humano
Extracto
La aplicación potencial de etiquetado punto cuántico multiplexado (MQDL) para la detección del cáncer y el pronóstico y el seguimiento de las respuestas terapéuticas ha atraído el interés de los bioingenieros, patólogos y biólogos del cáncer. Muchos estudios publicados afirman que MQDL es eficaz para la detección de biomarcadores de cáncer y útiles en el diagnóstico y el pronóstico del cáncer, estos estudios no han sido estandarizados de las determinaciones bioquímicas y moleculares cuantitativos. En el presente estudio, se utilizó un modelo de células de cáncer de próstata humano caracterizado molecularmente exhibiendo activa c-Met señalización con la transición epitelial a mesenquimal (EMT) y la progresión metastásica letal para los huesos y los tejidos blandos como el estándar de oro, y comparamos la-Met c celular red de señalización en este modelo, en muestras de tejido de cáncer de próstata humanos clínicos y en un modelo de xenoinjerto de cáncer de próstata humano resistente a la castración. Observamos c-Met señalización de activación de la red, que se manifiesta por un aumento de fosforilados c-Met en los tres. La red de señalización de supervivencia aguas abajo fue mediada por NF-kB y MCL-1 y EMT fue impulsado por activador del receptor de NF-kappa B ligando (RANKL), en el nivel de células individuales en muestras de cáncer de próstata clínicos y el modelo de xenoinjerto. Los resultados se confirmaron por tiempo real de RT-PCR y transferencias de Western en un modelo de células de cáncer de próstata humano. MQDL es una poderosa herramienta para evaluar la expresión de biomarcadores y ofrece una visión molecular en la progresión del cáncer, tanto a nivel celular y tisular con alto grado de sensibilidad
Visto:. Hu P, Chu GC-Y, Zhu G, Yang H, Luthringer D, Prins G, et al. (2011) multiplexado Quantum Dot Etiquetado de c-Met activado Señalización en el cáncer de próstata resistente a la castración humana. PLoS ONE 6 (12): e28670. doi: 10.1371 /journal.pone.0028670
Editor: G. Dean Tang, la Universidad de Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Octubre, 2011; Aceptado: 12 Noviembre 2011; Publicado: December 21, 2011
Derechos de Autor © 2011 Hu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado por becas de investigación y 2PO1CA098912 1RO1CA122602 de los Institutos nacionales de la Salud Instituto de cáncer /Nacional y Premio del cáncer de próstata desafío de la fundación (LWK Chung). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
semi-conductor de puntos cuánticos (QD) nanopartículas fluorescentes han sido reconocidos como uno de los grandes avances recientes de nuestra capacidad para detectar biomarcadores relevantes expresados por células, tejidos y sueros [1], [2], [3 ], [4], [5]. Las propiedades ópticas y electrónicas únicas de los puntos cuánticos incluyen sus bandas estrechas y simétricas de emisión, la emisión de luz reducción de tamaño y material sintonizable, alta relación de superficie a volumen, fotoestabilidad, el brillo de la señal y la sensibilidad, y la excitación simultánea de múltiples colores de fluorescencia por lo que es posible detectar múltiples objetivos simultáneamente en el nivel de células individuales [3], [6]. etiquetado de puntos cuánticos, QDL, es superior a los colorantes orgánicos convencionales para celular y tinción de tejidos, especialmente desde el amplio ancho de banda de esta última con la superposición de rendimiento de emisión de las señales y son altamente susceptibles a photobleaching. biomarcadores de multiplexación con diferentes colores ofrece ventajas significativas sobre los colorantes orgánicos o fluorescentes tradicionales para la detección y el análisis de los cambios dinámicos en proteínas y ácidos nucleicos en células o tejidos en condiciones fisiopatológicas. QDL se ha aplicado con éxito para detectar los niveles de expresión de los genes
In situ
asociada a los procesos biológicos importantes, como la transición epitelial a mesenquimal [6] en la metástasis del cáncer [7], biomarcadores de proteínas en la sangre, la presencia de los ácidos nucleicos, los microARN y la metilación del ADN en los sueros o tejidos con extractos de muestras con código de barras para el procesamiento rápido de los protocolos automatizados [8], [9], [10]. En el presente estudio, hemos empleado multiplexada etiquetado punto cuántico (MQDL) para detectar la vía de señalización celular mediada por c-Met activado conduce a EMT, el crecimiento del cáncer y el hueso y la metástasis de tejido blando en un modelo de metástasis de cáncer de novela de próstata [11], [ ,,,0],12], [13]. Se