Extracto
Antecedentes
altamente sensible y específica para detectar pruebas de la vejiga, ya sea primaria o recurrente basada en la orina cáncer han demostrado ser difícil de alcanzar hasta la fecha. Nuestro conocimiento cada vez mayor de las aberraciones genómicas en el cáncer de vejiga debe permitir el desarrollo de este tipo de pruebas basadas en ADN urinaria.
Métodos
Se extrajo ADN de sedimentos celulares de orina y la PCR para amplificar las regiones de la
de TERT promotor y regiones de
FGFR3
,
PIK3CA
,
TP53
,
HRAS
,
KDM6A de codificación Opiniones y
RXRA
que son frecuentemente mutado en el cáncer de vejiga. Los productos de PCR fueron con código de barras, se agruparon y de extremo emparejado 2 x 250 pb secuenciación realizaron en un Illumina MiSeq. ADN se analizó la orina de 20 controles sin cáncer, 120 pacientes con cáncer de vejiga primario (41 PTA, 40 pT1, 39 pT2 +) y 91 pacientes con cáncer de vejiga después de la TURBT (89) libre de cáncer.
a pesar de las pequeñas cantidades de ADN extraído de algunos sedimentos celulares de orina, el 96% de las muestras dio significar profundidades Read & gt; 500. El análisis de mutaciones puntuales sólo se informó anteriormente,
de TERT
se encontraron mutaciones en el 55% de los pacientes con cáncer de vejiga (independientes de la etapa),
FGFR3
mutaciones en el 30% de los pacientes con cáncer de vejiga,
Hoteles en PIK3CA 14% y
TP53
mutaciones en el 12% de los pacientes con cáncer de vejiga. En general, se detectaron estas mutaciones de cáncer de vejiga previamente reportados en 86 de 122 pacientes con cáncer de vejiga (70% de sensibilidad) y en sólo 3 de cada 109 pacientes con cáncer de vejiga no detectable (97% de especificidad).
Conclusión
Este enfoque simple y rentable podría ser utilizado para la vigilancia no invasiva de los pacientes con cánceres de vejiga no músculo-invasivo que albergan estas mutaciones. El método tiene un bajo requerimiento de entrada de ADN y puede detectar niveles bajos de ADN mutante en un gran exceso de ADN normal. Estos genes representan un panel de biomarcadores mínima a la que se podrían añadir marcadores adicionales para desarrollar una prueba de diagnóstico de alta sensibilidad para el cáncer de vejiga
Visto:. Ward, DG, Baxter L, Gordon NS, Ott S, RS Savage, Beggs dC , et al. (2016) Multiplex PCR y secuenciación de nueva generación para la detección no invasiva de cáncer de vejiga. PLoS ONE 11 (2): e0149756. doi: 10.1371 /journal.pone.0149756
Editor: Francisco X. real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), ESPAÑA
Recibido: 21 Septiembre, 2015; Aceptado: 4 Febrero de 2016; Publicado: 22 Febrero 2016
Derechos de Autor © 2016 Ward et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. El porcentaje del mutante dice estaban utiliza como entrada para todos los gráficos, las sensibilidades, especificidades, etc., y estos se presentan para cada locus en cada muestra en la Tabla S2
Financiación:. Este proyecto fue financiado por un Wellcome Trust sigue -on-subvención fondo administrado por la Universidad de Birmingham. BCPP está financiado por el Cancer Research del Reino Unido, la Universidad de Birmingham y el Birmingham y el País Negro y West Midlands Norte y del Sur Integral Local redes de investigación, y patrocinado por la Universidad de Birmingham. La colección de muestras biológicas BCPP es apoyado por fondos del Birmingham ECMC. GDP es financiado por una donación filantrópica de la Universidad de Birmingham, en apoyo de la investigación del cáncer de vejiga. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Abreviaturas : NGS, la secuenciación de próxima generación; UBC, cáncer urotelial de vejiga; CVNMI, no músculo invasivo cáncer de vejiga; MIBC, músculo-invasivo cáncer de vejiga
Introducción
cistoscopia flexible, combinada con la citología de orina, es el método estándar de oro para la detección de tumores de vejiga. La vigilancia a largo plazo para la recurrencia post-tratamiento es a la vez una carga para los pacientes y costoso para los proveedores de atención médica. Desde hace tiempo se espera que una prueba basada en moléculas liberadas en la orina por las células tumorales podría reducir la dependencia de la cistoscopia, sin embargo, hasta la fecha las pruebas suficientemente sensibles y específicos no se han desarrollado y adoptado por los clínicos [1].
