Extracto
presiones tumoral inestabilidad genómica y tratamiento selectivo de resultado en la evolución de la enfermedad clonal; estratificación molecular para la administración de fármacos molecularmente dirigidos requiere el acceso repetido al ADN tumoral. La hipótesis de que el ADN de plasma (cpDNA) en pacientes con cáncer avanzado que circula se deriva en gran medida de tumor, tiene utilidad pronóstica, y pueden ser utilizados para la secuenciación mutación tumor multiplex cuando la repetición de la biopsia no es factible. Hemos utilizado el panel Sistema MassArray Sequenom y OncoCarta para el perfil de mutación somática. Se evaluaron muestras combinadas, adquiridos desde el mismo paciente, pero en diferentes puntos temporales; éstas compuesto (FFPE) tejido tumoral de archivo incluido en parafina y fijado en formalina (primario y /o metastásico) y cpDNA. La viabilidad, la sensibilidad y especificidad de este alto rendimiento, enfoque de detección de mutaciones múltiplex se puso a prueba la utilización de especímenes obtenidos de 105 pacientes con tumores sólidos que se refiere a la participación en ensayos de fase I de los fármacos dirigidos molecularmente. La concentración cpDNA media fue de 17 ng /ml (rango: 0,5 a 1600); esto era 3 veces mayor que en los voluntarios sanos. Por otra parte, las concentraciones más altas cpDNA asocian con peor supervivencia global; hubo una relación de supervivencia global (OS) de riesgo de 2,4 (IC del 95%: 1,4; 4,2) por cada aumento de 10 veces en la concentración de cpDNA y en los análisis multivariado, la concentración cpDNA, albúmina, y el estado funcional se mantuvo predictores independientes de sistema operativo. Estos datos sugieren que el ADN de plasma en estos pacientes de cáncer se deriva en gran medida de tumor. También se observó alta concordancia detección de mutaciones crítico "hot-spot" (
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA
) en cpDNA emparejado y de tejido tumoral de archivo, y las diferencias importantes entre el tumor de archivo y cpDNA. Este ensayo de secuenciación multiplex puede ser utilizada para detectar mutaciones somáticas a partir de plasma en pacientes con cáncer avanzado, cuando repetir la biopsia del tumor de seguridad no es factible y análisis genómico de tumor de archivo, se considere insuficiente. En general, los estudios de biomarcadores circulantes de ácido nucleico que tienen clínicamente importante utilidad de usos múltiples en pacientes con cáncer avanzado y más estudios para perseguir su incorporación en el estándar de cuidado están garantizados
Visto:. Perkins G, Yap TA, el Papa L, Cassidy AM, Dukes JP, Riisnaes R, et al. (2012) multiusos Utilidad de circulación de plasma Pruebas de ADN en pacientes con cáncer avanzado. PLoS ONE 7 (11): e47020. doi: 10.1371 /journal.pone.0047020
Editor: José Luis Pérez-Gracia, Clínica Universidad de Navarra, España |
Recibido: 15 de mayo de 2012; Aceptado: 7 Septiembre 2012; Publicado: 7 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Perkins et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El Drogas Unidad de desarrollo de la Royal Marsden NHS Foundation Trust y el Instituto de Investigación del cáncer es apoyado en parte por una subvención del programa de Investigación del cáncer del Reino Unido. También se prestó apoyo por el Centro de Cáncer de Medicina Experimental (con el Instituto de Investigación del Cáncer) y el Instituto Nacional para la Investigación Biomédica Centro de Investigación de la Salud (junto a la Royal Marsden NHS Foundation Trust y el Instituto de Investigación del Cáncer). GP fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional Francés de Cáncer (Institut National du Cancer, Inca, Francia). TY es beneficiario de la Fundación de Scott MINERD cáncer de próstata Young Investigator Award 2011. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El desarrollo del cáncer se debe principalmente a las aberraciones genéticas que conducen a la oncogénesis y determinan las manifestaciones clínicas de los tumores; estos también pueden afectar la respuesta al tratamiento [1]. Nuestra mejor conocimiento de la biología subyacente del cáncer y la disponibilidad de herramientas de la biotecnología moderna está empezando a llevar al éxito del desarrollo de nuevas terapias antitumorales moleculares, así como un mejor reconocimiento de los mecanismos de resistencia [2], [3]. Los ejemplos notables incluyen
