Extracto
La anemia de cáncer (CA) pueden contribuir a la fatiga relacionada con el cáncer y afectar la calidad de vida. Una mejor comprensión de la patogénesis de la AC podría facilitar un mejor tratamiento, pero los modelos animales para el estudio de CA son insuficientes. Nos caracteriza cuatro tipos de cáncer singénicos C57BL /6 de ratón que causan AC. Los ratones con dos de rápido crecimiento de cáncer de pulmón metastásico diferentes desarrolló los hallazgos característicos de la anemia de la inflamación (AI), con drásticamente diferentes grados de anemia. Los ratones con rápido crecimiento melanoma metastásico también desarrolló una anemia severa por 14 días, con los parámetros hematológicos y inflamatorias similares a la gripe aviar. Los ratones con un cáncer de ovario peritoneal de crecimiento lento desarrolló una anemia por deficiencia de hierro, probablemente secundaria a la alteración de la nutrición crónica y sangrado en la cavidad peritoneal. De los cuatro modelos, los niveles de ARNm de hepcidina se incrementaron sólo en el modelo de cáncer de pulmón más suave. Al contrario que en nuestro modelo de inflamación sistémica inducida por muertos por calor-
Brucella abortus
, la ablación de hepcidina en el cáncer de ovario y los modelos de ratón de cáncer de pulmón más leves no afectó a la gravedad de la anemia. hepcidina mecanismos independientes juegan un papel importante en estos modelos murinos de AC Hotel
Visto:. Kim A, S Rivera, Shprung D, D Limbrick, Gabayan V, Nemeth E, et al. (2014) modelos de ratón de la anemia de cáncer. PLoS ONE 9 (3): e93283. doi: 10.1371 /journal.pone.0093283
Editor: Kostas Pantopoulos, Lady Davis Instituto para la Investigación /Universidad de Medicina de McGill, Canadá
Recibido: December 20, 2013; Aceptado: 28 Febrero 2014; Publicado: 28 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el NIH pulmonar & amp; Critical Care Institucional de Formación de Grant T32 (HL072752) a AK, 09/2008 - 06/2011; y la Fundación de Investigación de Roche para la Anemia de TG. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. T. G. y E.N. son co-fundadores, accionistas y agentes de intrínsecos Life Sciences, una compañía de desarrollo de diagnósticos de hepcidina. E.N. y T. G. mantener patentes relacionadas con el uso terapéutico de la hepcidina y sus reguladores. Por favor, vea los detalles a continuación las patentes ', incluyendo nombres y números: 1) regulación competitiva de hepcidina ARNm mediante soluble y asociado a células hemojuvelina (Ganz, Lin, Goldberg) US Patent no. 7534764, fecha de emisión 19 de de mayo de 2009 2) Mini-hepcidina péptidos y métodos de utilización de los mismos (Ganz, Nemeth, Preza, Ruchala) US Patent no. 8435941, fecha de emisión 7 de mayo de 2013 3) PENDIENTE: Erythroferrone y erfe polipéptidos y los métodos para reglamentar Metabolismo del hierro (Ganz, Nemeth) la solicitud de patente PCT Nº PCT /US2013 /67771. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y compartir materiales
Introducción
La anemia es una complicación muy común de cáncer, que se producen en & gt;. El 30% de los pacientes no tratados [ ,,,0],1]. La incidencia de anemia se incrementa aún más por el tratamiento del cáncer, incluyendo la quimioterapia y la radiación. La anemia de cáncer (AC) se correlaciona con un mal estado general de la OMS y la calidad de vida [2], [3]. El tratamiento eficaz de AC disminuye la fatiga subjetiva en pacientes con cáncer [4]. Además de los efectos sobre la calidad de vida, la presencia de CA puede ser un factor pronóstico negativo independientes [5].
La etiología de la AC es multifactorial y probablemente varía con el origen del tumor primario, así como la cronicidad de la enfermedad. factores contribuyentes importantes incluyen la deficiencia de hierro secundaria a sangrado o deficiencias nutricionales [6], la hemólisis debido a fenómenos inmunes, activación de cascadas de coagulación o anormal vasculatura asociada a tumores [7], la eritropoyesis alterada secundaria a la producción de eritropoyetina inadecuada o la respuesta de depresión de la médula eritroide a la eritropoyetina [8], y la invasión directa de la médula ósea por células tumorales con una interrupción del medio ambiente eritropoyética. Un contribuyente particularmente importante a la CA es la inflamación, como acciones de CA muchas de las características de la anemia de la inflamación (AI). AI es una anemia normocítica normocrómica, con una esperanza de vida de los eritrocitos acortado y la eritropoyesis deprimida. AI también se caracteriza por una alteración de la homeostasis del hierro sistémica caracterizada por hipoferremia con las reservas de hierro intactas [9] y la disminución de la disponibilidad de hierro para la producción de eritrocitos.