confirmó los niveles de expresión de genes evaluados por MQDL con la expresión de genes como se determina por RT-PCR y transferencias de Western. A continuación se aplica el protocolo MQDL para determinar si la vía de señalización de células c-Met y EMT se activan en un cáncer de próstata (CRPC) modelo animal resistente a la castración y en muestras de cáncer de próstata clínicos obtenidos de pacientes con altas puntuaciones de Gleason y la metástasis ósea. Hemos observado que la activación de c-Met está estrechamente ligada a la EMT en las células cancerosas y su posterior migración aumentado, invasión y metástasis [14], [15], [16]. c-Met activación de la señal en el cáncer de próstata humano tiene importantes implicaciones clínicas: 1) aguas abajo de señalización de c-Met impulsa EMT y migración de las células del cáncer, invasión, metástasis y la supervivencia en varios modelos de tumores sólidos humanos, incluyendo el cáncer de próstata [15], [17], [18], [19]. 2) Dado que la orientación c-Met y la señalización aguas abajo VEGFR2 con un inhibidor de la tirosina quinasa múltiple sintético, cabozantinib (XL-184), dio lugar a notable resolución de las metástasis óseas y tejidos blandos en un gran número de pacientes con tumores sólidos, incluyendo pacientes CRPC [20 ], [21], sería importante mostrar si estas vías de señalización celular podría ser activado en muestras clínicas como en modelos de xenoinjerto de tumor pertinentes. Se utilizó una línea celular de cáncer de próstata humano para demostrar que la activación de c-Met confiere el cáncer de próstata EMT y metástasis ósea y de tejidos blandos e investigó en profundidad la señalización de la activación de c-Met mediante análisis molecular con resultados confirmados por MQDL. a continuación, se emplearon MQDL para evaluar la activación de señalización de c-Met en muestras de tejido de cáncer de próstata clínico y correlacionaron los resultados con un modelo de xenoinjerto de cáncer de próstata resistente a la castración humana. Demostramos que MQDL, junto con Vectra análisis de imágenes, mejora la capacidad de perfiles cuantitativa de biomarcadores individuales a nivel de células individuales. Una serie de biomarcadores asociados con la EMT, tales como disminución de la expresión de EpCAM, y el aumento de la expresión de N-cadherina, vimentina y RANKL, y la activación de la señal de c-Met, incluyendo VEGF, neuropilina 1, PC-Met y fosfo (p) -NF p65 -κB [15], [22], se analizaron. Los resultados de estos estudios mostraron una notable paralelismo de EMT y la activación de c-Met entre el modelo de células de cáncer de próstata, el modelo de xenoinjerto CRPC y especímenes de cáncer de próstata clínico. Las metodologías establecidas en el presente estudio podrían ser de gran valor en un futuro próximo para caracterizar otras vías de señalización activadas en muestras clínicas, interrogar a los mecanismos moleculares progresión del cáncer subyacente, identificar objetivos druggable, y dar seguimiento a la respuesta clínica de los pacientes para la intervención terapéutica.
Materiales y Métodos
cultivo de células y transfección celular
la línea celular LNCaP, proporcionado amablemente por el fallecido Dr. Gary Miller, de la Universidad de Colorado (Denver, CO), fue cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con 5% de suero bovino fetal (Atlanta Biologicals Lowrenceville, GA), penicilina (100 mg /ml) y tetraciclina (100 u /ml) a 37 ° C en atmósfera humidificada con 5% de CO
2. El establecimiento de clones que sobreexpresan la proteína RANKL se informó anteriormente [23]. Brevemente, un ADNc de longitud completa que codifica RANKL humano de OriGene (Rockville, MD) se clonó unidireccionalmente a p3 × FLAG- myc-CMV-25 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a los sitios de enzimas de restricción NotI y XbaI. Después de la transfección de las células LNCaP a 75% de confluencia con RANKL bandera de etiquetado y el plásmido neo usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en una placa de 6 pocillos durante 48 h, las células se tripsinizaron y se sembraron en una placa de 15 cm. Las células LNCaP-neo y LNCaP-RANKL estables se sometieron a selección con G418 (400 mg /ml) y los clones de células individuales se aislaron y se mantuvieron en 200 mg /ml de G418 para el ARN y la extracción de proteínas y de inmunoensayo utilizando cámaras de 8 pocillos diapositivas (Thermo científica, Rochester, NY). Se seleccionaron tres LNCaP-RANKL y 2 clones de células LNCaP-neo. Desde sus fenotipos bioquímicos fueron similares se utilizó un clon de cada uno para el estudio.
