hiroyasu Nakano, Escuela de Medicina de la Universidad de Toho, Japón
Recibido: 29 Marzo de 2016; Aceptado: 5 Mayo de 2016; Publicado: 25 de mayo de 2016
Derechos de Autor © 2016 Guo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
financiación:. los autores desean agradecer a las siguientes fuentes de financiación que apoyaron esta investigación: Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81573448, 11174105, 91227114 y 91430217), la Fundación Nacional de Ciencia (MCB- 0947767) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jilin (20150101009JC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es una enfermedad mortal, debido a la clasificación de adenocarcinoma ductal pancreático el cuarto lugar entre las muertes relacionadas con el cáncer [1]. La naturaleza de este tumor se caracteriza por un mal resultado para todos los estadios de la enfermedad y sólo 1-4% de los pacientes con cáncer de páncreas todavía están vivos a los 5 años desde el diagnóstico [2]. Varios regímenes de tratamiento no mejoraron significativamente la supervivencia de los pacientes [3,4]. El fracaso de la quimioterapia en el cáncer de páncreas es debido principalmente a la resistencia a múltiples fármacos y las reacciones adversas limitantes de la dosis. Hasta la fecha, no está claro cómo intracelular vías de señalización conducen a las propiedades biológicas aberrantes en el cáncer de páncreas. Por otra parte, sigue siendo poco conocida acerca de cómo las inhibiciones farmacológicas de determinadas vías de señalización mejorar la respuesta de las células de cáncer de páncreas a la quimioterapia convencional [5]. Por lo tanto, los futuros esfuerzos hacia el desarrollo de la nueva terapia para mejorar la supervivencia y la calidad de vida de los pacientes con cáncer de páncreas deben incluir nueva estrategia para explorar fármacos anticancerígenos eficaces [6].
proteínas Ras son componentes clave de regulación que implican en condiciones normales el crecimiento celular, la diferenciación y la transformación maligna [7]. Se ha estimado que casi 90% de los cánceres pancreáticos se han encontrado con la expresión anormal o mutación en Ras proteínas [8]. activación oncogénica Ras explota su amplio alcance de señalización para afectar a múltiples procesos celulares, incluyendo la supresión de la apoptosis y la promoción de la proliferación [9]. La muerte celular programada, o apoptosis, es un proceso fisiológico normal por el que célula individual muere y se elimina de una población dada. La muerte celular apoptótica iniciado intrínsecamente a través de las funciones de la vía mediada por mitocondria como un mecanismo de defensa crucial contra malignidad, y la corrupción de la maquinaria apoptótica es una firma que define a las células del cáncer [10]. la erosión oncogénicas Ras-accionada de la vía apoptótica y su contribución a los cánceres han sido bien documentado [11]. Entre las cascadas de señalización corriente abajo de Ras, la mitogen-activated proteína quinasa (MAPK) en cascada se ha reportado que juegan un papel importante en el desarrollo de cánceres [12-14]. Uno de los principales agentes, la vía de Ras-MAPK en una amplia variedad de células de mamíferos, es la regulación del ciclo celular transición [15]. Las señales de proliferación generados por Ras oncogénico culminan con la regulación de varios factores de transcripción que desencadenan la expresión de ciclinas que atribuyen a la activación de la vía de Ras-MAPK. Ras oncogénico puede promover la progresión del ciclo celular mediante la inhibición de quinasas dependientes de ciclina (CDKs). El efecto supresor está mediada por múltiples vías efectoras de Ras incluyendo la vía de Ras-MAPK [16,17]. Con nuestro entendimiento, la contribución de Ras oncogénico de estos procesos será sin dudas una buena posibilidad de la investigación del cáncer en el futuro próximo.
