Extracto
Splicing alternativo implica la selección exón diferencial de un transcrito de gen para generar ARNm y isoformas de la proteína con diversidad estructural y funcional. Abnormal splicing alternativo se ha demostrado que se asocia con fenotipos malignos de células cancerosas, tales como quimio-resistencia y la actividad invasiva. La detección de pequeñas moléculas y fármacos para la modulación de empalme de ARN en la línea celular de carcinoma hepatocelular humano Huh-7, descubrimos que la amilorida, distinto de cuatro análogos de amilorida pH que afecta, podría "normalizar" el empalme de
BCL-X, HIPK3
y
RON /MISTR1
transcripciones. Nuestros análisis proteómicos de las células tratadas con amilorida detectaron hipo-fosforilación del factor de empalme SF2 /ASF, y la disminución de los niveles de SRp20 y dos proteínas SR no-identificados. Asimismo, observó disminución de la fosforilación de AKT, ERK1 /2 y PP1, y aumento de la fosforilación de p38 y JNK, lo que sugiere que el tratamiento con amilorida down-regula las quinasas y fosfatasas hasta regula en las vías de señales que se sabe afectan empalme de fosforilación de la proteína factor. Estos efectos amilorida de "normalizado" oncogénico empalme de ARN y factor de empalme hipo-fosforilación fueron abrogadas por tanto pre-tratamiento con un inhibidor de PP1. exón matriz mundial de células Huh-7 tratadas con amilorida detecta patrón de empalme cambios relativos a 584 exones en 551 transcripciones de genes, muchos de los cuales codifican proteínas que juegan un papel clave en el transporte de iones, formación de la matriz celular, la remodelación del citoesqueleto, y el mantenimiento del genoma. análisis funcionales celulares revelaron posterior invasión y defectos de la migración, la interrupción del ciclo celular, la citocinesis deterioro y la degradación del ADN letal en las células Huh-7 tratadas con amilorida. Otro tumor humano sólido y las células leucémicas, pero no pocas células normales, mostraron similares a amilorida alterado de empalme de ARN con consecuencia desvitalizado. Por tanto, este estudio proporciona bases mecanicistas para la explotación de pequeña modulación molécula de RNA splicing para la terapéutica del cáncer
Visto:. Chang J-G, Yang D-M, Chang W-H, Chow L-P, Chan W-L, Lin H-H, et al. (2011) de moléculas pequeñas de ARN oncogénico amilorida Modula alternativa que empalma con el cáncer humano devitalize células. PLoS ONE 6 (6): e18643. doi: 10.1371 /journal.pone.0018643
Editor: John D. Minna, Univesity de Texas Southwestern Medical Center en Dallas, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Octubre 2010; Aceptado: 11 de marzo de 2011; Publicado: 9 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Chang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo La investigación fue apoyada por otorga NSC-95-2320-B-037-049 (JGC), NSC 95-2311-B-009-004-MY3 (HDH) y NSC 97-2627-B-009-007 (HDH) a partir de el Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán y por DOH95-B-11-TM007 (WKY) y DOH96-TD-I-111-TM003 (WKY) del Departamento de Salud de Taiwán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
complejidad del proteoma se expande por splicing alternativo (AS), un proceso que implica la inclusión del exón diferencial o la exclusión de las mismas moléculas pre-ARNm para producir diversas isoformas de ARNm y proteínas [1], [2]. El proceso de AS es controlado por dos familias de proteínas altamente conservadas: repeticiones de arginina /serina dipéptidos (SR) relacionados con las proteínas y ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNP) relacionados con las proteínas [3], [4]. proteínas SR contienen una estructura bipartita modular que incluye uno o dos motivos de reconocimiento de ARN en el extremo N-terminal y un dominio RS ricos en repeticiones de dipéptidos arginina /serina en el extremo C-terminal [5], [6]. La función de los motivos N-terminal en las proteínas SR implica secuencia específica de unión a exhancers exonic empalme. El dominio C-terminal RS sirve como un dominio de activación general para el empalme mediante la vinculación a un heterogéneo de unión de ARN motivo [6]. AR proteínas regulan la selección de sitios AS, que divergen de los sitios de empalme canónicos, por lo tanto, promover la inclusión o exclusión de exones alternativos. Por otro lado, algunos hnRNPs, como hnRNPA1, puede antagonizar la función como de proteínas SR mediante la unión a elementos de empalme silenciador exonic [7].
