Extracto
Introducción
Se evaluó la expresión de p85 y subunidades de PI3K p110α en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) ejemplares y la asociación con la expresión de mTOR, y los efectos de la orientación del estudiamos PI3K /Akt /mTOR en líneas celulares de cáncer.
Métodos
El uso automatizado de análisis cuantitativo se cuantificó la expresión de las subunidades de PI3K en dos cohortes de 190 y 168 muestras de NSCLC y se correlacionó con la expresión de mTOR. Se estudiaron los efectos de dos inhibidores de PI3K, LY294002 y NVP-BKM120, solo y en combinación con la rapamicina en 6 líneas celulares de NSCLC. Se evaluó la actividad de una PI3K /inhibidor de mTOR dual, NVP-BEZ235 solo y con un inhibidor de EGFR
Resultados
p85 y p110α tienden a ser co-expresada (p & lt; 0,001).; la expresión de p85 fue mayor en los adenocarcinomas que los carcinomas de células escamosas. La expresión de alto p85 se asoció con una etapa avanzada y supervivencia de los pobres. expresión p110α correlacionado con mTOR (ρ = 0,276). En seis líneas celulares de cáncer, además de la rapamicina con LY294002 o NVP-BKM120 fue sinérgica. Incluso con concentraciones muy bajas de rapamicina (1 nM) dio lugar a la sensibilización a los inhibidores de PI3K. NVP-BEZ235 era muy activo en líneas celulares de cáncer con IC
50 años en el rango nanomolar y resultante baja regulación de pAKT y pP70S6K. La adición de erlotinib a NVP-BEZ235 resultó en la inhibición del crecimiento sinérgico.
Conclusiones
La asociación entre la expresión de PI3K, etapa avanzada y la supervivencia en NSCLC sugiere que podría ser un objetivo valioso de drogas. la inhibición simultánea de PI3K y mTOR es sinérgica
in vitro
, y un inhibidor dual de la PI3K /mTOR era muy activa. la inhibición del EGFR Adición resultó en la inhibición del crecimiento adicional. Orientación de la AKT vía mTOR PI3K //en múltiples niveles debe ser probado en ensayos clínicos para el CPCNP
Visto:. Zito CR, Jilăveanu LB, Anagnostou V, Rimm D, G Bepler, Maira S-M, et al. (2012) de varios niveles de orientación de la fosfatidilinositol-3-quinasa Camino en células no pequeñas células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (2): e31331. doi: 10.1371 /journal.pone.0031331
Editor: John D. Minna, Univesity de Texas Southwestern Medical Center en Dallas, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Junio, 2011; Aceptado: 6 Enero 2012; Publicado: 15 Febrero, 2012
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por un premio de desarrollo de la carrera de la Asociación Americana de Investigación del Cáncer al Dr. Chao. El Dr. Kluger es apoyado por la Universidad de Yale SPORE en cáncer de piel, 1 CA121974 P50 (a R. Halaban). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: los Dres. Rimm y Camp son co-fundadores, accionistas y consultores para una compañía llamada HistoRx que ha licenciado la tecnología para el análisis automatizado de tejidos utilizados en este estudio. Drs. Maira y Hackl son empleados de la empresa Novartis. Esto no altera la adhesión de los autores a todos PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. Sólo en los Estados Unidos, alrededor de 222.520 nuevos casos fueron diagnosticados y aproximadamente 157.300 muertes ocurrieron debido a un cáncer de pulmón en 2010 [1]. Cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa aproximadamente el 80% de todos los cánceres de pulmón. Las histologías más comunes son adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas y carcinoma de células grandes. La mayoría de los pacientes con CPNM se diagnostican en etapa avanzada, donde la quimioterapia puede mejorar la supervivencia y la paliación de los síntomas. Sin embargo, la quimioterapia convencional no proporciona ninguna cura para el CPNM avanzado y ha alcanzado una meseta en la eficacia con una supervivencia media de 8-10 meses [2]. La adición de nuevas terapias dirigidas, como bevacizumab y cetuximab a la quimioterapia convencional ha mejorado la supervivencia media de alrededor de 12 meses en pacientes con buen estado general [3], [4]. nuevos enfoques terapéuticos se necesitan con urgencia para esta enfermedad común.
El fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) /Akt /señalización de la vía impactos muchos aspectos del crecimiento celular y la supervivencia de mTOR [5]. Las alteraciones de los componentes de la vía PI3K /AKT /mTOR pueden ocurrir en muchos niveles y resultan en la activación constitutiva de esta vía y la transformación maligna.
Las PI3K son una familia de enzimas que fosforilan bifosfato de fosfatidilinositol a trifosfato de fosfatidilinositol. PI3K más a menudo se activan por receptor tirosina quinasa (RTK) de señalización, tales como a través de EGFR, IGF1-R y HER2 /neu [6] - [9]. Hay tres clases de PI3K [10], [11]. Clase I
Una PI3K es el tipo más ampliamente implicado en el cáncer y será referido como "PI3K" en el resto de este manuscrito. PI3K es un heterodímero que consiste en una p85 reguladora y una subunidad catalítica de p110.
fosfatidilinositol trifosfato media la activación de AKT [11]. AKT, a su vez, activa muchas proteínas celulares implicados en la síntesis de proteínas, el crecimiento celular y la supervivencia incluyendo mTOR [11] - [13]. mTOR regula la traducción mediante la fosforilación de los componentes de la maquinaria de síntesis de proteínas, incluyendo las proteínas ribosomal S6 quinasa (p70
S6K) y la proteína de unión 4E-(4E-BP). La fosforilación de 4E-BP conduce a la liberación del factor de iniciación de la traducción eIF4E que se ha demostrado para exhibir la transformación y actividades anti-apoptóticos
in vitro
[13], [14]. PTEN PI3K invierte por dephosphorylating fosfatidilinositol trifosfato [15].
En el NSCLC, /AKT señalización PI3K /mTOR es frecuentemente desregulado debido a mutaciones que afectan a uno de sus reguladores aguas arriba, el receptor EGFR y otros componentes dentro de la vía [dieciséis]. Se encontraron componentes de la vía mTOR a mutar en 17 genes y en más de 30% de los tumores de 188 adenocarcinomas de pulmón en el que se realizó la secuenciación del exoma [16]. Los aumentos en el número de copias del gen de
PIK3CA
, el gen que codifica p110α, y los cambios en AKT fosforilada (pAKT) expresión se han descrito en las células epiteliales bronquiales premalignas y NSCLC [17] - [22]. Mientras que las mutaciones en
PIK3CA ¿Cuáles son relativamente poco frecuentes en el cáncer de pulmón,
PIK3CA
copiar el número de ganancia se ha informado en el 33,1% de cáncer de pulmón de células escamosas y en el cáncer de pulmón adeno 6,2% en una serie grande [ ,,,0],23]. PI3K se ha demostrado que mediar la expansión de células madre bronquioalveolar iniciado por oncogénico
K-RAS
[24]. mutaciones tumorales asociados de p110α son oncogénicos
in vivo
en un modelo de ratón de NSCLC [25]. La sobreexpresión de p85 y p110 α se ha demostrado que se correlaciona con escasa diferenciación de los cánceres primarios de pulmón en una cohorte que incluyó 73 casos de NSCLC [26]. Nuestro grupo ha estudiado previamente la expresión de mTOR en cohortes de NSCLC y se encontró una asociación con un mejor resultado [27].
La inhibición de PI3K señalización a través farmacológicos y genéticos enfoques /Akt /mTOR induce efectos antiproliferativos sobre líneas celulares de NSCLC cierta [17] - [21] y en modelos de ratón de cáncer de pulmón [25], [28]. Un número de inhibidores de PI3K están disponibles para la investigación preclínica. compuestos más antiguos, como LY294002 o wortmanina tienen actividad antitumoral en modelos preclínicos, pero su inhibición pobre solubilidad, estrecho índice terapéutico y de cruce de otras quinasas han limitado su aplicación clínica. inhibidores de PI3K más nuevos han entrado en ensayos clínicos de fase temprana, y la actividad de estos agentes deben ser evaluadas con enfermedades que requieren nuevos enfoques, como el NSCLC.