transcriptasa reversa (RT) PCR
ARN total a partir de células fue aislado utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen Sciences, Inc. ; Germantown, MD) según las instrucciones del fabricante. ADN complementario (ADNc) se genera a partir de 3 g de RNA total utilizando el Sistema de Síntesis Superscript® III First-Strand (Invitrogen; 1 l de cDNA se sometió a análisis de PCR usando los siguientes cebadores: RANKL F, 5'-TGG ATC ACA GCA CAT CAG CAG AG-3 '; RANKL R, 5'-GGC TGG TCA ATC TAT ATC TCG AAC-3'; E-cadherina F, 5'-CCG AAG CAG CAG TAC ATT CTA CAC G-3 '; E-cadherina R , 5'-GCT GTT CTT CAC GTG CTC AAA ATC C-3 '; N-cadherina F, 5'-GAT GTT GAG GTA CAG AAT CGT; N-cadherina R, 5'-GGT CGG TCT GGA TGG CGA-3' ; vimentina F, 5'-GGA CTC GGT GGA CTT CTC; vimentina R, 5'-CGC ATC TCC TCC TCG TAG-3 ', c-Met F, TGGGAATCTGCCTGCGAA;. c-Met R, CCAGAGGACGACGCCAAA Los ciclos de reacción de PCR implicó una desnaturalización inicial a 94 ° C durante 10 min, 36 ciclos de 94 ° C, 1 min, 55 ° C, 30 seg; para RANKL72 ° C, 1 min seguido de un final de 72 ° C para la extensión de 10 min para E-cadherina. y la amplificación del gen N-cadherina, las reacciones de PCR corrió durante 32 ciclos y las temperaturas de recocido eran 55 ° C y 47 ° C, respectivamente para 30 seg. para la amplificación vimentina y GAPDH, las reacciones de PCR corrió durante 28 ciclos con temperaturas de recocido a 48 ° C durante 30 seg. Los productos de PCR amplificados se detectaron y se analizaron en gel de agarosa al 1%
análisis de transferencia de Western
Las células se lisaron en tampón RIPA que contenía 1 × cóctel inhibidor de la proteasa (Thermo Fisher Scientific; Rockford, IL). y se centrifugaron, y se recogieron los sobrenadantes y se cuantificaron usando el ensayo de proteínas Bradford (Thermo Fisher Scientific). Los lisados celulares (20 a 30 g) se resolvieron en un 4-12% Bis-Tris gradiente de SDS-PAGE (Invitrogen; Carlsbad, CA) en condiciones reductoras, seguido de transblotting a una membrana de nitrocelulosa (BioRad Laboratories; Hercules, CA), y se bloquearon en 5% de leche no grasa /PBST durante una hora a temperatura ambiente (RT) y se incubaron con diluidas Abs primarios en tampón de bloqueo a 4 ° C durante la noche. La fuente y la dilución de Abs primaria fueron: RANKL (sc-74261; 1:400), E-cadherina (sc-7870; 1:1000), vimentina (sc-6260; 1:500), c-Met (SC- 10; 1:500) (Cruz de Biotecnología de Santa; Santa Cruz, CA), N-cadherina (# 610920; 1:200) (BD transducción Laboratories, San José, CA y Santa Cruz Biotechnology), p-Met (Tyr-1230 /34/35) (# 44888G; 1:500) (Invitrogen), p-p65 NF-kB (Ser536) (# 3033; 1:1000), NF-kB p65 (# 4764; 1:1000) (Cell Signaling tecnología, Danvers, MA). Producción y uso de anticuerpos del receptor de andrógenos (PG21; 1:500) se informó anteriormente [24]. Las membranas se lavaron 3 veces con PBST, se incubaron con conjugados con peroxidasa anti-ratón o Abs secundario anti-conejo a TA durante una hora y se lavaron 3 veces con PBST. Las señales se visualizaron usando el reactivo ECL Plus (GE Healthcare Biosciences; Pittsburg, PA). Restore Plus Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher Scientific) se utilizó antes de volver a sondear con diferentes Abs.