AS, por lo tanto regula la expresión génica mediante la generación de isoformas de proteínas discretas que participan en distinta funciones de eventos celulares, tales como apoptosis, la determinación del sexo, guía de axones, excitación de la celda, y la contracción celular [8], [9]. AS también desempeña un papel fundamental en el desarrollo de trastornos hereditarios humanos y cáncer [10], [11], [12], [13], [14]. Aberrante AS de proto-oncogenes y /o genes supresores de tumores puede contribuir a fenotipos malignos celulares, tales como la resistencia a la apoptosis, la promoción de la invasión y la metástasis, y la estimulación de la angiogénesis del tumor [11] [12], [13], [14, ]. Postulando que la modulación de estos genes relacionados con el cáncer podría tener un profundo impacto en sus actividades patógenas, hemos estado buscando pequeñas moléculas o fármacos con efectos sobre la modulación de AS. En este estudio, hemos encontrado que la amilorida, un diurético bien conocido, puede alterar oncogénico AS en el carcinoma hepatocelular humano Huh-7 células, así como en varios otros líneas de cáncer humano y de células leucémicas, y por lo tanto explorar los mecanismos moleculares y celulares subyacentes para posibles implicaciones terapéuticas.
Resultados
amilorida "normaliza" el ARN isoforma de empalme de
BCL-X, HIPK3
y
RON /MISTR1
Huh -7 células
recientemente se ha vuelto evidente que desequilibrada empalme de ARN de ciertos genes se asocia con propiedades malignas de las células cancerosas humanas [11], [12], [13], por ejemplo, la resistencia a la quimioterapia y la radioterapia con
BCL-X, estado
onco-desarrollo indiferenciada con
HIPK3, España y los potenciales metastásicos invasivos con
RON /MISTR1
. En el carcinoma hepatocelular células Huh-7,
BCL-X
alternativa, se longitudinalmente en anti-apoptótica gran isoforma ARN,
BCL-XL, España más de pro-apoptótica pequeña isoforma ARN,
BCL-XS
[15];
HIPK3
se empalma en el exón 11 excluidos de U (-), así como el exón 11 incluido-U (+) para la interacción con las isoformas de Fas /FADD para modular la apoptosis en el proceso de desarrollo [16]; y
RON /MISTR1
está empalmado en 5 kb de longitud completa (
flRON
) ARN y 2-kb exón 11-excluidos
RON gratis (
sfRON
) isoformas de ARN, el último de los cuales se ha correlacionado con transición epitelial a mesenquimal en la invasión de células de cáncer y la metástasis [17], [18]. Después de analizar más de 500 pequeñas moléculas y medicamentos, incluidos los de uso clínico, se encontró que la amilorida ejerce un potente efecto sobre el AS de estas transcripciones de genes (Figura 1A). Huh-7 células tratadas con amilorida mostraron: (a) disminución relativa de
BCL-XL Opiniones y aumento de
BCL-XS isoformas
de ARN; (B) el mantenimiento relativo de
HIPK3 sobre U (-) y disminución de
HIPK3 sobre U (+) isoformas; y (c) disminución de tanto el exón 11 (+)
flRON
y el exón 11 (-)
isoformas sfRON
ARN. Tales efectos de la amilorida eran de la dosis y dependiente del tiempo, siendo detectable por 2 horas y marcadas después de 24 horas de incubación con 0,5 mM de amilorida. Estas observaciones sugirieron una mayor utilización de la alternativa sitio de empalme 5 'aguas arriba del exón 2 de
BCL-X
, aumento exón 11 (T) la exclusión de
HIPK3
, y la disminución de los complejos formados por corte y empalme producción tanto de
RON /MISTR1
exón 11 (+) y el exón 11 (-) isoformas. Por lo tanto, amilorida podría modular el AS de estos tres transcripciones de genes hacia modelos menos malignos "normalizados", similares a las normales en los informes anteriores [15], [16], [17], [18].