El objetivo de nuestro estudio fue caracterizar la expresión de p85 y p110 subunidades de Clase I
Una PI3K en dos grandes cohortes independientes de muestras de NSCLC y para evaluar la asociación con variables clínicas y patológicas incluyendo la expresión de mTOR publicado anteriormente. Para obtener más precisas, medidas objetivas de expresión, se utilizó un método recientemente desarrollado de análisis automatizado, cuantitativa (AQUA) de microarrays de tejidos [29]. Como activadores redundantes de la vía PI3K /AKT señalización y bucles de retroalimentación negativa [5] limitar la eficacia de las terapias con un solo agente, nuestro siguiente objetivo fue estudiar los efectos de la orientación de la vía de señalización en múltiples niveles en líneas celulares de cáncer de PI3K /AKT. Hemos encontrado que el aumento de la expresión de p85 correlacionada con la supervivencia de los pobres y la etapa avanzada. Expresión de p110α correlacionada con la de mTOR. la inhibición simultánea de PI3K y mTOR resultó en la supresión del crecimiento sinérgico. la inhibición del EGFR Adición de mejora aún más los efectos inhibidores de crecimiento de un inhibidor dual de PI3K /mTOR.
Materiales y Métodos
Microarray (TMA) Construcción
Se obtuvo una NSCLC cohorte Tissue del Lee Moffitt Cancer Center de H. (Tampa, FL). La cohorte Moffitt (MTMA) contiene núcleos de tumores de NSCLC primarios de pacientes diagnosticados entre 1991 y 2001. El tiempo de seguimiento osciló entre 0,8 meses y 146,4 meses, el tiempo medio de seguimiento de 52,3 meses. La edad al diagnóstico osciló desde 40,8 hasta 84,4 (edad media 69 años). La cohorte incluyó 54,5% de hombres y 45,5% mujeres
.
La cohorte de la Universidad de Yale (YTMA), fue construido a partir de bloques de tejido fijado en formol e incluidos en parafina obtenidos del Departamento de Patología de la Universidad de Yale Archivos. Los especímenes fueron resecados entre 1995 y 2003, con un rango de seguimiento entre 0,1 meses y meses 182.25, y un tiempo de seguimiento medio de 41 meses. La edad al diagnóstico oscilaba entre los 21 al 90 (edad media 65 años). La cohorte incluyó a 51% hombres y 49% mujeres.
TMA se construyeron como se describe anteriormente [27]. Dos núcleos de 0,6 mm se obtuvieron de diferentes áreas, representativos de cada muestra NSCLC primario y espaciados 0,8 mm entre sí en portaobjetos de vidrio. pellets de línea celular que consisten en SW480, HT29, A431, MB435, MCF7, BT474, SKBR3 y se utilizaron como controles y fueron incorporados en la matriz, como se describe anteriormente [30]. Las cohortes de MTMA y YTMA se recogieron con la aprobación de las juntas de revisión institucional y se han utilizado en publicaciones anteriores [27], [31].
tinción de inmunofluorescencia
TMA diapositivas fueron teñidas para cada de los dos marcadores objetivo, p85 PI3K y subunidades p110α. La tinción se realizó para AQUA como se describe anteriormente [29] - [31]. Los portaobjetos se incubaron con el anticuerpo primario diluido en solución salina tamponada con Tris que contenía 0,3% albúmina de suero bovino a 4 ° C. Los anticuerpos primarios utilizados para los respectivos incubaciones se monoclonal de ratón anti-humano PI3K p85, clon 4 /PI3-quinasa (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) o conejo anti-humano clon PI3K p110α C73F8 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), en 1:200 o diluciones 1:50, respectivamente. Cualquiera de cabra anti-ratón o de cabra anti-conejo de rábano picante cadena principal de polímero con peroxidasa decorada (Envision, Dako América del Norte, Carpinteria, CA) se utilizó para visualizar la proteína diana. Para crear una máscara tumor, los portaobjetos se incubaron de forma simultánea con el ratón o de conejo anti-citoqueratina en 1:100. Para la visualización de la tinción de citoqueratina una cabra anti-ratón o anti-IgG de conejo conjugado a Alexa 546 (Molecular Probes, Inc.) se utilizó en 1:200. El marcador diana se visualizó con Cy5-tiramida (NED Life Science Products). Los cubreobjetos se montaron con el reactivo Prolong de oro con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) (Invitrogen).