hepcidina, una hormona peptídica de 25 aminoácidos producido principalmente por los hepatocitos [ ,,,0],10], es el principal regulador de la homeostasis del hierro en la salud y durante la inflamación [11]. Hepcidina actúa mediante la unión a la ferroportina, el único conocido celular exportador de hierro, aparece en la superficie de las células que suministran hierro para plasma: macrófagos, hepatocitos y enterocitos. la unión a ferroportina hepcidina conduce a endocitosis y degradación ferroportina [12], lo que limita el flujo de hierro en plasma y reduciendo así la disponibilidad de hierro para la eritropoyesis. Durante la inflamación, la expresión de hepcidina está fuertemente inducida, en gran parte por la IL-6 [13] a través de la vía JAK-STAT [14] - [16] y este exceso de hepcidina se cree que contribuyen al desarrollo de la AI. Curiosamente, IL-6 se ha observado que aumentarse en múltiples tipos de tumores, incluyendo cáncer de pulmón [17] y el cáncer de ovario [18]. La medida en que aumenta la producción de hepcidina contribuye a la CA no ha sido probado directamente por la ablación genética de la hepcidina, en parte debido a la escasez de modelos de ratón de AC Hotel.
A pesar de la alta prevalencia de AC con sus efectos negativos sobre la calidad de vida y la supervivencia, pocos modelos animales han sido desarrollados para su estudio. Hemos caracterizado cuatro modelos singénicos C567BL /6 de ratón de cáncer: dos modelos de rápido crecimiento de cáncer de pulmón, uno de rápido crecimiento modelo de melanoma, y un modelo de crecimiento lento de cáncer de ovario. Después de un examen exhaustivo de las hematológica, hierro, y los parámetros inflamatorios de estos modelos, se investigó el grado de participación de la hepcidina en el desarrollo de aire acondicionado en dos de estos modelos mediante la comparación de C57BL /6 a ratones hepcidina knockout en la misma cepa de fondo.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todo el trabajo y el cuidado de los animales se llevaron a cabo bajo las directrices de la Universidad de California, los Ángeles Comité de Investigación Animal (UCLA) de la canciller (ARC) . Se obtuvo una autorización específica para los experimentos con ratones con el protocolo#2008-129-12 titulado "El papel de la IL-6 y la hepcidina en la anemia de cáncer." Se hicieron todos los esfuerzos razonables para aliviar el sufrimiento, incluida la anestesia para los procedimientos dolorosos.
los modelos animales de la anemia de cáncer
Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal de la Universidad de California, los Angeles (UCLA). 6 semanas de edad, C57BL /6J se obtuvieron de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) o The Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Para los tres de rápido crecimiento modelos de cáncer, de tipo salvaje (WT) ratones machos y hembras se colocaron en una dieta de hierro suficiente (20 ppm de hierro, Harlan Teklad, Indianapolis, IN) durante 2 semanas antes de la inyección de las células tumorales o solución salina. La misma dieta se utilizó durante el resto del experimento. Este acondicionamiento de la dieta fue aplicado debido a que el alto contenido de hierro de comida estándar (aproximadamente 7-8 veces el requerimiento diario) aumenta de manera espectacular la expresión de hepcidina y lo hace insensible a estímulos inflamatorios [19]. Además, la absorción de hierro en la dieta en ratones representa tanto como el 50% de los flujos diarias de hierro en ratones alimentados con comida estándar, pero sólo ~5-10% en los seres humanos [20]. Este aumento de la absorción de hierro en la dieta en ratones puede disminuir la contribución relativa de reciclaje del hierro por los macrófagos [21] y conduce a la carga de hierro progresiva. Por lo tanto, la reducción del contenido de hierro en la dieta en la comida para ratones fue diseñado para modelar los flujos de hierro de la homeostasis humana. Para el modelo de crecimiento lento de cáncer de ovario, los ratones hembra se mantuvieron en una dieta de hierro-suficientes del 20 ppm de hierro o 50 ppm de hierro.