Experimentos in vivo
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por la Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC#2999, el Cedars-Sinai Medical Center, y A10-0100, Universidad de British Columbia). LNCaP-RANKL y células LNCaP-neo (1 × 10
6 células /50 l de PBS) se inocularon por vía intracardiaca en de 5 a 7 semanas de edad, atímicos ratones desnudos macho (Charles River, n = 20 para LNCaP-RANKL y n = 15 para LNCaP-neo). Todos los ratones fueron monitorizados regularmente para detectar la formación de tumor metastásico que por primera vez se produjo a las 8 semanas. Los animales fueron sacrificados a las 12 semanas.
muestras de tejido cáncer de próstata
Fijado en formol e incluido en parafina (FFPE) muestras de cáncer de próstata humano se obtuvieron a partir Departamento de Patología del Cedars-Sinai Medical Center (# 00021228 Pro IRB). muestras de tejido de cáncer de próstata clínicos adicionales se obtuvieron del Dr. Fouad Habib en la Universidad de Edimburgo, Escocia, y el Dr. Hua Yang de la Universidad de Jilin, China. El uso de muestras clínicas fue aprobado por los comités institucionales de revisión de tejidos humanos en las instituciones respectivas.
xenoinjertos CRPC
Para establecer protocolos de trabajo para el etiquetado QD múltiple único y secuencial, se optó por utilizar un LTL -313 modelo de xenoinjerto CRPC, puesto que posee el cáncer de próstata resistente a la castración y proporciona múltiples muestras de tejido consistente y fácilmente disponibles críticos para el desarrollo y establecimiento de un nuevo protocolo MQDL. tejidos FFPE de un cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) LTL-313 (Living Laboratorio de Tumores, www.livingtumorcentre.com) modelo de xenoinjerto se obtuvieron de Vancouver Centro de Cáncer, BC Cancer Agency, Vancouver, Canadá. La línea tumoral LTL-313 fue desarrollado a partir de muestras de biopsia con aguja de próstata de un paciente de 80 años diagnosticado de cáncer de Gleason 8 de próstata con un nivel de PSA en suero de 17 ng /ml en el momento del diagnóstico [25]. El protocolo de desarrollo de la línea tumoral fue aprobado por la Clínica Junta Ética de Investigación de la Universidad de la Columbia Británica, de conformidad con las Directrices de Animales de Laboratorio del Instituto de Ciencias Experimentales de animales (uso espécimen humano estaba con las aprobaciones de la Universidad de la Columbia Británica, Canadá (IRB#UBC BCCA REB#H04-60131). en pocas palabras, para establecer el cáncer de próstata resistente a la castración, frescos tejidos tumorales LTL-313 de la 5ª generación de injerto se cortaron en trozos de 3 x 3 x 1 mm y re-injertados en las cápsulas subrenales de ratones NOD-SCID masculinos. los animales se mantuvieron durante la formación de tumores durante dos meses antes de la castración para eliminar los andrógenos. Tres semanas después de la castración, cuando el volumen del tumor se redujo significativamente, los tejidos tumorales restantes se recogieron y se prepararon como bloques de tejido FFPE. Xenongraft tejidos utilizados en este estudio se obtuvieron a partir de 9 tumores de los ratones castrados y 5 tumores de 5 hosts de ratón intactas suplementado con testosterona que se habían sometido a operación simulada.
reactivos de inmunoensayo
Los anticuerpos primarios (Abs) y sus fuentes fueron: Abs monoclonales de ratón para EpCAM humano (VU-1D9) y RANKL (12A668) de Novus Productos Biológicos (St. Charles, MO); Ab monoclonal de ratón para c-Met (25H2) y de conejo Ab monoclonal a E-cadherina (24E10) de Señalización Celular Tecnología; Ab policlonal de conejo al receptor de andrógenos, AR, (PG 21), proporcionado por el Dr. Gail Prins de la Universidad de Illinois (Urbana, IL); policlonal de cabra Ab a neuropilina-1 (C-19), policlonal de conejo Abs a N-cadherina (H-63), MCL-1 (S-19), p-NF-kappa B p65 (Ser 536), y VEGF (A -20) de Santa Cruz Biotechnology, Inc .; y Ab policlonal de conejo a la p-c-Met (pYpYpY1230 /1234/1235) de Invitrogen. Abs secundarios utilizados en el estudio se prepararon en un cóctel de Abs biotinilado a ratón, conejo, y IgG de cabra (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Los puntos cuánticos de fosfato-solución salina tamponada (PBS) y estreptavidina conjugada a 565-, 585-, 605-, 625- longitudes de onda, 655- y 705 nm como 1 M solución madre se adquirieron de Invitrogen.