se extrajo ARN de Huh-7 células expuestas a medio de crecimiento que contiene otros derivados modulador amilorida pHi amilorida o y examinados para el ARN oncogénico splicing alternativo por RT-PCR, como se describe en Materiales y Métodos. Panel (A) muestra que la amilorida aumentó el uso de alternativa sitio de empalme 5 'aguas arriba en el exón 2 que produce la apoptosis isoforma BCL-XS (fila superior), aumentó el exón 11 (U exón) omitiendo de HIPK3 que aumenta la isoforma apoptótica (fila central), y aumentó ligeramente la omisión de exón 11 de RON a una concentración de 0,5 mM (fila inferior). Panel (B) muestra que los patrones de corte y empalme de los genes probados no se vieron afectados significativamente por cuatro derivados de amilorida, incluyendo 5- (N-etil-N-isopropil) -amiloride o EIPA; 5- (N-metil-N-isobutil) amilorida o MIBA; 5- (N, N-dimetil) amilorida o DMA; y 5- (N, N-hexametilen) amilorida o HMA, a concentraciones equivalentes de modulación Phi.
Debido a la amilorida es un prototipo de pH intracelular (pHi) modulador de drogas, hemos examinado cuatro derivados amilorida al equivalente o mayor phi-influirá en las dosis. Hemos observado que estos derivados no indujo efectos similares "normalizando" en la
BCL-X
,
HIPK3, España y
RON /MISTR1
como patrones en las células Huh-7 (Figura 1B). Por el contrario, en un estudio anterior [19] Observamos que, 5- (N-ehyl-N-isopropil) amilorida (EIPA), pero no modulada amilorida AS por la disminución de la exclusión exon7 patógena de
SMN2
transcripciones de hereditaria células atrofia muscular espinal. Estas observaciones paradójicas demuestran la complejidad de los mecanismos de AS y también sugieren que la selección del sitio de empalme en X-BCL
,
HIPK3, España y
RON /MISTR1
transcripciones
en amiloride- tratados Huh-7 células está mediada a través del mecanismo de empalme específico de la célula (s) en lugar de cambio de pH simplemente intracelular.
detección proteómico de factor de empalme principalmente hipo-fosforilados SF2 /ASF en el citoplasma y núcleo de amilorida tratados células
a medida que el estado de fosforilación de las proteínas componentes SR en la forma de complejos se sabe que afectan a la interacción proteína-proteína para la función de empalme, a continuación utiliza electroforesis en gel 2D para analizar la expresión diferencial de proteínas serina fosforilada. Hemos encontrado más de diez proteínas con cambios cuantitativos después del tratamiento amilorida (Figura 2). La elección de siete de estos puntos de proteínas para la identificación proteómico mediante espectrometría de masas (Tabla 1), encontramos uno de ellos para ser ASF /SF2, un factor de empalme se sabe están involucrados en la EA de la
RON Versión taquigráfica [20] . Para verificar este hallazgo, se realizó transferencias Western de ASF /SF2 y se encontró marcadamente reducida ASF /SF2 fosforilación tanto en el citoplasma y núcleo de células Huh-7 tratadas con amilorida (Figura 3A). Análisis de otros constituyentes de proteínas de los complejos de corte y empalme (tales como SRp20, hnRNPA1, hnRNPA2 /B1, Sam68 y proteínas SR comunes) mostró que SRp20 y dos proteínas SR fosforilados un-identificado también se redujeron en el citoplasma y en el núcleo después del tratamiento amilorida (figura 3B). Estos resultados implican que la amilorida modula los de
BCL-X
,
HIPK3, España y
RON /MISTR1
través de hipo-fosforilación de ASF /SF2 y la disminución de la expresión de SRp20 y algunas otras proteínas SR.
análisis de electroforesis en gel 2D de proteínas extraídas de células Huh-7 sin (izquierda) y con (derecha) de tratamiento amilorida 0,5 mM durante 24 horas mostraron cambios significativos durante al menos diez puntos, de los cuales siete (indicado por flechas) se aislaron para análisis de espectrometría de nano-LC-MS /MS y la identificación de proteínas, como se muestra en la Tabla 1.
análisis de transferencia Western de fracciones subcelulares de células Huh-7 con y sin amilorida tratamiento de 24 horas 0,5 mM se llevó a cabo utilizando anticuerpos específicos contra varios factores proteicos de empalme y β-tubulina. (Panel A) El tratamiento se incrementó amilorida las formas de SF2 /ASF desfosforilado en ambas fracciones citoplasmáticas y nucleares. (Panel B) El tratamiento amilorida disminuyó la expresión de SRp20 y dos proteínas fosforiladas SR-ONU identificado en C (citoplasmática) y N (nuclear) fracciones celulares.