Para generar un modelo de cáncer de pulmón metastásico, los animales fueron inyectados por vía intraperitoneal (IP ) con 0,1 × 10
6-0,5 × 10
6 murino carcinoma TC-1 o de pulmón de Lewis (LLC) de células (ATCC, Manassas, VA). Debido a que estos son células tumorales metastásicas, y que estaban investigando la respuesta sistémica a estos tipos de cáncer, se optó por realizar inyecciones intraperitoneales en lugar de incubación de las células tumorales en su órgano principal. Las células LLC se cultivaron como células adherentes en medios de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina G-estreptomicina, y las células TC-1 eran cultivadas como células adherentes en medio RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina G-estreptomicina. En el día del tratamiento, las células tumorales se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se contaron con un hematocitómetro, y se inyectaron en un volumen de 500 l de PBS. Los ratones de control fueron inyectados IP con 500 l de PBS. Los ratones se sacrificaron a los 13-15 días, y la sangre, el hígado y el bazo se recogieron en la necropsia
.
En el modelo de ratón del melanoma metastásico, los animales fueron inyectados IP con 0,1 × 10
6-0,3 × 10
6 células B16-F10 (ATCC, Manassas, VA). Las células B16-F10 se cultivaron como células adherentes en DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina G-estreptomicina. En el día del tratamiento, las células tumorales se resuspendieron en PBS, se contaron con un hematocitómetro, y se inyectaron en un volumen de 500 l de PBS. Los ratones de control fueron inyectados IP con 500 l de PBS. Los ratones fueron sacrificados a los 14 días, y la sangre y el hígado se recogieron en la necropsia
.
Para el cáncer de ovario peritoneal diseminada, los animales fueron inyectados IP con 1 × 10
6 células ID8 que fueron generosamente proporcionadas por el Dr. Oliver Dorigo. La línea celular ID8 metastásico se deriva de la transformación maligna espontánea de las células del epitelio superficial del ovario ratón C57BL /6
in vitro
[22]. Las células se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina G-estreptomicina. En el día del tratamiento, las células tumorales se resuspendieron en PBS, se contaron con un hematocitómetro, y se inyectaron en un volumen de 500 l de PBS. Los ratones de control fueron inyectados IP con 500 l de PBS. Los ratones se sacrificaron a 18,5 semanas.
Para estudiar el papel de la hepcidina en la anemia de cáncer, se utilizaron ratones hembra HKO ratones hembra hepcidina-1 knockout (HKO) de sexo masculino y para el modelo TC-1, y para el ID8 modelo. HKO ratones fueron proporcionados originalmente en nuestro laboratorio por el Dr. Sophie Vaulont [23] y se backcrossed al /6 antecedentes C57BL como se describe anteriormente [24]. Para esta parte del estudio, los ratones fueron sometidos a HKO acondicionado dietético para prevenir el desarrollo de la sobrecarga de hierro y mantener los niveles de hierro comparables a las de los ratones WT. Al destete, los ratones HKO se iniciaron en las dietas de hierro reducido (4 ppm o 20 ppm) durante aproximadamente 2 semanas para prevenir la masiva característica de la carga de hierro de este ratón knock-out. Desde el momento de la inyección, los ratones se mantuvieron en una dieta de hierro 20 ppm durante el resto del estudio. Para el modelo TC-1, se inyectaron ratones HKO y sacrificados como se describe anteriormente para los ratones WT. Para el modelo ID8, los ratones fueron sacrificados HKO en 16,5 semanas.
La medición de los parámetros de hierro y eritropoyetina
El hierro sérico y las concentraciones de hierro en el hígado no hemo se midieron mediante un ensayo colorimétrico para el hierro (Sekisui Diagnóstico; Lexington, MA) como se describe anteriormente [20]
estudios hematológicos
recuentos sanguíneos completos se obtuvieron con un analizador de sangre Hemavet (Drew Scientific;. Waterbury, CT). Para evaluar la eritropoyesis de restricción de hierro, se midió la protoporfirina de cinc (ZPP) utilizando un hematofluorometer (AVIV; Lakewood, NJ). Los reticulocitos se contaron mediante citometría de flujo. Se añadió la sangre (5 l) a 1 ml de naranja de tiazol en PBS con azida de sodio 0,1% (PBS-azida, BD Bioscience; San Jose, CA) y se incubó a temperatura ambiente durante 1-3 h. Como un control sin teñir, se añadió a la sangre PBS-azida sin naranja de tiazol. El porcentaje de reticulocitos de color rojo fluorescente (Retic%), se midió por citometría de flujo en el Centro de UCLA Jonsson Comprehensive Cancer (CMCA) y el Centro para el Fondo para el flujo de Investigación del SIDA Citometría Core que está apoyada por los Institutos Nacionales de premios Salud CA-16042 y AI -28.697, y por el CMCA, el Instituto UCLA SIDA, y la Escuela de Medicina David Geffen de la UCLA. controles sin teñir se utilizaron para establecer una puerta para excluir la fluorescencia de fondo. Los resultados se expresan como el índice de productos de reticulocitos:. RPI = Retic% × Hb /línea de base Hgb
El aislamiento de ARN y cuantitativa en tiempo real PCR
El ARN total se aisló de hígado y se analizó mediante reales -Tiempo RT-PCR como se describe anteriormente [25].