inmunohistoquímica (IHC ) tinción
IHC siguió el protocolo publicado [26], con modificaciones menores. FFPE secciones (4 M) se deparaffinized, rehidratada, y se someten a la recuperación de antígenos. Después de incubar en solución Dual endógena Enzyme Block (Deeb, Dako, Carpinteria, CA) durante 10 minutos, la sección se trató con anticuerpo primario diluido con solución Antibody Diluent (Dako) como sigue: RANKL (1:100), c-Met ( 1:50), neuropilina 1 (1:100), receptor de andrógenos (1:200), N-cadherina (1:100), MCL-1 (1:100); p65 p-NF-kB (Ser536) (1:100), VEGF (1:50) y PC-Met [pYpYpY1230 /1234/1235] (1:100), vimentina (1:100), y E-cadherina ( 1:200) a 4 ° C durante la noche. A continuación, la sección se lavó 3 veces en PBST (PBS que contiene 0,2% de Tween 20) durante 5 minutos por lavado. Para detectar la tinción específica, la sección se trató durante 30 minutos con EnVision
+ Dual Link System-HRP (Dako), que contenía anticuerpos de cabra peroxidasa de rábano picante conjugado con ratón y conejo Ig. La sección se lavó 3 veces durante 5 minutos cada uno, y las manchas específicas se han desarrollado con 3,3-diaminobencidina (Dako).
Individual QD Etiquetado (SQDL)
El protocolo de tinción IHC era modificada para el etiquetado QD solo. Los puntos cuánticos conjugados con estreptavidina (565-, 585-, 605-, 625-, 655- y 705 nm) se prepararon como 10 nM en PBS con conexión-IgG 6%, libre de proteasa BSA (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA) . Antígeno recuperada tejidos o muestras de células fijadas se incubaron en PBS que contenía 2,5% de suero de caballo (Vector Laboratories) y 20% de estreptavidina bloque de reactivo (Invitrogen) durante 20 minutos, seguido de tratamiento con Abs primarios como se describe anteriormente en la sección inmunorreactivos anteriores en PBS más 1% de suero de caballo y 20% biotina bloque de reactivo (Invitrogen) a 4 ° C durante la noche. Después de un min PBST 3 × 5 (PBS + 0,4% de Triton X-100) muestras de enjuague se incubaron con el cóctel de Ab secundario a temperatura ambiente durante 30 min y después se incubaron con el respectivo estreptavidina-QD a 37 ° C durante 60 min. Al final de cada incubación, las muestras se sometieron a la rutina 3 × 5 min PBST (0,4% Triton X-100 + PBS) de enjuague. Después del enjuague final, los portaobjetos se montaron en medios acuosos que contienen montaje 4'6-diamino-2-fenilindol (DAPI) (Vector Laboratories) para la imagen. Las diluciones Ab fueron descritos en la sección anterior IHC.
multiplexado QD Etiquetado (MQDL)
El protocolo único etiquetado QD se modificó para MQDL, en el que una sola sección de tejido se sometió a tinción para múltiples marcadores en una manera secuencial. Para cada ensayo de biomarcadores, etiquetado comenzó con un bloqueo estreptavidina, seguido de la reacción primaria de Ab y secundario biotinilado incubación Ab, y la reacción con QD estreptavidina conjugada a una longitud de onda especificada. Las secciones se incubaron secuencialmente (con un 3 × 5 min de lavado PBST después de cada incubación). Abs primarios y las diluciones en MQDL eran idénticos a los utilizados para SQDL. Las secuencias de inmunorreacción fueron: 1) Anti-neuropilina-1 Ab, 2 horas, temperatura ambiente; caballo biotinilado anti-IgG de cabra, a temperatura ambiente, 30 min; estreptavidina-QD705, a 37 ° C, 1 hora. 2) Anti-p-c-Met Ab, a 4 ° C, durante la noche; caballo biotinilado anti-IgG de conejo, a temperatura ambiente, 30 min; estreptavidina-QD655 a 37 ° C, 1 hora. 3) Anti-VEGF Ab, a temperatura ambiente, 2 horas; caballo biotinilado anti-IgG de conejo, a temperatura ambiente, 30 min; estreptavidina-QD625 a 37 ° C, 1 hora. 4) Anti-p-p65-NFkB Ab a 4 ° C, durante la noche; caballo biotinilado anti-IgG de conejo a temperatura ambiente, 30 min; estreptavidina-QD565 a 37 ° C, 1 hora. 5) Anti-RANKL Ab a temperatura ambiente, 2 horas; caballo biotinilado anti-IgG de ratón a temperatura ambiente, 30 min; estreptavidina-QD585 a 37 ° C, 1 hora. 6) de montaje en medios acuosos que contienen montaje DAPI. Las concentraciones de Ab se describen en la sección IHC. Secciones de las células de cáncer de próstata humano LNCaP FFPE-RANKL se utilizaron como control positivo. Para el control negativo, Abs primarios fueron reemplazados con isotipo y Abs control de especies-emparejados y se aplicó a una sección de tejido inmediatamente adyacente, y MQDL se realizó en paralelo con la corredera de tejido marcado con el Abs primaria prueba.