biomarcadores urinarios existentes para el cáncer de vejiga como NMP22 y BTA carecen de sensibilidad para la enfermedad de bajo grado y pueden ser falsamente elevados debido a las condiciones no malignas y hematuria [1]. Grandes esfuerzos se han gastado en el descubrimiento de biomarcadores urinarios para la detección no invasiva del cáncer de vejiga con especial éxito se logra midiendo tumor variantes específicas de ácidos nucleicos [2,3,4]. Recientes experimentos de genómica y transcriptómica han demostrado que el bajo grado CVNMI y la CEI /HG-CVNMI /MIBC tienen la mutación y la expresión génica perfiles distintos y que incluso dentro de la heterogeneidad existe CVNMI considerable (revisado en [5]). Por lo tanto, parece probable que se requiera un panel de biomarcadores que captura la diversidad de la UBC para detectar de forma fiable la enfermedad.
Los análisis de orina sobre la base de ADN muestran una promesa considerable para la detección no invasiva de la UBC. En teoría, si el ADN del tumor está presente, se puede amplificar por PCR y las alteraciones específicas del cáncer detectado. Dos de los genes más frecuentemente mutados en el cáncer de vejiga con puntos calientes de mutaciones puntuales son
FGFR3
[6] y
de TERT
[7,8,9,10]. Ambos han sido evaluados como biomarcadores para la detección de cáncer de vejiga urinaria en el ADN en estudios separados [7,11,12], pero no se han combinado en un ensayo basado en NGS. El
de TERT promotor está mutado en aproximadamente el 65% de los tumores de vejiga independientemente del estadio y grado [13] y representa la mejor biomarcador único para el cáncer de vejiga con un reciente informe de la sensibilidad de 62% a 90% de especificidad para la detección primaria tumores de vejiga [7].
ahora hemos desarrollado un ensayo que usa alta thoughput profunda secuenciación de las regiones de genes asociados 6 UBC que contienen puntos calientes de mutación y analizaron el ADN de orina de 232 pacientes para evaluar su capacidad para no invasiva detectar UBC. Teóricamente, la secuenciación profunda debe detectar de forma fiable incluso niveles muy bajos de ADN tumoral en un gran exceso de ADN no tumoral. Además, esta tecnología está madurando hasta el punto en que se está convirtiendo en un método de rutina en los laboratorios de pruebas genéticas clínicas.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Todas las muestras se obtuvieron después de por escrito el consentimiento informado y aprobación por la ética de investigación nacional del Reino Unido juntas de revisión correspondientes (referencias Servicio nacional de ética de la investigación se establecen a continuación); formularios de consentimiento firmado se llevaron a cabo dentro de los archivos individuales de los pacientes, con el consentimiento documentado en las bases de datos relevantes del estudio.
Los pacientes UBC UBC y no fueron recogidos como parte del Programa El pronóstico del cáncer de vejiga, BCPP (NRES Comité Oriente Midlands- Derby: 06 /MRE04 /65), que incorpora la colección de muestras biológicas para la investigación prospectivo biomarcador
Una segunda recolección de orina (Comité NRES Noroeste-Haydock:. 15 /NW /0079) se llevó a cabo de pacientes sometidos a vigilancia a raíz de TURBT para CVNMI
Los pacientes
se recogió la orina de tres grupos de pacientes:. "no-UBC", "UBC" y "post-UBC '. Los pacientes UBC UBC y no fueron recolectados como parte del programa de la región de West Midlands 'cáncer de vejiga pronóstico, 2005-11 (BCPP, se describe con más detalle en [14]). Brevemente, se recogió la orina medio de la corriente (20 a 50 ml) en el momento del diagnóstico de pacientes con resultados cistoscópicos indicativos de cáncer de vejiga primaria; orina se centrifugó y pellet y sobrenadante se almacenó a -80 ° C. Después de la recogida de muestras, cada paciente se le realizó TURBT y el diagnóstico definitivo mediante examen histopatológico del tejido resecado. Desde vesical primario
carcinoma in situ gratis (CIS) es una lesión poco frecuente en la cohorte BCPP y en otras partes [15], los pacientes con SCA primarias fueron excluidos ya que no tenemos un número suficiente para poder extraer conclusiones válidas. Algunos pacientes reclutados para BCPP y que dieron muestras de orina fueron diagnosticados posteriormente con enfermedades urológicas no malignas, y se incluyen en el estudio como pacientes 'no UBC'.