Imagen automáticos de adquisición y análisis (AQUA)
Se analizaron las imágenes utilizando algoritmos que se han descrito [29]. Tumor se distingue de los elementos del estroma de la señal de citoqueratina. La coalescencia de citoqueratina en la superficie celular se utilizó para localizar la membrana celular /compartimento citoplásmico dentro de la máscara tumor, y DAPI se utilizó para identificar el compartimento nuclear dentro de la máscara tumor. Objetivos se visualizaron con Cy5; esta longitud de onda se usa para el etiquetado de destino, ya que está fuera del rango de la autofluorescencia del tejido. Multiple monocromática de alta resolución (1024 x 1024 píxeles, 0,5-m) imágenes en escala de grises se obtuvieron para cada histospot usando el objetivo 10 × de un microscopio de epifluorescencia Olympus AX-51 con platina del microscopio automatizado y adquisición de imágenes digitales impulsado por un programa personalizado y interfaces de macrobased con software IPLabs (Scanalytics, Inc.). Imágenes para cada histospot fueron revisados de forma individual. Dos imágenes fueron capturadas por cada histospot y para cada canal fluorescente, DAPI, Alexa-546, y Cy5; una imagen en el plano de enfoque y un 8 ìm debajo de ella. La compartimentación y la cuantificación de la señal de proteína diana dentro de cada compartimiento de pre-definida para cada histospot se realizó como sigue. En primer lugar, la señal de Alexa-546 que representa la tinción de citoqueratina se utilizó para generar una máscara de células epiteliales que excluye a todos los demás elementos del estroma. Esta señal es binaria cerrada con el fin de identificar si un píxel está dentro de la máscara del tumor (on) o no (OFF); todos los píxeles blancos son parte de la máscara y todos los píxeles negros no son parte de este compartimiento. Del mismo modo, el compartimento nuclear se define como píxeles que demuestran la tinción DAPI dentro del plano de foco y dentro de la región definida por la máscara de tumor. La imagen DAPI también se digitalizan para generar una máscara de todos los núcleos dentro de la muestra restando píxeles superpuestos con la máscara citoplasmática; todos los píxeles blancos son parte de esta máscara, mientras que todos los píxeles negros no son. Para asegurarse de que sólo se analiza la señal de destino en el tumor y no a los elementos que lo rodean, se utilizaron los algoritmos RESA /LUGAR. El algoritmo RESA proporciona un sistema de umbral adaptativo. En general, los tejidos fijados con formalina pueden exhibir autofluorescencia y, a veces análisis puede dar múltiples picos de fondo. El algoritmo RESA establece el pico predominante y a continuación, establece un umbral de máscara binaria en un nivel de intensidad ligeramente superior. RESA elimina toda la información fuera de foco restando un porcentaje de la imagen de fuera de foco de la imagen de enfoque, basado en un análisis píxel a píxel de las dos imágenes. Esto a la larga permite la asignación más precisa de píxeles de compartimientos adyacentes. Por último, utilizamos el algoritmo lugar de asignar a cada píxel de cada imagen en un compartimento subcelular específica. Todos los píxeles que no se pueden asignar con precisión a un compartimiento con un grado de confianza del 95% son en última instancia excluidos. Además, todos los píxeles para los que las intensidades son muy similares en los compartimientos nucleares y de membrana y por lo tanto no se pueden asignar con precisión también excluidos. expresión PI3K se determinó automáticamente a partir de imágenes del canal de Cy5 para obtener la intensidad de pixel relativa de la señal que emana del plano de enfoque. En primer lugar, cada píxel se le asigna a un compartimiento subcelular o se excluye como se describe anteriormente. Una puntuación AQUA para cualquier compartimentos subcelulares se calcula como el promedio AQUA de cada uno de los píxeles individuales incluidos en el compartimento seleccionado; la señal objetivo (p85 o P110α) a partir de los píxeles dentro del citoplasma se normalizó a la zona de la máscara del tumor y anotó en una escala de 0-255 (la puntuación AQUA). Histospots fueron excluidos si la máscara del tumor representa menos del 5% de la superficie total histospot.
Análisis estadístico
JMP versión se utilizó el software 5.0 (SAS Institute, Cary, NC). La importancia pronóstica de los parámetros se evaluó mediante el modelo de riesgos proporcionales de Cox con la supervivencia libre de progresión y la supervivencia global como un punto final. Los análisis de supervivencia univariante fueron representados por el método de Kaplan-Meier. La asociación entre las puntuaciones continuas AQUA y otros parámetros clínicos /patológicos se evaluó mediante análisis de la varianza. Todos los p-valores reportados se basan en pruebas de dos caras importancia. ANOVA y t-test se utilizaron para comparar mediciones continuas.