amilorida regula a la baja fosforilación de AKT quinasa y fosfatasa PP1
los estudios recientes han demostrado que la amilorida inhibe la fosforilación de las quinasas y fosfatasas asociadas con la vía PI3K-AKT [21], [22], [23], y que AKT quinasa y PP1 fosfatasa puede regular la actividad de las proteínas SR [23], [24], [25], [26], [27], [28]. por lo tanto, a fin de determinar los efectos de amilorida sobre las formas fosforiladas de Akt quinasa y fosfatasas relacionadas en células Huh-7. La disminución de los niveles de la Ser (473) p-AKT y la Thr (320) p-PP1 se observó en el citoplasma y el núcleo, lo que sugiere la inhibición de la actividad de la quinasa AKT y activación de la actividad de la fosfatasa PP1 (Figura 4A). Para determinar si la inactivación de Akt quinasa per se tendría un papel en la regulación del corte y empalme alternativo, las células Huh7 fueron tratados con inhibidores de la vía PI3K-AKT, incluyendo LY294002, wortmanina y triciribina; 1 M triciribina pero no LY294002 o wortmanina disminuyó el nivel de p-Akt. Sin embargo, a esta concentración triciribina ejerció ningún efecto sobre el splicing alternativo de
BCL-X
y
HIPK3
transcripciones (Figura S1). Curiosamente, el tratamiento previo de las células con ácido okadaico para inhibir la actividad de la fosfatasa PP1 abrogó los efectos de la amilorida sobre
BCL-X
y
HIPK3
empalme, así como los efectos de la amilorida sobre la desfosforilación de SF2 /ASF y la disminución del nivel SRp20, pero el ácido okadaico ejercido ningún efecto definitivo en la expresión de hnRNP A1 y hnRNP A2B1 (Figura 4B). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que PP1 juega un papel importante en la modulación de la fosforilación de factores de empalme SR y por lo tanto la modulación de oncogénico AS en células Huh-7 después del tratamiento amilorida.
(Panel A). Las transferencias Western muestran una disminución significativa de p-Akt citoplasmática, nuclear p-Akt y nuclear p-PP1 en las células Huh-7 tratadas con amilorida a 0,3 mm y superiores. (Panel B) RT-PCR y Western Blot análisis muestran que el tratamiento previo con un inhibidor de PP1, ácido okadaico, abrogó los efectos amilorida en el BCL-X y HIPK3 ARN oncogénico de empalme, la fosforilación de ASF2 /factor de empalme ASF y el nivel de SRp20 en células Huh-7.
detección de exón-array de todo el genoma de una alteración en el empalme de ARN de muchos genes funcionales en las células tratadas con amilorida
es posible que los efectos de amilorida sobre la fosforilación y localización intracelular de los factores de empalme y la exportación de ARNm [29] podría afectar el empalme de otras transcripciones de genes, además de
BCL-X, HIPK3
y
RON /MISTR1
. Utilizando los chips de genes de matriz (Affymetrix GeneChip ® Human exón 1,0 ST Matriz de & gt; 518000 exones de los genes 42974) para el análisis exón matriz (conjunto de parámetros coeficiente de correlación ≥ 0,7, índice de empalme ≤-1.585, y también la sesión
2 relación ≤- 1.585), encontramos que la amilorida influyó en los patrones de empalme de 551 genes que participen al menos 584 exones, que incluían 495 genes codificadores de proteínas conocidas que implican 526 exones (Tabla S1; MIAME número de acceso#GSE24581). Estos 495 genes codificadores de proteínas conocidas se pueden clasificar en categorías funcionales que implican la remodelación del citoesqueleto, la adhesión celular, el transporte iónico, factores de transcripción, respuesta inmune, y la contracción muscular (Figura 5A-C y el cuadro S2). Para verificar estos resultados exón serie, se seleccionaron siete (
APF-1, CRK, Mbnl2, MIZF, WAC, PAPDS
y
survivina
) para el análisis por RT-PCR y de hecho confirmó distinta AS alteraciones en el patrón de estas transcripciones de genes en las células tratadas con amilorida (Figura 5D).