Es bien conocido que las moléculas pequeñas tienen un papel vital en la quimioterapia del cáncer. Un inhibidor de molécula pequeña, APY606, fue recogido por la detección de drogas virtuales en función de Ras se dirigen a los receptores en nuestro trabajo reciente [18]. Sin embargo, su mecanismo subyacente de propiedades contra el cáncer es poco conocida. A continuación, se llevaron a cabo las investigaciones en profundidad para evaluar su carácter de lucha contra el cáncer contra cáncer pancreático Capan-1 y células SW1990 líneas. Estos resultados muestran que la apoptosis inducida por APY606 se atribuye a la activación de la vía apoptótica intrínseca mitocondrial y la prevención de la cascada de la vía de Ras-MAPK. En paralelo, APY606 Se encontró además de inducir la detención en la fase S y ralentizar la metástasis en las dos líneas celulares por alterar la activación de Ras. En consecuencia, nuestra investigación sentará las bases para el descubrimiento de fármacos dirigidos Ras y para APY606 aplicación terapéutica en el cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Productos químicos y reactivos
medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), L-15 medio de cultivo celular y de suero bovino fetal (FBS) se obtuvieron de Gibco (Grand Island, NY). Todos los demás reactivos fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO). APY606 fue amablemente proporcionar por el NCI /DTP abierto Química de la UAB (http://dtp.cancer.gov) y luego confirmada por HPLC y ESI-MS. Los anticuerpos primarios contra la caspasa-3 humana, caspasa-9, el citocromo
c
, Bcl-2, Bax, c-Raf, ERK, Perk, MEK, pMEK, ciclina A, ciclina E y CDK2 se adquirieron de Santa Cruz y BD Bioscience, respectivamente. Los anticuerpos contra GAPDH humana y β-actina se obtuvieron de Santa Cruz.
Líneas celulares y cultivo celular
cáncer pancreático Capan-1 y células SW1990 líneas Humanos se obtuvieron del Banco de Células de Tipo Culture Collection Academia de Ciencias de china (Shanghai, china) y se cultivaron en DMEM y L-15 medio que contiene 10% de SFB, 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina, respectivamente. Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2 incubadora. En el proceso de cultivo celular, no había ningún efecto de micoplasmas en las dos líneas celulares, lo que fue confirmado por una prueba de tinción de ADN fluorocromo. APY606 se disolvió en DMSO (dimetil sulfóxido), y recién diluido a la concentración deseada con agua doblemente destilada inmediatamente antes del uso. La concentración final de DMSO en el medio de cultivo es 0,1% (v /v). Las células de control recibieron el vehículo que consta de agua doblemente destilada que contiene 0,1% de DMSO solamente, que no afecta significativamente las células.
Crecimiento ensayo de inhibición
El Recuento celular Kit-8 (CCK-8 ) (Dojindo, Japón) ensayo se realizó para examinar el efecto de APY606 sobre la citotoxicidad. Brevemente, las líneas de Capan-1 y SW1990 de células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10
4 células /pocillo en un volumen de 100 mL. Después de la incubación durante la noche, las células se trataron por varias concentraciones de APY606 durante 24 h y 48 h, respectivamente. Las células fueron expuestas a 10 l CCK-8 de reactivo para 3 h; la densidad óptica a 450 nm se leyó con un lector automático M200 PRO NanoQuant (TECAN, Suiza). En este ensayo, CCK-8 no interfiere con APY606 y causar una respuesta positiva. Las mediciones se llevaron a cabo al menos cinco veces.
Colonia ensayo de formación de
Para probar la supervivencia de las células tratadas con APY606, Capan-1 y líneas de células SW1990 fueron sembradas en placas de 24 pocillos ( 200-300 células por pocillo) y se dejaron adherir durante 24 h. Las células se incubaron en medio de cultivo que contiene APY606 con las concentraciones de 2, 4, 6, 8 y 10 mg /ml durante 6 días. Después de eso, las células se fijaron con metanol y se tiñeron con Giemsa al 5% y las colonias (más de 50 células) fueron contados bajo un microscopio invertido (AMG EVOS, Vida).
tinción nuclear ensayo
APY606 condensación nuclear y la inducida por cambios morfológicos fueron detectados utilizando DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol). líneas de células Capan-1 y SW1990 (5 × 10
6 células por placa) se cultivaron en placas con fondo de vidrio a 50% de confluencia y después se cultivaron en el medio en presencia de 6,25, 12,5 y 25,0 mg /ml APY606 para 24 h, respectivamente. Las células se fijaron con 3,5% de paraformaldehído y luego se incubaron en un fluido que contiene 2 mg /ml DAPI para 20 min. La morfología nuclear de las células se observó por microscopía de fluorescencia (AMG EVOS, Life).