Por otra parte, una segunda recolección de orina de forma prospectiva a West Midlands durante el año 2012 a partir de un grupo independiente de 91 pacientes sometidos a la vigilancia a raíz de TURBT CVNMI, y utilizando el mismo protocolo de recogida de orina. Con la excepción de 2 pacientes, todos los pacientes estaban en la fecha de recolección de orina (grupo de "post-UBC) libre de enfermedad. Los 2 pacientes con enfermedad recurrente se añadieron al grupo de la UBC. Los datos fueron cistoscopia posteriores disponibles para 38 de los pacientes el 89 'después de la UBC', y no mostraron recidivas posteriores a una media de 8 meses. Se extrajo el ADN a partir de sedimentos de orina usando kits de aislamiento de ADN de orina para células exfoliadas y bacterias (NorgenBiotek.com) y se eluyó en 100 l de agua desionizada.
PCR y códigos de barras
Un único múltiplex de amplificación PCR se utilizó para amplificar amplicones 16 en el
de TERT promotor y las regiones de codificación de
FGFR3
,
PIK3CA
,
TP53
,
HRAS
,
RXRA
y
KDM6A gratis (secuencias de cebador en la Tabla S1). El método de PCR fue adaptado de Allory
et al
[7] como el
de TERT
región promotora es difícil de amplificar y los intentos iniciales usando varias otras polimerasas fallidos. amplificaciones de PCR consistió en 9 l de ADN, 10 l KAPA2G Robust ADN polimerasa (KapaBiosystems) y 1 l de cebadores (0,2 M final para cada cebador). El programa de PCR fue: 95 ° C durante 3 minutos, 35 x 95 ° C durante 15 segundos, 60 ° C durante 15 segundos, 72 ° C durante 15 segundos, seguido de 3 min a 72 ° C (secuencias de los cebadores se proporcionan en información de apoyo, la Tabla S1 ). Los productos de PCR se diluyeron 1/100 con agua desionizada y 10 códigos de barras pb añadido por un segundo ciclo de PCR utilizando 15 KAPA2G Robust ADN polimerasa y los códigos de barras individuales de acceso dirección de matriz para secuenciadores Illumina (Fluidigm).
Secuenciación y análisis de datos
Los productos de PCR con código de barras se mezclaron y se limpian usando perlas AMPure. Los amplicones agrupadas se mezclan entonces 7: 3 con PhiX (iluminación), desnaturalizado y agrupado a las 6 de la tarde de un ciclo de 500-celda de flujo Miseq y secuenciado (250 ciclos hacia delante, 10 ciclos de código de barras, 250 ciclos de marcha atrás). archivos de seguimiento en bruto fueron procesados con cutadapt (versión 1.8.1, Python 2.6.6) en el modo extremo emparejado para eliminar secuencias adaptadoras, y para filtrar los pares con una secuencia & lt; 100 nt para excluir artefactos de lectura cortas. alineamientos locales de lee al genoma hg19 se realizaron con bowtie2 (versión 2.2.4) en el modo extremo emparejado. alineación archivos SAM se convierten en archivos BAM, ordenados e indexados usando samtools (versión 0.1.19). BAM archivos fueron procesados con bam-readcount (https://github.com/genome/bam-readcount), & lt; umbral de calidad mínima de la base establece en 0 | 30 & gt ;, para generar métricas de nucleótidos posición específica dentro de las coordenadas de los loci amplificados. salidas Bam-readcount fueron procesados con un script en Perl escrito personalizado. Las mutaciones se denominan donde estaba presente en & gt una base no es de referencia; 3 lee y a una frecuencia de entre 2,5 a 97,5% en ambas direcciones. Hemos limitado nuestro análisis a las sustituciones de una sola base que han sido registradas en la UBC cósmico.