murino β-actina se utilizó como control ARNm de limpieza. Primers se enumeran en la Tabla S1
Histocytopathology
frotis de sangre periférica se realizaron con 10 l de sangre total en el momento de la necropsia, y se prepararon con Wright-Giemsa mancha. (Fisher; Hampton, NH) .
Estadísticas
SigmaStat se utilizó para todos los análisis estadísticos (Systat Software, Point Richmond, CA). Para el melanoma, el cáncer de pulmón, y los modelos KO hepcidina, los datos distribuidos normalmente se compararon mediante Estudiante
t-test
. Las mediciones que no se distribuyen normalmente se compararon mediante la prueba no paramétrica de suma de rangos de Mann-Whitney. P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativo. ID8 datos del ratón de tipo salvaje se analizó inicialmente utilizando ANOVA de dos sentidos, con ID8 inyección /solución salina y hierro dieta como las dos variables que afectan el resultado. Este análisis estadístico no mostró ninguna interacción significativa entre las dos variables. Los datos de tipo salvaje ID8 se presenta utilizando Estudiante
t-test
para los datos paramétricos y de Mann-Whitney rango suma de prueba para los datos no paramétricos. medidas de correlación se obtuvieron mediante la correlación de Pearson.
ratones WT y HKO Tanto hombres como mujeres se utilizaron para las tres de rápido crecimiento modelos de ratón de cáncer. Análisis de los parámetros hematológicos clave, incluyendo la hemoglobina y hierro sérico, mostró que no había diferencia significativa entre los ratones macho y hembra. Por lo tanto, estamos presentando los datos de ambos sexos y combinado.
Resultados
Los ratones con cánceres de pulmón metastásico desarrollan anemia con reticulocitosis y restricción de hierro
Hemos generado dos modelos de cáncer de pulmón metastásico mediante la inyección de las líneas celulares de cáncer singénicos, TC-1 y LLC, en el peritoneo de los ratones. Los ratones de control recibieron PBS. Antes de la eutanasia a los 14 días después de la inyección, todos los ratones tumorales muestran signos compatibles con enfermedad sistémica secundaria a la carga tumoral, incluyendo el letargo, falta de aseo y ascitis. La necropsia reveló masas intraperitoneales en la mayoría de los ratones. La hemoglobina fue menor en los ratones del tumor en comparación con los controles (Fig. 1A) (LLC 7,8 g /dl frente a PBS 15,6 g /dl, P & lt; 0,001; TC-1 14,2 g /dl frente a PBS 15,6 g /dl, P = 0,029). Los ratones tumorales anémicos habían aumentado reticulocitosis en comparación con los controles (Fig 1b.) (RPI en LLC 10,7 vs. PBS 2,4, P & lt; 0,001; TC-1 6,1 vs. 2,4 PBS, P & lt; 0,001). Es de destacar que los ratones LLC tenían niveles más bajos de hemoglobina que los ratones TC-1 (P & lt; 0,001). Y mayor Reticulocitosis (P = 0,006) guía
C57BL /6 ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con 0,1 × 10
6 -0,5 × 10
6 murino carcinoma TC-1 o de pulmón de Lewis (LLC) de células y sacrificados después de 14 días. En comparación con los controles, los ratones portadores de tumores tienen: (A) disminución de la hemoglobina; (B) una mayor Reticulocitosis. N = 8-19 ratones por grupo de tratamiento y control. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,001; P por Mann-Whitney rango suma de prueba. Bares y barras de error son media ± 75
th /25
percentil.