La cuantificación de la apoptosis de células
A principios de la apoptosis, la fosfatidilserina (PTS) se transloca a la membrana celular externa y puede ser identificados mediante la unión de anexina V, un ligando para PTS. células SW1990 apoptótica Capan-1 y se cuantificaron utilizando el Anexina isotiocianato (FITC) kit de detección de apoptosis V-fluoresceína (Abcam, UK) después de las células se trataron con APY606 a diferentes concentraciones (6,25 y 12,5 mg /ml) durante 24 h. Brevemente, las células se trataron con tripsina y se lavaron dos veces con PBS frío, y luego se resuspendieron las células a una densidad de 1 × 10
6 células /ml en tampón de unión (HEPES 10 mM /NaOH, pH 7,4, NaCl 140 mM, 2,5 CaCl mM
2). Posteriormente, las células se incubaron con 5 l de anexina V-FITC y 5 l PI en la oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente y se sometieron a análisis de citometría de flujo (FACSAria, BD Biosciences). En total, 10.000 eventos se analizaron en cada muestra. El análisis de datos se realizó con el software de la diva 6,0 (BD Biosciences).
Medición del potencial de membrana mitocondrial Interrupción
potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) es una marca característica de la apoptosis en una ruta relacionada con la mitocondria . ΔΨm se puede medir usando la sonda fluorescente JC-1. Brevemente, las líneas de Capan-1 y SW1990 células se sembraron en placas de 6 pocillos (5 × 10
5 células por pocillo) y se trató con APY606 a una concentración de 6,25 y 12,5 mg /ml durante 24 h. Las células se lavaron con PBS y se incubaron en 500 l solución de trabajo JC-1 a 37 ° C en 5% de CO
2 para 20 min. Posteriormente, las células se resuspendieron en tampón de incubación 500 l, seguido de la visualización mediante microscopio confocal de barrido láser (CLSM, Leica, TCS SP2). JC-1 fue excitado por la luz láser de 488 nm y emisión fue capturado a 530 nm [19]. La disminución de la relación de la intensidad de fluorescencia roja /verde indica la pérdida de ΔΨm en células de cáncer.
Determinación de Ras-GTP
líneas de células Capan-1 y SW1990 se cultivaron en medio completo durante toda la noche, hambre durante 8 h en medio que contiene 1% de FBS y luego se trató durante 24 h con diversas concentraciones de APY606. Al final del tratamiento, las células fueron estimuladas con EGF (10 ng) durante 10 min. A partir de entonces, las células se lisaron y el lisado celular se procesan mediante un kit de ensayo de activación de Ras (Upstate, Millipore). El Ras total y las proteínas Ras activas se detectaron usando un ensayo de transferencia de Western como se describe a continuación.
Flow cuantificación por citometría de pERK
La cantidad de expresión de fosforilados quinasa regulada por señal extracelular (pERK) era una lectura de Ras-MAPK cascada vía. Para medir el grado de inhibición de ERK activación experimentalmente, análisis de citometría de flujo se utilizó para obtener la medición de una sola célula cuantitativa de la cantidad de pERK. Brevemente, las líneas de Capan-1 y SW1990 células se trataron con APY606 a una concentración de 6,25 y 12,5 mg /ml durante 24 h, después se fijaron y se permeabilizaron usando Cytofix /Cytoperm kit (Becton Dickinson, Mountain View). Después de la centrifugación, se añadió 0,05 g de anticuerpo por pocillo en 100 l mezcla de anticuerpos para un 488 conjugado anticuerpo Alexa Fluor ERK1 /2 (anti-fosfo-p44 /42 MAP quinasa, Thr202 /Tyr204, BD Bioscience) y se incubó durante 1 h en hielo . Después del lavado, las muestras se analizaron mediante fluorescencia clasificador celular activado FACSAria (BD Bioscience) y el porcentaje de células teñidas en cada cuadrante se cuantificó usando software Diva 6,0 (BD Bioscience). En total, 10.000 eventos se analizaron en cada muestra. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces.