Sanger de secuenciación
Después de la PCR utilizando los mismos cebadores y las muestras de orina mismos BCPP como para NGS, secuenciación de Sanger en un ABI 3730 secuenciador se realizó para proporcionar una confirmación ortogonal de la presencia y la ausencia de
de TERT
y
FGFR3
mutaciones en 12 y 8 muestras, respectivamente.
disponibilidad de datos
Todos los datos necesarios para la replicación están dentro del manuscrito. Las secuencias de los cebadores de PCR se muestran en la Tabla S1 y hemos usado porcentaje de mutante lee como la entrada para todos los gráficos, las sensibilidades, especificidades, etc, y estos se presentan para cada locus en cada muestra en la Tabla S2.
resultados
Optimización de la secuenciación NGS-amplificación de ADN en la orina
Cuando se prueba de forma individual, los 16 pares de cebadores generaron los productos de tamaño correcto. Los cebadores se combinan y la PCR multiplex probaron en un intervalo de concentraciones de la plantilla (diseñado para imitar la cantidad variable de ADN obtenido a partir de sedimentos de orina): la PCR trabajó con la entrada de ADN más baja ensayada (0,5 ng) y la cantidad de producto generado era independiente de la cantidad de plantilla de ADN entre 2 y 50 ng (50 ng siendo el más alto de entrada probado). En este experimento, la próxima generación de la secuenciación de los productos PCR multiplex dio un promedio de 6000 lee por amplicón; incluso para las muestras que se utilizó menos de 1 ng de ADN, leen profundidades promedio de & gt; 4000 (S1 figura). Titulación del ADN extraído de las líneas celulares de cáncer de vejiga MGH-U3 (
FGFR3
mutante) y SW-780 (
de TERT
promotor mutante) en wtDNA demostró que el porcentaje de mutante lee refleja de manera fiable la porcentaje de ADN mutante reduce a niveles por debajo del umbral de 2.5% usado aquí (Fig S2). Por otra parte, el análisis de ADN de la línea germinal de 6 pacientes sin BCPP UBC demostró una media 'falso positivo' Leer frecuencia de 0,20% ± 0,28 en los loci mutación descrita a continuación.
controles con agua (n = 37) se llevaron a cabo en asignados aleatoriamente pozos junto a las muestras de ADN de orina para la prueba de contaminación que podría generar resultados falsos, en particular para las muestras de orina con bajas concentraciones de ADN. La profundidad media de leer los espacios en blanco de agua fue de 160 (menos de 3% de la media leer la profundidad en las muestras). Las muestras con concentraciones de ADN y bajas produciendo una media leen profundidad de & lt; 500 fueron excluidos del estudio. Esto condujo a la exclusión de 10 muestras de 242 es decir, el ensayo funcionó con éxito en 96% de las muestras. La información del paciente para los 232 pacientes restantes se muestra en la Tabla 1.
NA: no aplicable, NK:. No se conoce
La detección de mutaciones en el ADN urinaria
detectamos 34 se informó anteriormente mutaciones (cósmica) en nuestra cohorte de pacientes. Los detalles de estas mutaciones y leen profundidades en estos loci se muestran en la Tabla S3.
se detectaron mutaciones TERT
promotor en la orina de 67 de los 122 pacientes UBC (55%). Los porcentajes en fase PTA, pT1 y pT2 + UBC fueron 56, 63 y 44%, respectivamente (figura 1).
de TERT
mutaciones también se detectaron 1 de cada 20 pacientes no UBC y en 1 de cada 89 pacientes post-UBC.