Cuando el hierro disponible es insuficiente para la eritropoyesis, aumento de los niveles de zinc se incorporan en el anillo de protoporfirina. Por lo tanto, la protoporfirina de cinc (ZPP) niveles son un buen indicador de la eritropoyesis de restricción de hierro [26]. los niveles de ZPP en ratones portadores de tumores se incrementó en comparación con los controles, lo que indica la eritropoyesis de restricción de hierro (Fig 2A.) (LLC 160 vs. PBS 84, P & lt; 0,001; TC-1 136 vs. PBS 84, P & lt; 0,001). LLC ratones tenían una tendencia hacia mayores niveles de ZPP que los menos anémica TC-1 ratones (P = 0,129). los ratones portadores del tumor tenían hipoferremia como se indica mediante un ensayo de hierro en el suero (Fig 2B). (LLC 11,5 mmol /L vs PBS 39,8 mmol /L, P = 0,004; TC-1 20,8 mmol /L vs PBS 39,8 mmol /L , P = 0,031). Con el fin de determinar si esto era debido al secuestro de hierro, como se vería en la anemia de la inflamación, en lugar de la anemia por deficiencia de hierro secundaria a la desnutrición o sangrado, las reservas de hierro del cuerpo se estimaron usando mediciones de hierro en los tejidos del hígado y del bazo. Ambos modelos de tumores de pulmón tenían un mayor contenido de hierro no hemo hígado que los controles (Fig 2C). (LLC 8,9 mol Fe /g vs. PBS 1,5 mol Fe /g, P & lt; 0,001; TC-1 3,9 mol Fe /g vs. PBS 1,5 mol Fe /g, P = 0,002). ratones LLC también tenía el bazo mayor contenido de hierro no hemo que los controles, y la CT-1 ratones tenían contenido de hierro del bazo comparables (Fig. 2D) (LLC 15,9 mol Fe /g frente a PBS 10,4 mol Fe /g, P = 0,039).
C57BL /6 ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con células TC-1 o LLC y sacrificados después de 14 días. Ambos modelos de ratón portador de un tumor muestran: (A) los niveles elevados ZPP comparación con los controles, lo que indica la síntesis de heme de restricción de hierro; (B) hipoferremia; (C) aumentó hierro en el hígado. (D) Los ratones que portan LLC han aumentado hierro bazo y los ratones portadores de TC-1 tienen una tendencia hacia el aumento de hierro bazo, TC-1 frente a PBS, p = 0,381. N = 8-19 ratones por grupo de tratamiento y control. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,001; P por Mann-Whitney rango suma de prueba. Bares y barras de error son media ± 75
th /25
percentil.
Los ratones con cáncer metastásico de pulmón inflamación manifiesta, pero hepcidina se incrementa sólo en el modelo menos grave
con el fin de evaluar la contribución de la inflamación y la actividad de hepcidina para el desarrollo de la anemia en nuestros modelos de cáncer, que mide las concentraciones de ARNm hepático de SAA-1 y la hepcidina. SAA-1 es un reactante de fase aguda hepática que se sabe que ser incrementado en respuesta a la inflamación y ciertas citoquinas, en particular IL-6 [27]. Como se cree que IL-6 a ser una causa importante de la anemia de la inflamación mediante la inducción de la expresión de hepcidina [19], se utilizó mediciones SAA-1 como un indicador de la actividad de IL-6. En el día 14, tanto TC-1 y de los ratones LLC habían elevado hígado SAA-1 los niveles de ARNm en comparación con los controles (Fig. 3A). LLC ratones tenían a & gt; aumento de 75 veces más que los ratones PBS (P = 0,001), y la CT-1 ratones tenían a & gt; aumento de 340 veces (P = 0,002). En el día 14, la anemia leve TC-1 ratones había elevado ligeramente hígado hepcidina los niveles de ARNm en comparación con los controles (& gt; 2 ×, P = 0,012) (Figura 3B), mientras que los ratones más gravemente anémico LLC tenían niveles de hepcidina inferiores (P = 0,022), tal vez debido al efecto de la hepcidina contrareguladora de anemia moderada y los estímulos eritropoyética resultantes [28]. Para evaluar la influencia de la inflamación en la expresión del ARNm de la hepcidina, se evaluó la correlación entre los niveles de SAA-1 mRNA y los niveles de mRNA correspondiente hepcidina en ratones individuales pero la correlación es débil [datos no mostrados]. A pesar de niveles mucho más altos de SAA-1 en los ratones portadores de tumor que en los controles, indicativo de la inflamación inducida por el tumor, las concentraciones de ARNm de hepcidina no aumentaron proporcionalmente en ratones portadores de TC-1 y fueron incluso disminuyeron en ratones LLC-cojinete. Estos datos sugieren que otros factores pueden contrarrestar el efecto de la inflamación en la síntesis de hepcidina, y estos podrían incluir anemia y el aumento de la eritropoyesis.