ciclo celular análisis
Para probar la potente mecanismo para la inhibición del crecimiento celular inducida por APY606, el efecto del tratamiento APY606 sobre la distribución del ciclo celular fue explorada por el flujo de citometría. Brevemente, se sembraron líneas Capan-1 y SW1990 de células (1 × 10
6 células por pocillo en placa de 6 pocillos) y se trataron con APY606 a una concentración de 6,25 y 12,5 mg /ml durante 24 h, respectivamente. Las células se suspendieron, se fijaron en 70% (v /v) de etanol a 4 ° C durante la noche. Posteriormente, las células se lavaron y se resuspendieron en 1 ml de PBS que contiene 50 mg /ml PI y 1 mg /ml ARNasa A a temperatura ambiente en oscuridad durante 30 min. En total, se analizaron 10.000 acontecimientos inmediatamente en cada muestra por citómetro de flujo (FACSCalibur, BD Biosciences). Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces.
Cicatrización de heridas ensayo
Para explorar la influencia de APY606 en la capacidad de la motilidad de las células cancerosas, la herida ensayo de curación se llevó a cabo para evaluar la motilidad de las células de APY606 células tratadas. líneas de células Capan-1 y SW1990 se sembraron en placas de cultivo de 24 pocillos y luego anotó con una punta de micropipeta. El medio se reemplazó por 12,5 g /ml APY606 en el medio completo, y la migración celular se controló utilizando CLSM para 24 h. Las imágenes fueron capturadas, y la distancia cierre de la herida (en comparación con el control en 0 h) se midió en los sitios de tres independientes de heridas por grupo. la motilidad celular relativa se compara como la diferencia entre la anchura de la herida a las 0 h, a las 24 h.
Trans-pocillo de ensayo cámara de
Para examinar más a fondo el efecto de APY606 en la capacidad de invasión de las células cancerosas , ensayo de cámara de trans-así Matrigel se llevó a cabo. líneas Capan-1 y SW1990 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 × 10
5 células /pocillo y se cultivaron durante 24 h. Después las células se mueren de inanición durante 24 h, las células se trataron con 12,5 mg /ml APY606. A partir de entonces, se recogieron las células y 1 × 10
5 células diluidas con medio libre de suero se sembraron a unidades trans pocillos con filtros de policarbonato (Cambridge, MA) que contienen poros 8-M. La membrana de policarbonato se pre-recubierta con 250 mg /ml de Matrigel (BD Biosciences). Las cámaras inferiores se llenaron con 600 l de medio que contenía FBS al 5%. Después de 24 h, las células se fijaron en metanol y se tiñeron con naranja de acridina (AO, Dingguo, China). La superficie superior de la membrana se frotó suavemente con un bastoncillo de algodón, y las células que invaden a través de la membrana de los filtros se contaron en placas de cultivo de fondo de cristal, y las imágenes correspondientes a toda la superficie de la membrana fueron capturados por CLSM.
Western secante análisis
con el fin de aclarar los mecanismos subyacentes de la apoptosis celular inducida por APY606 y detención del ciclo celular a nivel molecular, se examinaron los análisis de transferencia de Western. líneas Capan-1 y células SW1990 se lavaron con PBS frío después de 24 h de tratamiento con APY606 a una concentración de 6,25 y 12,5 mg /ml. Después de las proteínas celulares se extrajeron y se cuantificaron, la misma cantidad de proteína se sometió a electroforesis en 10% de gel de SDS-PAGE y luego transferido sobre difluoruro de polivinilideno (PVDF) membrana (Millipore, Bedford, MA). A partir de entonces, la membrana PVDF se sondó con el anticuerpo primario indicado durante la noche a 4 ° C y se transfirió más con rábano picante apropiada anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa. La visualización se realizó con detector de quimioluminiscencia (DNR, Kiryat Anavim, Israel). nivel de proteína se normalizó el uso de GAPDH o β-actina como control interno.
El análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS 11.5 software estadístico.
Resultados
1. APY606 inhibe la proliferación de Capan-1 y líneas de células SW1990
Para explorar la inhibición del crecimiento potencial de APY606 en las dos líneas celulares de cáncer, los efectos inhibidores dependientes de la concentración de APY606 sobre el crecimiento de Capan-1 y SW1990 célula se evaluaron las líneas como se muestra en la figura 1A. Cuando las células Capan-1 se trataron con APY606 a una concentración de 12,5, 25,0 y 50,0 mg /ml durante 24 h, el porcentaje de inhibición del crecimiento sobre las células de control (100%) fue casi 21,0 ± 2,6%, 81,3 ± 0,5% y 93,3 ± 0,6%, respectivamente. En consecuencia, el porcentaje de células SW1990 inhibidos sobre las células de control (100%) fue 52,3 ± 1,5%, 82,3 ± 0,6% y 90,0 ± 1,0%, respectivamente. Cuando las células Capan-1 se trataron con APY606 en las mismas condiciones durante 48 h, el porcentaje de inhibición del crecimiento sobre las células de control (100%) fue de aproximadamente 50,0 ± 1,7%, 90,0% y 93,0%, respectivamente. Mientras tanto, el porcentaje de células SW1990 inhibidos sobre las células de control (100%) fue 71,7 ± 3,2%, 75,3 ± 1,5% y 87,3 ± 2,3%, respectivamente. El IC
50 valor para APY606 era 14,3 ± 1,3 mg /ml (24 h) y 9,5 ± 0,6 mg /ml (48 h) en las células Capan-1, así como 10,3 ± 1,1 mg /ml (24 h) y 6,8 ± 2,3 mg /ml (48 h) en las células SW1990, respectivamente. Además, también hemos estudiado el efecto de APY606 en la tasa de supervivencia de las células Capan-1 y células SW1990 líneas mediante el ensayo de formación de colonias. tratamiento APY606 resultó en una inhibición significativa de la formación de colonias en las dos líneas celulares en una manera dependiente de la dosis (Fig 1B). En conjunto, nuestros resultados indicaron que APY606 indujo efectos inhibidores dependientes de la concentración sobre el crecimiento y la supervivencia de las dos líneas celulares Capan-1 y SW1990.
Las células se trataron con las concentraciones indicadas de APY606 de 24 y 48 h y luego se evaluaron por CCK-8 (A) y el ensayo de formación de colonias (B), respectivamente. Los datos presentados son la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. imágenes tinción nuclear (C) fueron tomadas por el microscopio de fluorescencia con un 10 × objetivo. La barra de escala fue de 20 micras.
Además, la morfología nuclear de las células se detectó mediante DAPI que es un colorante fluorescente azul regiones ricas en A-T especialmente la unión en el ADN. DAPI puede pasar a través de una membrana celular intacta, por lo tanto se puede utilizar para teñir tanto las células vivas y fijos, a pesar de que pasa a través de la membrana con menos eficacia en las células vivas y por lo tanto la eficacia de la mancha es menor. La intensidad de la fluorescencia azul en Capan-1 y células SW1990 líneas tratados con APY606 a una concentración de 6,25, 12,5, y 25,0 mg /ml para 24 h fue más fuerte que en los grupos control tratados con vehículo como se muestra en la figura 1C. Por otra parte, es evidente que los núcleos condensados y fragmentados aumentaron con el tratamiento APY606 de una manera dependiente de la concentración.