de TERT
mutaciones se detectaron también en 2 pacientes de los 2 con UBC recurrente. El porcentaje de lee el apoyo a la presencia de la mutación variado de & lt; 5% a & gt; 50% lo que indica que la relación de tumor a ADN normal en la orina es bastante variable. La detección correcta de los
de TERT
mutaciones se confirmó mediante secuenciación de Sanger en varios pacientes con & gt; 40% lee mutante (Figura 2)
El gráfico muestra el porcentaje de mutante lee en cada paciente. la muestra teniendo en cuenta las mutaciones puntuales en las posiciones CHR5: 1295228, CHR5: 1295242/1295243 y CHR:. 1295250
el panel a es una captura de pantalla del IGV que muestra la proporción de mutantes (verde) y en peso (marrón) de base pide tres ADNs urinario (que rodean la secuencia peso en gris). secuenciación de Sanger de los mismos tres ADNs urinarios se muestra en los paneles B: muestra de 661 (CHR5: 1295250 G & gt; A), C: muestra de 857 (5: 1295228 G & gt; A), y D: muestra de 576 (CHR5: 1242 & amp; 243 G & gt;. a)
las mutaciones en
FGFR3
fueron detectados en 36 ADNs urinarios de pacientes con UBC (30%) y con la frecuencia más alta de CVNMI (porcentajes en fase PTA, pT1 y pT2 + UBC eran 41, 30 y 15%, respectivamente (Fig 3)).
FGFR3
mutaciones también se encontraron en 1 paciente post-UBC, y en 1 de los 2 pacientes con UBC recurrente. Al igual que con
de TERT, las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación de Sanger en varias muestras con un alto porcentaje de mutante lee (datos no mostrados).
pacientes individuales se enumeran a lo largo del eje x como se indica y la frecuencia de mutantes lee en loci cómico se muestra para cada individuo.
las mutaciones en
PIK3CA
se encuentra en la orina de 17 pacientes con UBC (14%) a través de todas las etapas de enfermedad (porcentajes en fase PTA, pT1 y pT2 + UBC fueron 12, 18 y 10, respectivamente). Un
PIK3CA
mutación se encontró en la orina de un paciente después de la UBC. Las mutaciones en
TP53
fueron encontrados en la orina de 15 pacientes con UBC (12%) con la frecuencia más alta de MIBC (porcentajes en fase PTA, pT1 y pT2 + UBC were5, 13 y 21%, respectivamente. Las mutaciones en
RXRA
,
HRAS
y
KDM6A
fueron detectados en la orina de 7, 1 y 0 pacientes con UBC, respectivamente. Todas las sustituciones eran no sinónimo excepción de 1 en
FGFR3
y los del
de TERT promotor. la lista completa de las mutaciones detectadas en el estudio se muestra en la Tabla S2. en total, 145 mutaciones se detectaron en 122 pacientes UBC y 4 de cada 110 pacientes sin la actualidad detectable UBC.
Utilizando mutaciones en el ADN de orina para detectar UBC
la distribución de las mutaciones en los pacientes UBC en este estudio se muestra en la figura 4. Si se utiliza la presencia de uno o más para la detección de mutaciones UBC, a continuación,
de TERT es el más informativo (67 cánceres detectados), con
FGFR3
la detección de otros 12 casos,
RXRA
un adicional de 3 casos, y
TP53
y
PIK3CA
cada detectar 2 casos adicionales. Este enfoque detecta 86 casos de cáncer de 122, con mutaciones detectadas en 3 de cada 109 pacientes sin UBC (70% de sensibilidad y 97% de especificidad). Esta "prueba" es la etapa agnóstico con sensibilidades de 70, 70 y 69% de la ATP en el escenario, pT1 y pT2 + UBC, respectivamente. Las mutaciones se detectaron en un número equivalente de grado 1 y 2 tumores (72%) en comparación con los tumores de grado 3 (68%), y no hay relación aparente entre el tamaño del tumor o el número del tumor y la exactitud de la prueba (S3 Figura y la Tabla S4, respectivamente). Si el umbral de la prueba se aumenta a requerir mutaciones en genes 2 para indicar la presencia de UBC, la sensibilidad disminuye marcadamente a 34%, pero la especificidad aumenta a 100%.
Cada columna representa un paciente individual. representación Oncoprint genera en http://www.cbioportal.org/.