Líneas celulares y transferencias Western
línea celular de carcinoma espinocelular H2170 y H1650 líneas celulares de adenocarcinoma, HCC2935 y HCC827 fueron amablemente proporcionados por los Dres. John Minna y Michael Peyton (Universidad del Suroeste). líneas celulares de carcinoma escamosas SK-MES-1 y SW900 se obtuvieron de American Type Tissue Culture. Las características de cada línea celular, incluyendo el estado mutacional de
PIK3CA
,
K-RAS
y
EGFR
se muestran en la Tabla S1. Las líneas celulares de adenocarcinoma H1650, HCC2935 y HCC827 tienen de tipo salvaje
PIK3CA
y
K-RAS mutante
pero
EGFR
. Todas las líneas celulares de carcinoma escamosas SK-MES-1, H2170 y SW900 tienen de tipo salvaje
EGFR
y de tipo salvaje
PIK3CA
. SK-MES-1 y tienen H2170 de tipo salvaje
K-RAS
. SW900 tiene mutante
K-RAS
. Estábamos interesados en comparar los efectos de la inhibición de PI3K en el adenocarcinoma de líneas celulares de carcinoma escamoso y comparando con
EGFR mutante
a
EGFR
líneas celulares de tipo salvaje. Todas las líneas celulares de cáncer de pulmón humano se cultivaron en condiciones estándar (37 ° C en 5% de CO
2 atmósfera) y se cultivaron en RPMI (Gibco ™, Invitrogen Corp, Grand Island, NY) suplementado con 10% FBS. línea celular HBE135-E6E7, una línea celular no transformada broncoalveolar, se adquirió de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron en medio libre de queratinocitos de suero suplementado con 5 ng /ml de EGF humano recombinante, 0,05 mg /bovino ml extracto de pituitaria, 0,005 mg /ml de insulina y /ml de hidrocortisona 500 ng.
las concentraciones de proteína de los lisados celulares se calcularon por el BCA (ácido bicinconínico) de ensayo (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Las proteínas (50 g) se diluyeron en un tampón de muestra [2,5% de SDS, 10% de glicerol, 5% β-mercapto-etanol, Tris 50 mM (pH = 6,8) y 0,1% de azul de bromofenol] y se sometieron a dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida electroforesis en gel (SDS-PAGE). Western Blot se realizó por métodos convencionales usando los siguientes anticuerpos anti-humano de conejo primaria: AKT phosporylated (Ser
473), fosforilada p70S6K (Thr
389), PI3K p110α, fosforilada de la proteína ribosomal S6 (Ser
235 /236), PARP (Tecnologías de señalización Celular, Danvers, MA) a 1:1000, y monoclonal de ratón anti-humano p85 PI3K o anti-caspasa-2 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) a 1:1000. Un ratón monoclonal β-actina (A2066 o A5441, Sigma, 1:200 o 1:5000 respectivamente) se utilizó como control para normalizar la carga de muestras. La detección de las proteínas se realizó con anti-ratón o anti-conejo IgG anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (1:5000, Jackson ImmunoResearch Laboratories) y ECL (PerkinElmer).
Agentes antineoplásicos y la viabilidad celular Los ensayos
para los ensayos de viabilidad celular, 1 × 10
3 células se sembraron por triplicado en una placa de microtitulación de 96 pocillos (BD Bioscience) y se dejaron crecer durante 24 horas a una confluencia aproximada del 30%. Para los estudios de inhibición de drogas, NVP-BEZ235 y NVP-BKM120 (Novartis Pharmaceuticals, Basilea, Suiza) y LY294002 (LC Laboratories, Woburn MA) fueron utilizados para el tratamiento de las células pulmonares a diversas concentraciones. Para los experimentos de combinación, el inhibidor de mTORC1, se utilizaron rapamicina y erlotinib inhibidor de EGFR (LC Laboratories).
La viabilidad celular se evaluó a las 72 horas utilizando la celda CellTiter-Glo ™ luminiscente de viabilidad de ensayo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante ( Promega, EE.UU.); Se añadió un volumen igual de reactivo Cell Titer-Glo ™ a los pocillos y después de una incubación de 10 minutos, la luminiscencia se registró usando un lector de placas Victor Multilabel X ™ (Perkin Elmer). El IC
50 valores fueron determinados por el software XLfit (MathIQ versión 2.2.2, IDBS).