2. APY606 induce la apoptosis de las células Capan-1 y células SW1990 líneas
Para evaluar el efecto inductor de apoptosis en las líneas de APY606 Capan-1 y SW1990 celulares, el número de células apoptóticas se cuantificó mediante análisis de citometría de flujo. Células teñidas positivo para anexina V-FITC y negativos para PI están experimentando apoptosis; células teñidas positiva tanto para anexina V-FITC y PI son o bien en la fase final de la apoptosis en proceso de necrosis o ya muerto; células teñidas negativa tanto para anexina V-FITC y PI están vivos sin someterse a la apoptosis [20]. Como se muestra en la figura 2A, el número de células apoptóticas fue insignificante (0,4 a 1,0%) en las células de control de las dos líneas de células tratadas con vehículo. Mientras que el porcentaje de células apoptóticas tempranas se aumentó a 21,3 ± 3,5% y 50,4 ± 5,5% después de células Capan-1 se trataron con APY606 a 6,25 y 12,5 mg /ml durante 24 h, respectivamente. Durante 48 h de tratamiento, los valores se incrementaron a 22,0 ± 2,3% y 54,4 ± 6,2%, respectivamente. Del mismo modo, en las mismas condiciones, los valores fueron de 23,4 ± 2,4% y 63,9 ± 7,2%, así como 49,9 ± 3,5% y 75,1 ± 6,3% después de las células SW1990 se expusieron a APY606 durante 24 h y 48 h, respectivamente. Los resultados mostraron claramente que APY606 indujo un tiempo y apoptosis dependiente de la concentración en Capan-1 y células SW1990 líneas.
Los porcentajes de poblaciones de células apoptóticas en las dos líneas de células tratadas con 6,25 y 12,5 mg /ml de APY606 durante 24 y 48 h se determinaron utilizando citómetro de flujo (a). Los datos presentados son la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Efecto del tratamiento APY606 en las proteínas relacionadas con la vía de apoptosis se midió usando análisis de transferencia de Western. Se muestran transferencias representativos de las proteínas respectivas (B). GAPDH se utilizó como control interno. (C):. Densidad relativa de proteína diana se cuantificó y se representa
Para investigar el mecanismo responsable de la apoptosis inducida por APY606, se evaluaron los niveles de Bax, Bcl-2, el citocromo citosólica
c
, y la activación de la caspasa-3 y caspasa-9 en Capan-1 y células SW1990 líneas tratados con APY606 a una concentración de 6,25 y 12,5 mg /ml para 24 h utilizando el análisis de transferencia Western. Los efectos del tratamiento APY606 en los niveles de expresión de la proteína pro-apoptótica Bax y la proteína anti-apoptótica se examinaron experimentalmente Bcl-2. El tratamiento de células aumentó significativamente el nivel de expresión de Bax pero disminuyó la de Bcl-2 de una manera dependiente de la concentración (Figura 2B). Citocromo
c
es uno de los mediadores centrales de la mitocondrial o vía apoptótica intrínseca. La liberación de citocromo
c
desde el espacio intermembrana mitocondrial es el evento temprano durante la muerte celular por apoptosis [21]. Como tal, los efectos del tratamiento APY606 sobre la liberación de citocromo
c
en las dos líneas celulares fueron evaluados. se observó la exposición de las células a APY606 para aumentar la liberación de citocromo
c
de las mitocondrias en el citosol de una manera dependiente de la concentración (Fig 2C). Tras la estimulación de apoptosis, el citocromo
c
liberados asociados con procaspasa-9 para formar un complejo procesamiento de la caspasa-9 de proenzima inactiva a su forma activa, con el tiempo de disparo de activación de la caspasa-3 y la apoptosis [21]. Como se muestra en la figura 2B y 2C, APY606 inducida por la activación notablemente dependiente de la concentración de la caspasa-3 y caspasa-9 y, finalmente llevó a la muerte apoptótica en líneas Capan-1 y SW1990 celulares.