análisis bioinformático de las 495 transcripciones de genes con splicing alternativo a amilorida modificado, detectados por las mediciones exón-array en todo el genoma, se realizaron de acuerdo de genes ontología categorías de procesos biológicos (a), la función molecular (B) y celular componente (C). Amilorida modifican, con patrones de
APAF1, CRK, Mbnl2, MIZF, WAC, PAPD5
y
SU
R
Vivin
transcripciones específicas de genes que codifican proteínas detectado por el exon- matriz de análisis fueron validados por RT-PCR de ARN empalmados isoformas (Panel D) guía empresas
a niveles detallados ontología de genes (GO), las transcripciones de ARN que muestran amilorida afectadas como incluido: a.). 4 de 5 genes (80,0%) de "actividad motora microfilamentos" (GO 0.000.146) y 28/132 (21,2%) de los genes de "actividad motora" (GO 0.003.774); segundo). 5 de 7 (71,4%) de "catión: actividad cloruro symporter" (GO 0.015.377), 5/18 (27,8%) de "symporter anión-catión" (GO 0.015.296), 3/10 (30,0%) de "sódico potásico el intercambio de ATPasa "(GO 0.005.391), y 2/8 (25,0%) de la actividad de intercambio de anión inorgánico" (GO 0.005.452); do). 2 de la actividad de la sintasa de óxido nitric- 3 (66,7%) (GO 0.004.517); d) 16/29 genes (62,1%) de "matriz extracelular constituyente estructural que confiere resistencia a la tracción" (GO 0.030.020), 38/346 genes (11,0%) de "unión a proteínas del citoesqueleto" (GO 0.030.020), 2/7 (28,6% ) de colágeno de unión (GO 0.005.518); 2/8 (25,0%) de "miosina vinculante" (GO 0.017.022), y otros. De 213 genes relacionados con la apoptosis, 6 (
CCAR1, EP3000, KIAA1967, PRKDC, y PRPF8
) mostró alterada por splicing alternativo amilorida. De 608 genes relacionados con el cáncer, incluyendo 32
RON /MISTR1, cajeros automáticos gratis (teleangiectasis mutado de la ataxia) y
FANCM gratis (Fanconi anemia proteína M) se vieron afectados por la amilorida. Como
ATM
juega un papel importante en la reparación del daño en el ADN, mientras que
FANCM
está implicado en el ensamblaje de complejos de proteínas Fanc que mantienen la integridad del genoma y la estabilidad [30], modifican, de estas dos transcripciones de genes por amilorida puede resultar en la degradación de la cromatina, que se han verificado en nuestros experimentos posteriores. Sin embargo,
RON /MISTR1
, pero no
BCL-X
y
HIPK3
, fue uno de los 495 genes detectados tener amilorida alterado los patrones de empalme de exón serie de análisis, presumiblemente debido a los estrictos criterios cuantitativos establecidos, y /o secuencias de corte y empalme cortos de
BCL-X
.
el uso de secuencias de nucleótidos consenso conocidas de empalme elementos reguladores, se identificaron más posible potenciador de empalme y el silenciador elementos en el exón de empalme alternativo, flanqueante 5 'del intrón y 3' que flanquean las regiones de intrones de los 495 genes afectados por la amilorida (Tabla S3). Estos empalme elementos cis son los puntos de unión de ASF /SF2, SRp55 y otros factores reguladores desconocidos. Durante las interacciones de SF2 /ASF y otros factores proteicos SR con elementos cis en los complejos de empalme, el estado funcional de los complejos de unión proteína-proteína puede ser modulado por el estado de fosforilación de las proteínas [21], [23], [31] , [32]. Esto implica que el empalme alterada de estas transcripciones de genes fue mediado a través de la amilorida inducida por hipo-fosforilación de SF2 /ASF y otros proteínas SR.
disminución de la movilidad celular y la invasión actividades /agota estructuras del citoesqueleto siguiente como cambios de genes implicados después de la exposición amilorida
Debido alterado
RON /MISTR1
empalme mediado por SF2 /ASF se ha demostrado que resulta en aumento de la movilidad y las actividades invasivas de las células [20], se analizó el impacto funcional de la amilorida disminución inducida del exón 11 (+) fl
RON
y el exón 11 (-) sf
RON
isoformas (Figura 1C) y la disminución del exón 13 y el exón 20 inclusión detectado por el análisis conjunto exón (Tabla S1). La migración de células de un borde monocapa raspado se veía afectada por la amilorida 0,4 mM (Figura 6A). alteración demostrada de los andamios del citoesqueleto de actina F de unión de una estructura de red peri-nuclear en las células de control a una distribución de la superficie celular con un recinto aparentemente rígida de múltiples núcleos en las células amilorida tratados con faloidina fluorescente, y el agotamiento también grave del contenido citoplasmático, incluyendo F-actina, después de la exposición a 0,4 mM o mayores concentraciones de amilorida (Figura 6B). Estas observaciones de alteración de la movilidad celular y la organización citoplasmática anormal de F-actina son consistentes con nuestros hallazgos exón serie de alteración de empalme de ARN de muchos componentes de las proteínas que interactúan clave de la matriz extracelular, incluidas las familias de colágeno para las redes del citoesqueleto, así como las familias de miosina y su unión proteínas (Tabla S1), además de
RON /MSTIR Opiniones y moléculas reguladoras asociadas.