sinérgica Análisis de Efecto Farmacológico
El método de análisis de índice de combinación Chou y Talalay se utilizó para analizar los resultados de los experimentos de drogas combinatorias [32]. NVP-BKM120 y LY294002 se utilizaron en combinación con el inhibidor de mTOR, la rapamicina. NVP-BEZ235 se combinó con erlotinib, en sus respectivas solo fármaco IC
50 o IC
25 concentraciones. El IC
50 e IC
25 valores de cada fármaco se obtuvieron por primera vez de los ensayos de viabilidad de un solo fármaco y luego se utilizó para diseñar experimentos de combinación de drogas. El nivel de sinergismo se evaluó en un amplio intervalo de concentraciones de fármaco, centrándose en concentraciones por debajo o en el IC
50 para cualquiera de los fármacos solos. Se analizaron Nuestros resultados para sinérgicos, aditivos o efectos antagónicos utilizando el software Calcusyn (Biosoft, Ferguson, Missouri, EE.UU.). Efecto sinérgico se indica mediante un índice de combinación (IC) de menos de 0,9, efecto aditivo por un CI entre 0,9 y 1,1, y efecto antagonista de CI mayor que 1,1.
Resultados
Expresión de p85 PI3K y subunidades p110á en muestras de cáncer de pulmón humano
en la MTMA, 166 y 190 especímenes eran totalmente evaluable en relación con p85 PI3K y expresión de la subunidad p110α, respectivamente. PI3K no mostró tinción nuclear significativa, ya sea para la subunidad, y por lo tanto sólo se analizó la fracción citoplasmática. patrones de tinción dentro de la máscara de tumor dentro de un histospot fueron altamente homogénea para ambas subunidades. AQUA puntuaciones variaron desde 7,12 hasta 127,04 (media, 37,68; mediana, 33.47) para la subunidad p85, y 5,43 a 138,56 (media, 24,35; mediana, 20.26) para la subunidad p110α. Un ejemplo de AQUA tinción de histospots para p85 y la expresión p110α se muestra en la Figura 1 y la Tabla S2. Histospots se considera un-interpretable si tenían insuficiencia de las células tumorales, la pérdida de tejido en el lugar, o una gran cantidad de tejido necrótico. Las muestras con área del tumor de menos de 5% por punto no se incluyeron en el análisis AQUA.
Anti-PI3K conjugados con Cy5 se utiliza para medir los niveles de PI3K de la subunidad (inferior cuadrantes izquierdos, aumento x 10). Anti-citoqueratina conjugado con Cy3 se utiliza para identificar las células tumorales dentro de la histospot (cuadrantes superior derecha). Los agujeros se rellenan para crear una máscara tumor (cuadrantes inferior derecha). DAPI se utiliza para identificar núcleos (cuadrantes superior izquierda). El compartimiento nuclear dentro de la máscara tumor se resta entonces de la máscara para crear un compartimiento citoplásmico (no mostrado). Los paneles de la derecha son 40 × aumentos de p85 PI3K y p110α subunidad tinción positiva y negativa, respectivamente.
Se evaluó la asociación entre la expresión de PI3K de la subunidad y el subtipo histológico, mediante prueba t no pareada. La expresión de tanto el p85 y las subunidades p110α fueron significativamente mayores en adenocarcinomas que en carcinomas de células escamosas (
P
& lt; 0,0001 para p85 y
P
= 0,0356 para p110α), como se muestra en la figura 2, panel A & amp; B.
Significativamente más alta expresión de la subunidad p85 de PI3K se ve en tumores de adenocarcinoma, en el cáncer de cohortes Moffitt y de la Universidad de Yale de cohortes, respectivamente (Grupo A & amp; C). Significativamente más alta expresión de PI3K de la subunidad p110α en los tumores de adenocarcinoma se ve en el cáncer de cohortes Moffitt y de la Universidad de Yale de cohortes, respectivamente (panel B & amp; D). Las curvas de Kaplan-Meier que muestran una asociación entre la expresión de PI3K de la subunidad y disminución de la supervivencia de p85 (Grupo E), pero no para p110α (Grupo F).