3. APY606 induce ΔΨm
El agotamiento de ΔΨm es una respuesta temprana y esencialmente apoptótica a la terapia anti-cáncer. alteración mitocondrial inicia el proceso de apoptosis, que posteriormente conduce a la inhibición del crecimiento. Para explorar más a fondo el mecanismo de la apoptosis celular inducida por APY606, se determinó el efecto de APY606 en ΔΨm en Capan-1 y células SW1990 líneas. El colorante catiónico JC-1 es útil para detectar ΔΨm que ocurre en la etapa temprana de la apoptosis [22]. En las células vivas, JC-1 presenta acumulación dependiente de potencial en las mitocondrias que conduce a la formación dependiente de la concentración de fluorescencia roja J-agregados [23] que es indicativa de la presencia de mitocondrias polarizadas. En la despolarización, JC-1 monómero de unión con los resultados de membrana mitocondrial en la fluorescencia verde y una reducción en la tinción de color rojo anaranjado. Por lo tanto, la despolarización mitocondrial está indicada por una disminución en la relación de intensidad de fluorescencia roja /verde. La proporción de rojo a verde de fluorescencia depende sólo de la potencial de la membrana y no en otros factores tales como el tamaño mitocondrial, forma y densidad que puede influir en las señales de fluorescencia de un solo componente.
Aquí, el control y la APY606 tratos líneas de células Capan-1 y SW1990 teñidas con JC-1 fueron controlados por CLSM. Como se muestra en la figura 3, la formación de agregados J-rojo fluorescente se redujo significativamente en las dos líneas de células tratadas con 6,25 y 12,5 mg /ml APY606 en comparación con las células de control. En contraste, la fluorescencia verde se observó particularmente en células APY606 tratados debido a JC-1 monómero de unión. La proporción de verde a fluorescencia roja se incrementó en las células tratadas con APY606 de una manera dependiente de la concentración, lo que sugiere que el cambio de fluorescencia era indicativo de ΔΨm. No se observó pérdida de ΔΨm bajo tratamiento APY606, lo que sugiere que las mitocondrias son afectados principalmente al inicio del proceso de apoptosis.
El control y células tratadas con APY606 manchado de JC-1 fueron controlados por CLSM. La forma agregado J (fluorescencia roja) y J-monómero solo (fluorescencia verde) estaban emocionados con 568 y 480 nm, respectivamente. La barra de escala fue de 20 micras.
4. APY606 inhibe la vía de Ras-MAPK inducir una respuesta apoptótica
Con el objetivo de evaluar la estrategia terapéutica Ras posiblemente dirigida, examinamos primero la inhibición de la actividad de Ras-GTP en ensayo basado en células. En teoría, APY606 actuará para disminuir el nivel de actividad de Ras-GTP. Para dar cuenta de esta predicción, se evaluó el efecto de APY606 en las células de cáncer de páncreas usando el desplegable de ensayo Raf1RBD. Como se predijo, la extensión de la activación de Ras en suero de hambre Capan-1 y SW1990 se redujeron sustancialmente en presencia de APY606 de una manera dependiente de la dosis sin una disminución significativa en total nivel Ras (Fig 4).
células privadas de suero se trataron con vehículo o indicaron concentraciones de APY606 durante 24 h, y después se estimularon con EGF durante 10 min. APY606 atenúa la activación de Ras celular en Capan-1 (A) y líneas de células SW1990 (B). Unida a GTP Ras se aisló mediante desplegable ensayo y se detecta por RBD kit de activación de Ras-GTP. cantidad total de Ras se detectó mediante el anticuerpo específico anti-Ras. Densidad relativa de proteína diana se cuantificó y se representa.
quinasas
Raf son los más conocidos como reguladores clave de la cascada de Ras-MAPK, y el bloque de la vía de señalización de Ras-MAPK tiene un papel importante en la inducción de la apoptosis de células de cáncer [24]. Para comprobar el mecanismo subyacente de la inducción de la apoptosis, se evaluó el efecto de APY606 en la vía de Ras-MAPK en ambas líneas celulares Capan-1 y SW1990. Tratamiento de las dos líneas celulares con APY606 en 6,25 y 12,5 mg /ml durante 24 h disminuyó significativamente la fosforilación de MEK y ERK en comparación con las células de control (Fig 5A y 5B). Sin embargo, la exposición de las dos líneas celulares a APY606 no afectó a los niveles totales de MEK y ERK. En particular, el nivel de expresión de c-Raf se redujo significativamente con el aumento de concentración de APY606 en comparación con las células de control. Este resultado mostró que APY606 la apoptosis inducida por el bloqueo de las Ras-MAPK vía de señalización.