Image adquisición
Un sistema de imágenes espectrales CRI (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) con una función de software v3.1 Nuance se utilizó para documentar imágenes multiespectrales siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Para cada campo de tejido canceroso, imágenes seriadas fueron adquiridas en un intervalo de longitud de onda de 10 millas náuticas de 450 a 800 nm, un intervalo elegido correspondiente a los puntos cuánticos fluorescentes activos. Se genera una imagen "cubo" sin procesar como una pila de 36 imágenes por separado con cada imagen que contiene la información espectral completo para cada pixel en esa longitud de onda dada. Todas las imágenes fueron adquiridas a 400 × magnificación, con una exposición de 50 milisegundos. Para evitar variaciones en el etiquetado debido a la heterogeneidad celular, se tomaron cinco imágenes de diferentes sitios de los tejidos cancerosos para cada muestra de tejido para su posterior cuantificación.
Deconvolution Image
se usó deconvolución Image o protocolo desmezcla para extraer etiquetado específico por un QD especificado. Una biblioteca espectral para 565, 585, 605, 625, 655, y 705 nm fue construido para la deconvolución por performimg múltiples SQDLs utilizando receptor de andrógenos (AR) de anticuerpos sin DAPI final de la contratinción en secciones de tejido en serie adyacentes. El etiquetado positivo de AR fue confirmada por tinción IHC paralelo en los tejidos adyacentes. El espectro de DAPI se obtuvo mediante el montaje de los tejidos adyacentes en el medio de montaje acuoso que contiene DAPI. Los espectros de autofluorescencia de tejido fueron adquiridos para cada tejido de un portaobjetos de control negativo (ver sección MQDL) preparado por IHC sin marcadores fluorescentes. reducción de autofluorescencia se realizó mediante análisis de componentes real de software plug-in. A continuación se utilizó la biblioteca espectral para unmix el cubo. Las contribuciones espectrales separadas a 'cubo' de los datos se emiten como mapas de intensidad de colores designados. Estas imágenes representan la distribución de cada uno de los puntos cuánticos y autofluorescencia en el tejido. Después de la deconvolución de las imágenes, el etiquetado de fondo se filtró y sólo las verdaderas señales positivas se muestra en las imágenes de las cifras presentadas.
Señal Cuantificación
La biblioteca espectral se utilizó para la deconvolute cubo de imágenes para extraer el etiquetado de QD individual utilizando inForm software v1.3 (Calibre) siguiendo la estrategia recomendada. En primer lugar, se ha creado un conjunto de entrenamiento que comprende dos clases de tejidos: "cáncer" y "no-cáncer '. El software fue entrenado en estas áreas usando los espectros tanto de la contratinción DAPI y de la immunolabeling QD multiplexados y probado en 50 celdas seleccionadas al azar de cada imagen para determinar la exactitud de la diferenciación de las dos clases. Este proceso se repitió hasta que otras iteraciones ya no mejoró la precisión. H /E imágenes histológicas luego se utilizaron para localizar las células de cáncer basados en el marcaje nuclear DAPI. a continuación, se utilizó un algoritmo incorporado para definir el citoplasmática vs. regiones subcelulares nucleares. Sobre la base de un análisis de las imágenes a 400 × magnificación, la configuración de umbral óptimo aproximadas: 200 escala fija, el tamaño mínimo de gota 20, el máximo tamaño de gota 10.000, el umbral de la circularidad 0, la nitidez del borde 0, llenar el agujero habilitado (parámetros nucleares); Dista de núcleo 1, la distancia exterior al núcleo 7, mínimo citoplasma tamaño de la muestra 1, rango de señal mínimo 0, máximo rango de la señal (65535 parámetros citoplásmicos). Para eliminar las señales no específicas en el espectro especificado, se está analizando una zona acelular dentro del campo fue utilizado como el etiquetado de fondo. QD intensidad de la fluorescencia en cada célula fue exportado a una hoja de cálculo de Excel (Microsoft, Seattle, WA) y se sometió a análisis estadístico [27], [28].