Para validar la asociación entre las subunidades de PI3K y el adenocarcinoma, el YTMA fue empleado. A diferencia de la MTMA que era etapa principalmente I (A y B) cáncer de pulmón (92%), el YTMA incluido% etapa 55 I, y 45% en estadio II-IV (17%, 19% y 9% en estadio II, III , IV respectivamente) cáncer de pulmón. Para el p85 PI3K y subunidad p110α expresión YTMA era interpretable para 163 y 168 ejemplares, respectivamente. El Aqua anota para esta cohorte variaron desde 4,18 hasta 120,73 (media, 35,31; mediana, 32.70) para la subunidad p85, y 9,17 a 86,91 (media, 38,12; mediana, 35.17) para la subunidad p110α. prueba t no pareada confirmó los hallazgos de la MTMA; expresión de la subunidad p85 y la subunidad p110α fueron significativamente mayores en adenocarcinomas que en carcinomas de células escamosas (
P
& lt; 0,0002 para p85 y
P
= 0,0266 para p110α), como se muestra en la figura 2, panel C & amp; D. alta p85 y la expresión de la subunidad p110α correlacionado con la enfermedad en estadio avanzado de la enfermedad (
P = 0,0075
,
P = 0,0093
, respectivamente), pero no con la edad y el sexo (no se muestra).
Por Cox análisis univariado de la supervivencia de las puntuaciones continuas AQUA, se encontró que la expresión de alto p85 se correlacionó con una menor supervivencia (
P = 0,0198
). AQUA proporciona puntuaciones de salida continua, en lugar de las categorías de "alto" o "bajo", según lo determinado por los patólogos que interpretan inmunohistoquímica estándar. Para visualizar la asociación entre las puntuaciones continuas de PI3K y la supervivencia, las puntuaciones AQUA se dicotomizaron por la mediana, lo que refleja el uso de divisiones estadísticas rutinarias en ausencia de justificación subyacente para la división de expresión. Kaplan-Meier de supervivencia se generaron para la expresión de la subunidad p85 de PI3K y la supervivencia y
P
-valores se obtuvieron por el método log-rank de Mantel-Cox. Como se muestra en la Figura 2, panel E & amp; M, que encontró una asociación significativa entre la expresión de p85 alta y baja supervivencia (
P = 0,0075
). No se encontró asociación entre la expresión y la supervivencia p110α.
En el análisis de expresión de p85 multivariante no conservar su valor predictivo independiente, presumiblemente debido a su asociación con el subtipo histológico y el estadio. La única variable asociada con la supervivencia en el análisis multivariante fue escenario (
P
= 0,0000). No se observó ninguna asociación entre la expresión tales p110α subunidad y la supervivencia.
La coexpresión de p85 PI3K o p110á con mTOR en los tumores de pulmón humanos
La asociación entre la expresión de mTOR publicado previamente [27] y p85 y p110α se evaluó subunidades de PI3K. Utilizando el test de correlación de Spearman, la expresión de mTOR se asoció con la expresión p110α (ρ = 0,276,
p = 0,0006
), mientras que no se encontró asociación entre los niveles de mTOR y la subunidad p85.
in vitro
actividad de NVP-BKM120 y LY294002 en líneas celulares de pulmón
Debido a la asociación entre PI3K y etapa avanzada y supervivencia de los pobres, el
in vitro
la actividad de inhibidores de PI3K se estudió en seis líneas celulares de cáncer de pulmón humano. Se utilizaron dos inhibidores de PI3K; estudiamos NVP-BKM-120, un inhibidor de PI3K calidad clínica está siendo desarrollado por Novartis, y LY294002, un compuesto disponible en el mercado que ha sido ampliamente utilizado para estudiar la inhibición de PI3K en el entorno preclínico. Las células se trataron con NVP-BKM120 en concentraciones que van de 0,01 nM a 8200 nM o LY294002 a concentraciones comprendidas entre 6,4 nM a 20.000 nM. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Después de 72 horas de incubación, se evaluó la viabilidad celular, y la IC
50 se calculó para cada línea celular, y un promedio de experimentos repetidos. Como se muestra en la Tabla 1, el IC
50 para NVP-BKM120 LY294002 y la inhibición varió de 716 nM a 1265 nM y 4123 nM a 11925 nM, respectivamente.
Para probar si la inhibición del crecimiento infligida por NVP-BKM120 y LY294002 son específicos o al menos mejorada en maligno en comparación con las células normales, se utilizó una línea inmortalizada, no transformada broncoalveolar celular, HBE135-E6E7. Estas células se derivan de epitelio bronquial normal, tomado de una lobectomía hombre de someterse para el carcinoma de células escamosas [33]. NVP-BKM120 y LY294002 tuvieron poco efecto en las células broncoalveolar normales a concentraciones aproximadamente 10 y 5 veces el promedio IC
50 de estos dos fármacos, respectivamente, en células de NSCLC. la inhibición del crecimiento del 13% se observó a 10 M NVP-BKM120 pero un CI
50 no se pudo llegar a concentraciones más altas, y se obtuvo una mera inhibición del crecimiento del 25% con 50 mM de tratamiento LY294002.