Discusión
En este estudio hemos demostrado que las mutaciones en múltiples genes pueden ser fácilmente detectados en orina usando ADN un enfoque basado en PCR y NGS. Aunque estudios previos han utilizado para analizar NGS
FGFR3
mutaciones en el ADN urinaria [16] y analizar
TERT promotor
mutaciones en el ADN urinaria [17], hemos desarrollado ahora un método que permite un único análisis para medir ambos biomarcadores urinarios y otros. Es posible multiplexar cientos de muestras para una única ejecución de secuenciación, por lo que el coste-efectiva cuando las muestras se analizaron en lotes de ensayo: & lt; 5 USD /Euros costo secuenciación por prueba (en el momento de la escritura). Por lo tanto, para lograr bajos costos y tiempos de entrega cortos, muestras tendrían que enviarse a un laboratorio central de pruebas; dicha infraestructura ya existe en el Reino Unido y en otros lugares. NGS permite la detección de un pequeño número de moléculas de ADN tumorales diluido en un exceso de ADN no tumoral, que no se consigue fácilmente con métodos de secuenciación análogo o enfoques específicos tales como Snapshot y MassArray. Queda por ver si la capacidad de identificar niveles muy bajos de ADN tumoral es ventajoso en la configuración de vigilancia, ya que es probable que los tumores que son demasiado pequeños para detectar o tratar liberar suficiente ADN mutante para devolver un resultado positivo ( "diagnóstico anticipatoria ' [7]). En nuestro estudio de los tumores primarios, el porcentaje de
de TERT
y
FGFR3
lee que contiene mutaciones variaron de forma continua desde indetectable a & gt; 50% del total lee. Aunque altamente variable entre los individuos, en promedio en los pacientes UBC donde se detectó una mutación, el 20% de las lecturas fueron el alelo mutante que sugiere que aproximadamente el 40% del ADN sedimento celular urinaria se origina en el tumor, incluso en pTa UBC.
a pesar de
de TERT
y
FGFR3 ¿Cuáles son muy buenos biomarcadores para UBC debido a la alta prevalencia y la concentración de la mutaciones puntuales en puntos de acceso, las mutaciones en otros genes mutados en común de cáncer de vejiga no están agrupadas de tal manera [18], y son por lo tanto más difícil de detectar, mucho más ADN tiene que ser secuenciado tal que PCR y secuenciación errores, y alteraciones específicas de cáncer de vejiga, no pueden dar resultados falsos positivos. Por lo tanto, aunque se requerirá un panel de marcadores múltiples para la detección de enfermedades de alta sensibilidad (un más amplio panel de lo que hemos evaluado inicialmente aquí), el panel no debe ser mayor de lo absolutamente necesario, debe utilizar métodos con tasas de error muy bajo, y puede requerir paralelo la secuenciación del ADN de la línea germinal. El
de TERT promotor es muy rica en GC y fue difícil para amplificar con varias polimerasas diferentes hasta que se utilizó KAPA2G (tanto para la amplificación de la diana y la incorporación de código de barras).
Uno de los resultados más significativos reportados aquí es que el ensayo funcionó para 96% de las muestras de orina, e incluso en muestras en las que la cantidad de ADN extraído de los pellets de orina es demasiado bajo para cuantificar por medios convencionales (& lt; 1 ng). Las 10 muestras que no dan la suficiente profundidad de lectura todos tenían concentraciones muy bajas y eran de pacientes sin enfermedad detectable o UBC PTA. Para mayor facilidad, al analizar muchas muestras que sólo se utiliza 9 ul del 100 ul de ADN extraído de entre 30-50 ml de orina en lugar de concentrar las muestras más diluidas y por lo tanto debemos ser posible mejorar la tasa de éxito en el futuro mediante la recopilación de más orina y eluyendo el ADN en un volumen más pequeño. Muchos ensayos, tales como las que requieren la conversión de bisulfito, fallarían en muchas más de las muestras con bajo contenido de ADN. Otro resultado importante es la muy alta especificidad de nuestro panel de mutaciones, lo que puede hacer esta "prueba" específico útil en algunos escenarios a pesar de la modesta sensibilidad; sin embargo, más probable será adaptado nuestro enfoque para mejorar la sensibilidad. El tercer resultado importante es la detección de un 70% de los tumores (PTA con alta especificidad frente a los controles en el mundo real), que parece superior a la mayoría de los biomarcadores reportados hasta la fecha.