(panel a). La migración celular se determinó en confluente Huh-7 monocapas de células raspadas con una espátula de plástico, expuesto al medio de crecimiento con o sin amilorida 0,45 mM durante 48 horas, se enjuaga 2 veces con PBS y hacia adelante alimenta medio de crecimiento sin amilorida. fotografías microscópicas de serie de los mismos zonas (marcadas en verde o rojo en la parte inferior de platos) tomadas a las 48 y 96 horas muestran una inhibición completa de la migración celular desde el borde de la monocapa amilorida tratados. (Panel B) Las células expuestas a las concentraciones indicadas de amilorida en medio de crecimiento durante 36 horas se fijaron con paraformaldehído, permealized y se tiñeron con DAPI y FITC-faloidina para la observación por microscopía confocal. núcleos teñidos con DAPI son magenta-pseudocoloreada en las fotografías confocal fusionadas. (Panel C) Efecto inhibidor de la amilorida sobre la citocinesis se observó con células Huh-7 mitóticas sacudido de la antena, re-plateado en medio de crecimiento que contiene diferentes concentraciones de amiloride. Las células hijas divisorias se fijaron en 24, 48 y 72 horas, se tiñeron y se fotografiaron con el microscopio. (Panel D) Medición de las distancias entre los dos núcleos de dividir o células hijas divididas muestra que la amilorida inhibe la citocinesis post-mitótico y la separación de las células hijas. El diámetro del núcleo celular se establece como 10. La desviación media y estándar de cada punto de muestra son de 15 a 20 pares de células hijas.
Perturbación de la progresión del ciclo celular y la citocinesis mitótico por amilorida
Nuestra exón análisis conjunto de células Huh-7 amilorida tratados (Tablas S1 & amp; S2) detecta alteraciones de empalme de ARN predominantemente de las proteínas implicadas en la citocinesis, asociados con el transporte de solutos, y funciones de actina, microtúbulos, y cytokinesis- quinasas relacionadas [33]. Además,,
CEP250 gratis (proteína de 250 kDa centrosómicas) y
CEP192 gratis (proteína centrosómicas 192kDa) se esperaría que la alteración de empalme de ARN de
CENPE gratis (proteína E centrómero 312kDa) para dar lugar a la separación de cromátidas ineficaz durante el ciclo celular. De hecho, la proliferación de células Huh-7 fue inhibido por amilorida 0,3 mM o mayor en el medio de crecimiento (Figura 7A). Además, hubo una acumulación de células tetraploides G2 /M a partir de las 24 horas, convirtiéndose marcada a las 48 horas (Figura 7B). Mediante el examen microscópico de luz, había muchas células anafase etapa tardía bi-nucleado y que eran presumiblemente la población G2 /M tetraploide celular observada por fluorocytometry. Durante la progresión del ciclo celular y la separación de células hija en presencia de concentraciones variables de amilorida, células mitóticas expuestos a amilorida a 0,3 mM o superior desarrollaron en formas bi-nucleadas a las 24 horas, pero posteriormente fallaron para generar células hijas separadas (Figura 6C y 6D) . Estos tres observaciones implican que a través de la alteración de la ARN como de genes, amilorida provoca perturbación de la citocinesis mediante la inhibición de las células mitóticas pase a través de los procesos de anafase tardía de abscisión, la división y separación de las células hijas. Por último, se confirmó un informe anterior que Huh-7 células expresan Prominin /AC133 /CD133, un marcador inmunológico de las células "cáncer madre-como" [34], y, además, que la amilorida a 0,3 mm o más abajo reguladas expresión de CD133 Huh-7 células (Figura S2-a), lo que resulta en la supresión de la cantidad y el tamaño de las formaciones de colonias de células (Figura S2-B).