Por día 14, (A) los dos modelos de tumores han aumentado los niveles de mRNA de hígado SAA-1 ; (B) los ratones TC-1-cojinete se han incrementado los niveles de mRNA de hígado hepcidina en comparación con los controles, y los ratones que portan LLC han disminuido hepcidina. N = 8-19 ratones por grupo de tratamiento y control. * P & lt; 0,05; P por Mann-Whitney rango suma de prueba. Bares y barras de error son media ± 75
th /25
percentil.
La hepcidina niveles de mRNA se midieron también en los tumores para determinar si la expresión de hepcidina tumor puede estar contribuyendo al desarrollo de la anemia del cáncer. Ninguno de los dos tumores LLC TC-1 ni tenían la expresión de hepcidina detectable, lo que demuestra que estos tumores no contribuyen directamente a los niveles de hepcidina sistémicos.
Los ratones con melanoma desarrollar anemia con la eritropoyesis y la inflamación de restricción de hierro
siguiente generado un modelo de ratón de melanoma metastásico mediante la inyección de una línea celular de melanoma, B16-F10, en el peritoneo de los ratones. Los ratones de control recibieron PBS. Antes de la eutanasia 14 días después de la inyección, los ratones tumorales muestran signos compatibles con una enfermedad sistémica y la carga tumoral, incluyendo el letargo y la ascitis. análisis Recuento sanguíneo completo reveló una anemia marcada en los ratones de melanoma en comparación con los controles (Fig 4A.) (B16-F10 Hgb 8,2 g /dl frente a PBS Hgb 15,6 g /dl, P & lt; 0,001). Los ratones de tumor también desarrollaron un reticulocitosis y robusta gt; 4 × la de sus homólogos de control (Fig 4B.). los ratones del melanoma demostraron significativa eritropoyesis de restricción de hierro con a & gt;. aumento de 2 veces en los niveles de ZPP en comparación con los controles (Fig. 4C)
C57BL /6 ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con 0,1 × 10
6 -0.3 × 10
6 células B16-F10, y sacrificados después de 14 días. Los ratones de melanoma que llevan desarrollar: (A) una anemia significativa; (B) una mayor Reticulocitosis comparación con los controles; (C) elevada protoporfirina de cinc (ZPP) los niveles en comparación con los controles, lo que indica la síntesis del grupo hemo de restricción de hierro; (D) aumento de los niveles de SAA-1 de hígado mRNA, un marcador de la inflamación y la actividad de IL-6; (E) los niveles más bajos de ARNm de hepcidina. N = 8-11 ratones por grupo de tratamiento y control. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,001; P por Mann-Whitney rango suma de prueba. Bares y barras de error son media ± 75
th /25
percentil
En el día 14, los ratones con melanoma tenían un aumento espectacular (& gt; 600 veces). Saami en 1 mRNA, en comparación con los controles, lo que indica la inflamación robusta (Fig. 4D). los niveles de ARNm de hepcidina fueron suprimidos en los ratones de tumores en comparación con los controles (Fig. 4E). Debido a que este tumor provocó una anemia con características muy similares a los causados por el cáncer de pulmón metastásico LLC, su efecto sobre la homeostasis del hierro no se caracteriza más.
Los ratones con cáncer de ovario desarrollar anemia por deficiencia de hierro
también se analizó el desarrollo de la anemia en ratones con cáncer de ovario un crecimiento lento mediante la inyección de la línea celular de cáncer de ovario singénico ID8 en el peritoneo de los ratones. Los ratones de control inyectados con ID8 e inyectados con PBS se sacrificaron 18,5 semanas después de la fecha de la inyección. En este momento, todos los ratones portadores de tumores muestran signos compatibles con una enfermedad sistémica, incluyendo el letargo, falta de aseo y ascitis. La necropsia reveló masas intraperitoneales observa en la mayoría de los ratones con ascitis hemorrágica en muchos. La hemoglobina fue menor en los ratones portadores de tumores en comparación con los controles (Fig. 5A) (ID8 10,4 g /dl frente a PBS 11,25 g /dl, P = 0,040). los ratones PBS mismos habían disminuido moderadamente los niveles de hemoglobina, probablemente como consecuencia de haber sido alimentados con una dieta con hierro reducido durante 18 semanas. Los ratones portadores de tumores tenían niveles elevados de ZPP en comparación con los controles, lo que indica la eritropoyesis de restricción de hierro (Fig. 5B) (ID8 162 vs. PBS 129, P = 0,008). Total de las reservas de hierro del cuerpo se evaluaron usando mediciones de hierro tejidos de hígado y bazo. Los ratones portadores de ID8 tenían un menor contenido de hígado y bazo de hierro que los controles (figura 5C, D.) (ID8 hepática de hierro 8,1 mol Fe /g frente a PBS hierro hepático 14,9 mol Fe /g, p = 0,041; ID8 hierro bazo 63,1 micromoles Fe /g frente a PBS hierro bazo 138,5 mol Fe /g, P = 0,011). Así, este modelo de tumor de ovario se desarrolla la anemia con deficiencia de hierro franca, probablemente parcialmente secundaria a sangrado en la cavidad peritoneal y la alteración de los nutrientes.