Teniendo en cuenta que los niveles de expresión de dianas de medicamentos a veces predicen la sensibilidad al fármaco, se estudió la asociación entre el grado de sensibilidad /resistencia a la NVP-BKM120 y los niveles de LY294002 y PI3K. Se evaluaron las dos subunidades de PI3K y AKT total y fosforilada por inmunotransferencia. No se encontró asociación clara entre los niveles pretratamiento de PI3K (p85 o p110α) o AKT total y fosforilada y la sensibilidad /resistencia a la NVP-BKM120 o LY294002 (Figura S1).
La sinergia entre PI3K y mTOR inhibidores
resistencia a la inhibición de PI3K se ha observado en diferentes enfermedades y atribuido a numerosos mecanismos. activación de la vía PI3K constitutiva podría ser el resultado de la activación de AKT mTOR-C2 o la activación de mTOR por miembros MAP quinasa vía pesar de la inhibición específica de drogas PI3K. Debido a la co-expresión entre p110α y mTOR visto en nuestros muestras clínicas, se estudió el sinergismo entre la rapamicina mTOR inbitor y NVP-BKM120 y rapamicina y LY294002. Las concentraciones de 1,000 y 500 nM de NVP-BKM120 se combinaron con un intervalo de concentraciones de rapamicina (1, 10 y 100 nM) en seis líneas celulares de NSCLC. La sinergia se observó en cinco de las seis líneas de células en todas las concentraciones de NVP-BKM120 con las tres concentraciones de rapamicina, y en la línea celular sexto (H1650), la sinergia se observó a concentraciones más altas de NVP-BKM120 (Figura 3 y las Tablas S3 y S4). A continuación, estudiamos sinergismo entre LY294002 y rapamicina. Las concentraciones de 5,000 y 2,500 nM de LY294002, se combinaron con un intervalo de concentraciones de rapamicina (1, 10 y 100 nM) en seis líneas de células de pulmón. La sinergia se observó en todos los seis líneas celulares a todas las concentraciones de LY294002 con las tres concentraciones de rapamicina, como se muestra en la Tabla S3. Figura 3 muestra el sinergismo gráficamente, utilizando H2170 y SW900 como un ejemplo. En particular, las diferencias observadas en la viabilidad cuando la adición de 1 nM, 10 nM o 100 nM rapamcyin fueron bastante similares.
Las células se trataron con concentraciones nanomolares descendente del inhibidor de PI3K NVP-BKM120 o LY294002, solo o combinado con 1 nM, 10 nM o 100 nM de rapamicina durante 72 horas y la viabilidad se midió con el ensayo de valoración de la célula Glo. Las barras muestran la viabilidad como porcentaje de células viables con respecto a las células no tratadas. Tres experimentos independientes se realizaron y cada condición se midió en tres pocillos replicados.
Actividad de un doble inhibidor de PI3K /mTOR en líneas celulares de cáncer
Dado el sinergismo observado entre inhibidores de PI3K y rapamicina en líneas celulares de cáncer de pulmón, un inhibidor dual de la PI3K /mTOR que se ha dado a los pacientes con tumores sólidos en la fase I de ensayos clínicos, NVP-BEZ235, se estudió. En todas las líneas celulares de cáncer de seis pulmonares El IC
50 para el compuesto NVP-BEZ235 estaban en el rango nM, mientras que no se observó efecto en las células HBE135-E6E7, incluso a concentraciones tan altas como 1000 nM o veinte veces el promedio de IC
50 observado en líneas de células de NSCLC (Tabla 1). Estos resultados sugieren que el crecimiento de NSCLC y la supervivencia mediada por una amplia gama de factores moleculares son selectivamente sensibles a la inhibición de PI3K por NVP-BEZ235. Objetivos de NVP-BEZ235 (pAKT, pP70S6K y PS6) se determinaron mediante análisis de inmunotransferencia en las células con la exposición al fármaco hasta 24 horas. Cualquier exposición al fármaco más allá de 24 horas dio lugar a gran cantidad de células muertas y los desechos y se habría limitado la interpretabilidad.