Huh-7 células (panel a) sembraron en placas de 6 pocillos en 3 × 10
5 células por pocillo durante la noche se cambiaron a medio de crecimiento que contiene diversas concentraciones de amilorida; el número de células se determinaron uno y tres días más tarde. Los recuentos de células a las 24 horas muestran inhibición del crecimiento por amilorida a 0,4 mm y superiores. Más recuento de células disminuye eran evidentes a las 72 horas debido a la muerte celular y desprendimiento en medio que contiene amilorida a 0,3 mM y superior. (Panel B) análisis citofluorométrico muestra la inhibición de la amilorida progresión del ciclo celular con la acumulación de células en fase G2 /M. (Grupo C) La apoptosis es evidente por la detección de citofluorométrico AnnexinV unión en las células Huh-7 tratadas con 0,5 mM de amilorida. Se observó (Panel D) Marcado degradación del ADN nuclear en las células Huh-7 tratadas con amilorida 0,4 mM pero no con amilorida 0,2 mm, en particular observado a las 48 y 72 horas.
La muerte celular con la degradación del ADN severa posterior al corte y empalme alterada amilorida inducida de moléculas funcionales en la apoptosis y las vías de reparación del ADN
en las células tratadas con amilorida, empalme cambios de
BCL-X
y
HIPK3
ARN ( Figura 1A) predeciría alteración de los mecanismos de apoptosis celular, y una alteración de
ATM
y
FANCM
ARN (Tabla S1) alteraría la reparación del ADN y los mecanismos de protección del genoma celular. Huh-7 células de cultivo en presencia de amilorida 0,3 a 0,5 mM demostró no sólo la falta de crecimiento de las células, sino también la posterior pérdida de las células Huh-7 inicialmente chapados (Figura 7A). La apoptosis fue evidente por el aumento de los porcentajes de células AnnexinV unión después de la exposición a la amilorida 0,3-0,5 mM durante 24 o 46 horas (Figura 7C). Además, el análisis fluorocytometric de ADN celular mostró extensa fragmentación del ADN nuclear y la degradación en más células que los demostrados para ser sometidos a la apoptosis; después de la exposición a la amilorida 0,4 mM, solamente 48,2%, 6,5% y 1,2% de las células Huh-7 tenía perfiles de ADN celular intacta después de 24, 48, y 72 horas respectivamente (Figura 7D).
efectos moduladores similares de amilorida en el empalme de ARN oncognic en otras líneas de tumores sólidos humanos y de células leucémicas
Para determinar la generalidad de los efectos amilorida observados en las células Huh-7, que utilizamos adicional de 10 estableció el cáncer y la leucemia de células líneas humanos, incluidos 2 de hepatoma HepG2 y Hep3B; rabdomiosarcoma TE671; 3 glioblastoma multiforme 8401, ASCG13T1xm y ASCG7T (4); cáncer de colon 2 líneas de células invasivas HT29 y COH; y 3 leucemias K562, células HL60 y Molt4, y una línea mesenquimales del estroma derivadas de médula ósea normal KP-hMSC, así como algunos cultivos normales de linfocitos de sangre, para llevar a cabo diversos experimentos primer plano mencionado. Nuestros resultados mostraron que, en general, amilorida tendía a afectar el fenotipo asociado maligna-AS más que el normal, como en la célula. En primer lugar, esencialmente como en células Huh-7 (Figura 1), encontramos a amilorida modulada "normalización" de la abornal
BCL-X
y
patrones HIPK3
de empalme en el hepatoma Hep G2, rabdomiosarcoma TE671, glioblastoma 8401, K562 leucemias, HL60 y Molt4 (por ejemplo, datos suplementarios de [35]). Más significativamente, amilorida podría modular la transcripción /empalme de
BCR-ABL
gen de fusión y volver a sensibilizar a la quimioresistente
Bcr-Abl
T3151 células mutantes a imatinib [35]. Por el contrario, el uso de amilorida hasta 2 mM en el medio de cultivo, se detectó ninguna alteración en el
BCL-X
y
HIPK3
patrones de empalme en las células mononucleares de sangre periférica normales activadas cultivadas (complementario los datos de [35]), ni en el estroma de la médula ósea inmortalizado células PK-hMSC. Consistentemente, amilorida en el intervalo de 0,02 mM-0,5 mM era citotóxico para las células cancerosas, pero no para las células normales en cultivo (Figura S3 A & amp; B). El uso de un 72 horas