Se midieron
lisados celulares se analizaron en inmunotransferencia con anticuerpo primario respectivo seguido por el segundo anticuerpo y las transferencias representativas. GAPDH se utilizó como control interno. Densidad relativa de proteína diana se cuantificó y se representó gráficamente. detección de citometría de flujo de fosfo-ERK se realizó en ambas líneas Capan-1 y SW1990 de células (C). Los datos presentados son la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
En general, el grado de ventaja fue considerado como un indicador de la activación de Ras [25]. Basado en esto, se realizó simultáneamente un análisis de citometría de flujo para la obtención de la medición de una sola célula cuantitativo. Como se muestra en la figura 5C, APY606 causó producción de menos pERK en Capan-1 (76,7 ± 1,2%) y SW1990 (46,3 ± 2,6%) líneas celulares en 12,5 g de dosis /ml que lo hizo en las células de control tratadas con vehículo, respectivamente, en de acuerdo con la tendencia de los análisis de Western Blot.
5. APY606 detiene el ciclo celular en la fase S
Muchos agentes citotóxicos la detención del ciclo celular en G1, S o fase G2-M [26]. Para evaluar el mecanismo para la inhibición del crecimiento celular inducida por APY606, el efecto de APY606 sobre la distribución del ciclo celular se exploró primero cuantitativamente en Capan-1 y células SW1990 líneas utilizando análisis de citometría de flujo. El tratamiento de las dos líneas celulares con APY606 en 6,25 y 12,5 mg /ml durante 24 h notablemente afectó el número de células en G1 y S fases en una manera dependiente de la concentración, pero el número de células en la fase G2 señaladamente no se ha modificado en comparación a las células de control (Fig 6A). Después del tratamiento de las células Capan-1 con APY606 a 12,5 mg /ml, el número de células detenidas en la fase G1 era 62,83% en comparación con células de control; esto dio lugar a una disminución de 18,78% (p = 0,027). Al mismo tiempo, el porcentaje de células detenidas en la fase S fue 35,59%; esto dio un incremento del 18,09% (p = 0,043) en comparación con las células control tratados sólo con vehículo. Para la distribución de las células SW1990 en las fases G1 y S, la exposición de las células a APY606 dio lugar a un efecto más notable. El tratamiento de células SW1990 con APY606 a 12,5 mg /ml redujo significativamente el número de células detenidas en la fase G1 por 32,84% (p = 0,002) y aumentó el número de células en fase S por 33,57% (p = 0,042), respectivamente. Estos datos indicaron que APY606 resultó en la inhibición del crecimiento que provocó una acumulación prominente, prolongada de las células en la fase S y una reducción de las células en la fase G1 en ambas líneas celulares Capan-1 y SW1990.
Capan-1 y SW1990 líneas de células se trataron con las concentraciones indicadas de APY606 para 24 h. porcentajes representativos de poblaciones de células en G1, S y G2 fases del ciclo celular en las dos líneas celulares se analizaron por citometría de flujo (A). G1-S proteínas relacionadas con la transición se analizaron mediante ensayo de transferencia de Western (B). Similares experimentos se repitieron al menos tres veces con resultados similares, y se presentaron los borrones representativos. β-actina se utilizó como control interno. Densidad relativa de proteína diana se cuantificó y se representa (C).
progresión del ciclo celular está estrechamente regulada por las ciclinas y CDK. Las expresiones reducidas de ciclina A, ciclina E y CDK2 son las características de la detención del ciclo celular en la fase S. Con el fin de examinar cualitativamente el mecanismo para la detención del ciclo celular inducida por APY606, discutimos el efecto del tratamiento APY606 en los niveles de expresión de la ciclina A, ciclina E y CDK2 en Capan-1 y células SW1990 líneas usando el ensayo de Western Blot.