C57BL /6 ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con 1 × 10
6 células ID8 y practicó la eutanasia después de 18,5 semanas. En comparación con los controles, los ratones portadores de ID8: (A) son más anémicas; (B) tienen niveles elevados de ZPP; (C, D) tienen niveles de hierro del hígado y el bazo inferiores. N = 10 a 16 ratones por tratamiento y el grupo control. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,001; P por Mann-Whitney suma de rangos (A, B) o estudiante
t-test
(C, D). Bares y barras de error son ± Mediana Mediana ± 75
th /25
percentil (A, B) o media ± DE (C, D).
Los ratones con cáncer de ovario tiene niveles de hepcidina suprimidas que responden a las reservas de hierro del hígado
hígado
a 18,5 semanas, los ratones ID8 había deprimido hepcidina los niveles de mRNA, en comparación con los controles (Fig. 6A) (ID8 0,20 vs. PBS 14,08, P = 0,013), así como comparables niveles de SAA-1 con los controles (Fig. S1) (P = 0,361), lo que indica que la inflamación y la hepcidina no juegan un papel importante en el desarrollo de esta anemia. Además, la figura 6B muestra una correlación positiva significativa entre los niveles de hepcidina y hierro hígado, lo que indica la supresión de la hepcidina adecuada con el desarrollo de la anemia por deficiencia de hierro en este modelo de tumor de ovario (hepcidina ID8 vs hierro en el hígado, R
2 = 0,64 ., P = 0,017)
a 18,5 semanas, los ratones portadores de ID8 comparación con los controles han (a) mRNA hepcidina suprimida; (B) correlación positiva significativa entre las reservas de hierro del hígado y la expresión del ARNm de la hepcidina. N = 11 a 16 ratones por tratamiento y el grupo control. * P & lt; 0,05; P Mann-Whitney rango suma de prueba en (A), y por Correlación de Pearson en (B). Bares y barras de error son media ± 75
th /25
percentil.
El desarrollo de la anemia en los modelos tumorales de ratón no es secundaria a hemólisis microangiopática
La lista de posibles causas de anemia en modelos de cáncer incluye hemólisis microangiopática o cizallamiento de los eritrocitos, que también se puede ver en anemias inflamatorias [6]. Los frotis de sangre periférica de los ratones portadores de tumor no mostraron esquistocitos o fragmentos de eritrocitos. La figura 7B muestra un frotis de sangre casi normal del modelo TC-1, con irregularidades de la membrana mínimos. Las figuras 7C y 7D muestran que los modelos más anémicos LLC y ID8 tienen anormalidades de eritrocitos más graves, incluyendo las células de lágrima y palidez central, pero de nuevo sin un número significativo de esquistocitos que indicarían una contribución de hemólisis microangiopática a la anemia. [29]
(A) control de PBS (B) TC-1 (C) LLC (D) ID8.
La anemia no es atenuada en hepcidina-ablación TC-1- o ID8 ratones portadores de
con el fin de probar si la hepcidina contribuye al desarrollo de la anemia en ratones portadores de tumores, se inyectaron dos de las líneas de células tumorales en ratones knockout hepcidina. En el día 14 después de la inyección TC-1, no hubo diferencia significativa entre los descensos de hemoglobina de tipo salvaje y ratones knockout hepcidina (Fig. 8A) (WT TC-1 -1.08 g /dl vs HKO TC-1 -0.99 g /dl, P = 0,908). Aunque TC-1 ratones tenían niveles ligeramente elevados de hepcidina, la hepcidina claramente no es esencial para el desarrollo de este tipo de anemia. Tomados en conjunto con el aumento de la SAA-1 los niveles, estos datos apuntan a un mecanismo inflamatorio hepcidina-independiente de anemia.