in vitro
ensayo de cultivo, se encontró que el 50% de crecimiento inhibiendo dosis de amilorida fueron de aproximadamente 0,02 mM durante TE671, 0,10 mM para el K562, 0,20 mM durante Huh-7, 0,3 mM para dos otra HCC Hep-G2 y Hep-3B, y 0,2-0,4 mM para las tres líneas de glioblastoma multiforme, pero & gt; (. Figura S3-B) 3 mM o no medible para las líneas de células normales. Además, se realizó un análisis global de exón matriz en mieloide blastos de leucemia K562 y glioblastoma 8401, con y sin tratamiento amilorida, para la comparación con Huh-7 (Tablas S1, S2 y S3). Cross-juego de los 200 genes anotados-top amilorida modulada de cada una de las tres líneas de células reveló una característica bastante común de empalme amilorida modulada, es decir, que 187 genes o 93,5% de estos 200 fueron los mismos para los tres células; 188 (187 más
DNAH8
) para Huh-7 y 8401; 189 (187 más
LRP2 /RYR2
) para Huh-7 y K562; y 190 (187 más
ABL1, ColSA2, NAALAD2
) para 8401 y A549 (Figura S4-A). El análisis de IR de los 187 genes comunes de acuerdo con los procesos biológicos (Figura S4-B), funciones moleculares (Figura S4-C) y componentes celulares (Figura S4-D) Categorías mostró distribución porcentual similar a la amilorida modulada 495 genes de Huh-7 células (Figura 5), lo que implica que, en K562 y 8401 células como en células Huh-7, amilorida modulada como causas efectos similares en la estructura del citoesqueleto, la citocinesis, y la reparación del ADN, así como en el mecanismo de apoptosis y el sistema de transporte de solutos.
Discusión
Este estudio se basa en nuestro hallazgo inicial de que la amilorida cambió el corte y empalme de ARN alternativo de
BCL-X, HIPK3
y
RON /MISTR1
transcripciones de patrones oncogénicos hacia patrones normales en el carcinoma hepatocelular humano Huh-7 células. En experimentos de seguimiento, se observó hipo-fosforilación de factores de SR de empalme, especialmente SF2 /ASF, así como en las proteínas quinasas y fosfatasas de aguas arriba, lo que sugiere que la amilorida puede afectar el estado funcional de los complejos de inclusión /exclusión de exón. El análisis global de exón de hecho reveló alteraciones de AS en muchas transcripciones de genes de las redes celulares. Como consecuencia, las células Huh-7 amilorida tratados mostraron una disminución de la migración /invasión cytokinetic capacidades, la progresión del ciclo celular mitótico retrasados con defectos, se incrementaron las señales apoptóticas, graves daños al ADN celular y la muerte celular final. La exploración de los resultados posteriormente, hemos obtenido que el tratamiento con amilorida puede producir similares a los de la modulación y desvitalizar efectos en varios otros cánceres sólidos malignos humanos y líneas celulares leucémicas, además de carcinoma hepatocelular Huh-7, pero al parecer no en unas pocas células normales cultivadas hemos probado (figuras S3 y S4).
Una propiedad distintiva de amilorida en la modulación de fenotipos malignos mediadas AS-
La amilorida, 3,5-diamino-6-cloro-N- (diaminometilen) pirazinacarboxamida monohidrocloruro , fue desarrollado en la década de 1960 [36] y ha sido un fármaco utilizado clínicamente para el tratamiento de edema e hipertensión en función de su transporte de sodio y los efectos de la homeostasis de fluidos [37]. Por lo tanto, al principio pensamos que sus efectos sobre el empalme de ARN oncogénico estarían mediados por cambios en el pH intracelular y el movimiento de iones. Sin embargo, no se detectaron alteraciones similares a las de las células Huh-7 tratadas con cuatro análogos de amilorida Phi-que afectan a más potentes, incluyendo EIPA, que anteriormente mostró para modular la patogenicidad
SMN2 Versión taquigráfica en las células de pacientes con atrofia muscular espinal . Por lo tanto, la capacidad de alterar AS de los ARN oncogénicos parece ser una propiedad distinta de la amilorida.
Como AS es controlada por proteínas de la familia SR altamente conservadas [1], [3], [5] y desempeña un importante