Resultados
Desarrollo de un QD cuantitativa etiquetado de protocolo para la evaluación de la expresión de genes asociados con la activación de c-Met señalización y EMT en las células LNCaP humanas cultivadas de forma estable tansfected con RANKL
hueso LNCaP y metástasis de tejidos blandos modelo: Una novela LNCaP modelo de metástasis ósea fue desarrollado por transfección estable de esta línea celular con RANKL (LNCaP-RANKL), que impulsa EMT en las células transfectadas. Cuando se inyectaron células LNCaP que sobreexpresan RANKL intracardially en ratones que mostraron un aumento de la incidencia de metástasis ósea y de tejidos blandos (Tabla 1).
Validación de los componentes de señalización de c-Met activado que conducen a EMT por RT- PCR, Western blot y Single Quantum Dot Labeling, SQDL: Comparación de la expresión de genes entre el control LNCaP-neo estable y las células LNCaP-RANKL utilizando RT-PCR y Western blot mostró evidencia de activado c-Met señalización a través de una mayor expresión de c-Met, pc-Met, y p65-p NFkB (Figura 1). Las células se sometieron morfológicas (panel A) y bioquímicas (Paneles B y C) transición epitelio mesénquima, con disminución de la adhesión intercelular mediada por E-cadherina y EpCAM, y el aumento de N-cadherina, vimentina y RANKL. Estas evaluaciones de señalización de la activación de c-Met y EMT fueron sometidos a análisis SQDL con un esfuerzo específico para confirmar si la activación de c-Met y EMT se produjeron en este modelo celular de la progresión del cáncer de próstata. SQDL confirmó que, en comparación con las células control LNCaP-neo (Figura 2A), células LNCaP-RANKL (Figura 2B) había activado c-Met señalización según lo revelado por una elevada expresión de RANKL, c-Met, pc-Met y p-NFkB p65 y la evidencia de la EMT, un interruptor de cadherina elevada expresión de N-cadherina, vimentina y RANKL, pero disminución de la expresión de e-cadherina y AR. Los análisis cuantitativos (Figura 3) de 1.000 células cancerosas seleccionadas al azar por inForm de software (Calibre) apoyaron a los datos de imágenes en el que tanto AR y E-cadherina expresión se redujo y activado c-Met señalización componentes llevaron a EMT drásticamente, como la expresión elevada de c-Met, pc-Met, p-NFkB p65, N-cadherina, vimentina, y RANKL se observaron en LNCaP-RANKL, en comparación con las células LNCaP-neo. Este protocolo SQDL cuantitativa se adoptó para la expresión génica análisis de un modelo de xenoinjerto CRPC LTL-313 establecida.
células LNCaP RANKL transfectadas EMT inducidas en histomorfología (A) y la expresión génica en el ARNm (B) y la proteína (C ). Los datos representan uno de 3 RANKL-transfectadas de forma estable y 2 neo-transfectadas de forma estable clones de células LNCaP.
etiquetado diferencial QD de las proteínas se realizó en LNCaP-neo (A) y LNCaP-RANKL (B) células usando DAPI tinción nuclear como referencia. Para cada análisis, QD marcada expresión de la proteína se presenta en pseudocolor, con la imagen superpuesta de las señales de DAPI y QD (fusionado). × 400.
Cell basado en cuenta la intensidad media de 1.000 por cada uno de los clones LNCaP y neo-RANKL-transfectadas se cuantificaron utilizando el software inForm. No se observaron cambios estadísticamente significativos en la expresión de proteínas (
P Hotel & lt; 0,05) guía empresas
Validación de c-Met señalización de activación y EMT en el modelo CRPC LTL-313 con resultados confirman. IHC y SQDL
Para entender el significado clínico de la activación de c-Met y EMT de señalización en el modelo LNCaP-RANKL y los incrementos correspondientes de la metástasis del cáncer de próstata, definimos la vía de señalización y EMT en un CRPC c-Met LTL-313 modelo de xenoinjerto obtiene a partir del tumor de estar Laboratorio (livingtumorcentre.com). Se incluyeron señalización asociada genes adicionales c-Met como neuropilina-1, VEGF, p-Akt, VEGFR2, MCL-1 y AR, que se caracterizaron como mediadores de la supervivencia aguas abajo de c-Met señalización [15], [21], [ ,,,0],29], [30]. La figura 4 muestra que el aumento de c-Met señalización asociada a los genes y la disminución de la expresión de AR en CRPC LTL-313 xenoinjertos mantenidos en huéspedes machos castrados, según la evaluación de IHC (Panel A) y SQDL (Panel B) en comparación con los xenoinjertos mantenidos en ratones intactos con la suplementación de andrógenos.