(A) Por día 14, no hay diferencia significativa entre los cambios de hemoglobina en TC-1 llevando los de tipo salvaje y ratones knockout de hepcidina (P = 0,908). (B) los niveles de hemoglobina absolutos de los ratones se muestran en A. (C) en un 18,5 semanas, no hay diferencia significativa entre los cambios de hemoglobina de ID8-cojinete de tipo salvaje y los ratones knockout de hepcidina (P = 0,739). (D) los niveles de hemoglobina absolutas de los ratones que se muestran en C. N = 4-19 ratones por grupo de tratamiento y control. P mediante la prueba t. Bares y barras de error son la media ± SD.
Para examinar si la hepcidina expresión es necesaria para el desarrollo de la deficiencia de hierro en un modelo más crónica, se comparó el desarrollo de la anemia en ratones WT y knockout hepcidina teniendo cáncer de ovario ID8. A 18,5 semanas, no hubo diferencia significativa entre los descensos de hemoglobina de tipo salvaje y ratones knockout hepcidina tratados con ID8 (Fig. 8C) (WT ID8 -5,26 g /dl vs HKO ID8 -4.50 g /dl, p = 0,739 ). Estos datos confirman nuestros hallazgos de que los ratones que llevan ID8-desarrollan anemia en respuesta a la hemorragia y la deficiencia nutricional de hierro, en lugar de un mecanismo inflamatorio hepcidina mediada.
Discusión
Anemia de cáncer (AC) es una manifestación menudo pasado por alto, pero importante, de un tumor maligno. Incluso anemia leve se ha demostrado que afectan negativamente a la calidad-paciente, informó de vida (QOL) parámetros [30]. Aunque una disminución de la hemoglobina es sólo un factor en el desarrollo de las mediciones de calidad de vida con depresión en pacientes con cáncer, la mejora de la anemia se ha demostrado que tienen una correlación significativa y directa con la calidad de vida en general [31]. La mejora en la calidad de vida con el tratamiento anemia persistió independientemente de la respuesta parcial o completa a cualquier régimen de quimioterapia. Además, AC se ha demostrado ser un factor pronóstico negativo independiente para el tiempo de supervivencia de pacientes con cáncer [32].
A pesar de los efectos adversos de AC, es poco reconocido y bajo tratados por los médicos [33] , en parte debido a la falta de terapias seguras y efectivas. Entre los posibles tratamientos, transfusiones de glóbulos rojos están asociados con efectos inmunosupresores, la transmisión de la infección, y las reacciones de transfusión [34]. Los agentes estimulantes de la eritropoyesis, como la eritropoyetina humana recombinante, se han asociado con mayores tasas de mortalidad en pacientes con cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama y cáncer de pulmón de células no pequeñas [35]. Los modelos preclínicos deberían facilitar el desarrollo de tratamientos más seguros y eficaces.
En la escasa literatura sobre el papel de la hepcidina en AC, existe alguna evidencia de que las concentraciones de la inflamación y el aumento de hepcidina podrían contribuir a AC. Butterfield et al. demostraron que los niveles de hepcidina suero fueron significativamente elevados en pacientes humanos con hematológicas o no hematológica cánceres, incluyendo el melanoma y los cánceres de pulmón [36]. Otro estudio de pacientes con cáncer y anemia por Ukarma et al. [37] demostraron una relación inversa entre los niveles de hepcidina y una respuesta a la terapia con epoetina hemoglobina. Esta relación entre la resistencia y el aumento de la epoetina hepcidina indica un posible papel de la hepcidina en el mecanismo de desarrollo AC. Sasu et al. más estratificada pacientes con cáncer y anemia en personas con anemias inflamatorias, mixtos, y por deficiencia de hierro, utilizando los parámetros hematológicos y los niveles de proteína C reactiva [38]. Esta estratificación mostró que los pacientes inflamadas tenían los más altos niveles de hepcidina suero, seguido por los pacientes con la anemia mixta. También había una correlación directa entre los marcadores inflamatorios (ferritina y CRP) y la hepcidina en los pacientes de CA, lo que sugiere un papel de la hepcidina aumento inflamación inducida en la patogénesis de AC en un subconjunto de pacientes con cáncer con la inflamación prominente.
recientemente hemos publicado una caracterización detallada de un modelo de ratón que ayudaron a definir la contribución de la hepcidina en la anemia de la inflamación (AI) [39].