aceptar una serie de limitaciones a este estudio. En primer lugar, la sensibilidad global de c.70% es considerablemente inferior a la sensibilidad c.90% de cistoscopia flexible [19]; por lo tanto, tendría que ser refinado (lo más probable mediante la adición de más mutaciones y sus amplicones) antes de que pudiera ser considerada como un complemento o sustitución, ya sea para la cistoscopia de diagnóstico o de vigilancia de esta prueba no invasiva. En segundo lugar, dada la prevalencia (frente incidencia) de CVNMI, el uso de una prueba de este tipo es más clínicamente relevante para la detección de recidiva en el entorno de vigilancia; sin embargo, hay que señalar que los casos de nuestro estudio son predominantemente UBCs incidentes y que los tumores recurrentes puede ser más difícil de detectar [20]. Finalmente, la mayoría de las 110 muestras de "control" utilizados para evaluar la especificidad se obtuvieron de una cohorte independiente de pacientes sometidos a vigilancia CVNMI ( "post-UBC ', n = 89), aunque las muestras de la 20' no UBC 'de la BCPP estudio representan los sujetos que tenían síntomas indicativos de la UBC (predominantemente hematuria), pero que se encontraban en una mayor evaluación urológica libre de cáncer. futuros estudios de validación se esforzarán para obtener muestras de orina longitudinales de una sola cohorte de pacientes, desde el primer diagnóstico a través de la vigilancia, y para comparar o evaluar la combinación de análisis de la mutación NGS con la citología de orina.
Conclusiones
Hemos analizado con éxito múltiples mutaciones asociadas a la UBC en el ADN precipitado celular orina por NGS. El método funciona bien en casi todas las muestras de orina, incluso aquellos de los que sólo es posible extraer unos pocos nanogramos de ADN. La sensibilidad de nuestro panel mutación seleccionada para la detección de UBC fue de aproximadamente 70% a través de todas las etapas de la UBC y los genes seleccionados debe ser incluido en cualquier panel de biomarcadores basados en ADN para la detección de cáncer de vejiga, pero marcadores genéticos o epigenéticos adicionales [7,11, 12,21,22] puede ser necesaria para una prueba de aplicación universal.
Apoyo a la Información
S1 Fig. La dependencia de la PCR-NGS se traduce en la cantidad de ADN de entrada
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149756.s001 gratis (PPTX)
S2 Fig. La detección de niveles variables de mutación
FGFR3
y
de TERT
ADN en un exceso de wtDNA.
Cada gráfico muestra los resultados de PCR-NGS análisis de una serie de diluciones de 2 veces de ADN mutante
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149756.s002 gratis (PPTX)
S3 Fig. Oncoprint representación de las mutaciones detectadas en el ADN urinaria en pacientes con grado 1 & amp; grado 2 y grado 3 UBC UBC
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149756.s003 gratis (PPTX)
Tabla S1. Las secuencias de cebadores para la PCR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149756.s004 gratis (XLSX)
Tabla S2. . La aparición de mutaciones en el ADN urinaria
datos se presentan como porcentaje del mutante lee en cada locus
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149756.s005 gratis (XLSX)
S3 Tabla. Resumen de las coordenadas de mutación, las consecuencias y leer profundidades
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149756.s006 gratis (XLSX)
S4 Tabla. Resumen del tamaño del tumor y la multiplicidad y la exactitud de la prueba
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149756.s007 gratis (XLSX)
Reconocimientos
gracias a todo el Consultor West Midlands urólogos y sus unidades involucradas con BCPP, así como las enfermeras de investigación BCPP y Margaret Grant, Deborah Bird, Jennifer Barnwell, Duncan Nekeman y Eline van Roekel. BCPP está financiado por el Cancer Research del Reino Unido, la Universidad de Birmingham y el Birmingham y el País Negro y West Midlands Norte y del Sur Integral Local redes de investigación, y patrocinado por la Universidad de Birmingham. La colección de muestras biológicas BCPP es apoyado por fondos del Birmingham ECMC. Este proyecto fue financiado por una subvención de continuación de fondos de Wellcome Trust, administrado por la Universidad de Birmingham. GDP es financiado por una donación filantrópica de la Universidad de Birmingham, en apoyo de la investigación del cáncer de vejiga.