el c-Met activado y no se detectaron proteínas EMT asociado en el modelo de xenoinjerto CRPC LTL-313 por IHC convencional (a) y SQDL (B). La castración aumentó un panel de genes en LTL-313 cáncer de xenoinjerto de próstata y la disminución de la expresión del RA en comparación con xenoinjertos obtenidos a partir de los ejércitos intactos tanto por IHC y SQDL. × 400.
El análisis demostró MQDL activa c-Met y EMT en un LTL-313 modelo de xenoinjerto CRPC y muestras de tejido de cáncer de próstata humano primarios y metastásicos. Se utilizó una serie de xenoinjertos de cáncer de próstata humanos obtenidos del Laboratorio de Tumor de estar a prueba el protocolo MQDL cuantitativo. Hemos seleccionado el modelo LTL-313 para esta tarea ya que este modelo presenta características CRPC con una propensión a los ganglios principalmente de nodos, pulmón y metástasis de hígado con metástasis ósea poco frecuentes, cuando los tumores se implantan y se hicieron crecer bajo las cápsulas renales. Pusimos a prueba la hipótesis de que los tumores desarrollados en ratones castrados se desarrollaría resistencia castración y han activado señalización que conduce a la EMT, c-Met, en comparación con los tumores desarrollados en ratones suplementados con andrógenos exógenos (Figura 5A). Se tomaron tres enfoques: 1) establecer un protocolo MQDL robusta para detectar y cuantificar un panel de expresiones de genes en los LTL-313 muestra de tejido modelo CRPC con resultados en comparación con SQDL; 2) utilizar este protocolo MQDL cuantitativo establecido para confirmar si la activación de c-Met y EMT se producen en los CRPC LTL-313 tejidos mantenidos en los anfitriones castrados; y 3) para demostrar por el protocolo estandarizado MQDL la activación de c-Met y la inducción de EMT en ambos tejidos de cáncer de próstata humanos metastásicos primarias y esqueléticos. La Figura 5B muestra los análisis MQDL cuantitativa de neuropili-1, PC-Met, VEGF, p65 p-NFkB, y RANKL, informó anteriormente a estar asociado con la activación de la señal de c-Met [15], [22] y EMT [26], [31] en las células de cáncer de próstata humano y en el modelo CRPC LTL-313. Demostramos C activada-Met de señalización y EMT, según lo exhibido por el aumento de expresión de neuropilina-1, VEGF, y RANKL proteína y la activación de la PC-Met y p65 p-NFkB en el modelo de tumor CRPC LTL-313 con una mayor expresión y activación de estos genes en xenoinjertos de tumores LTL-313 se mantienen en castrados en comparación con los ratones intactos. Como control interno para minimizar la posible interferencia de fluorescencia de múltiples sondas QD, se realizó lado MQDL a lado con el protocolo SQDL (ver arriba). Se encontró que la expresión elevada de los 5 genes estudiados para ser estadísticamente significativa por INFOM análisis cuantitativos (Figura 5B). Se determinó este panel de 5 genes en muestras de cáncer de próstata primario con diferentes grados de Gleason y encontramos que la expresión de neuropilina-1, VEGF, PC-Met, RANKL, y p-NFkB p65 eran más elevada en pobremente diferenciado (puntuación de Gleason 10) que moderadamente diferenciado (puntuación de Gleason 7, 3 + 4) el cáncer de próstata (Figura 6). Estos resultados, tomados en conjunto, confirmaron que el etiquetado QD es altamente sensible y versátil y se puede utilizar para perfiles de expresión génica de multiplexación en modelos experimentales a nivel de células individuales.
secciones de tejido de tumores individuales de hosts intactos y castrados se sometieron a MQDL secuencial. Se detectó mayor expresión de genes activados c-Met en los tejidos tumorales de anfitriones castrados. (A) Una pila de varias imágenes (cubo), la tinción nuclear (DAPI), y la expresión de genes individuales (en pseudocolors) se muestran. señales de expresión de genes se superponen con las señales nucleares DAPI para producir una imagen compuesta para su análisis. × 400.