KRAS
mutaciones en tumores colorrectales predecir la resistencia al receptor del factor de crecimiento anti-epidérmico (EGFR) dirigidas a anticuerpos monoclonales (cetuximab [ImClone y Bristol-Myers Squibb]; y panitumumab [Amgen]) [4], [5], y
KIT
mutaciones que predicen respuestas antitumorales a imatinib (Novartis) en los tumores del estroma gastrointestinal [6]. El análisis molecular de estas aberraciones genómicas se lleva a cabo normalmente en el tejido tumoral de archivo debido a problemas éticos y de seguridad asociados con biopsias repetidas. Sin embargo, en vista del potencial para la inestabilidad genómica, persiste la preocupación, acerca de la validez de este enfoque de analizar el tejido tumoral de archivo, en lugar de rebiopsying tumor para los análisis moleculares en cada punto de decisión terapéutica. Por ejemplo, no está claro si el análisis de biopsias de tumores de archivo tomadas desde hace muchos años y con frecuencia múltiples terapias anteriormente, con suficiente refleja la biología de la enfermedad al momento del tratamiento. La re-biopsia de un tumor seleccionado lesión no puede, sin embargo, proporcionar información suficiente sobre la heterogeneidad molecular de la enfermedad intra-paciente y rebiopsying múltiples lesiones clínicamente sigue siendo poco práctico. Mejora de las estrategias para tratar la estratificación molecular paciente se necesitan con urgencia.
Hemos establecido para optimizar el beneficio para los pacientes con tumores sólidos avanzados que se refiere a la Fase I de ensayos clínicos mediante la asignación de terapias dirigidas específicas para pacientes que tienen tumores aberraciones moleculares dirigidas por el agente en cuestión [2], [3], [7]. Se evaluaron los tumores obtenidos de estos pacientes con el alto rendimiento de la plataforma Sequenom MassArray utilizando el panel de mutación OncoCarta (versión 1.0; Sequenom, San Diego, CA). Este panel utiliza pre-diseñados y tecnología de espectrometría de genotipado SNP masa pre-validado para el multiplex paralelo análisis de 238 mutaciones simples y complejos a través de 19 oncogenes comunes, minimizando la cantidad de muestra necesarios y maximizar la sensibilidad [8]. Previamente se ha utilizado con éxito para la detección de mutaciones en (FFPE) tejido tumoral fijado en formalina incluido en parafina [9] [10].
Una fuente alternativa de ADN tumoral está circulando ADN plasma (cpDNA) [ ,,,0],11], que puede ser fácil y repetidamente extraído de plasma y puede ser derivado de un tumor [11], [12], con concentraciones cpDNA asociarse con carga de la enfermedad y la progresión [13]. Los estudios también han demostrado la viabilidad de la detección de mutaciones de cpDNA en pacientes con cáncer avanzado [14], [15], [16], [17], [18]. Nos propusimos estudiar la posible utilidad de la detección de mutaciones múltiplex de cpDNA con el alto rendimiento de la plataforma Sequenom MassArray utilizando el panel de mutación OncoCarta (v1.0) para determinar si esto puede ser utilizado como un complemento de las biopsias de tejido para enriquecer y apoyar a los datos del tumor para la selección de pacientes. Los objetivos secundarios fueron investigar si la medición de las concentraciones de cpDNA tiene valor pronóstico.
Materiales y Métodos
Muestras clínicas
Los pacientes en estadio tardío hacen avanzar tumores sólidos que fueron remitidos a la Unidad de Desarrollo de Fármacos en el Royal Marsden NHS Foundation Trust entre septiembre de 2009 y agosto de 2010, y que eran elegibles para un ensayo de fase I se incluyeron en este estudio. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado para el análisis genético de sus tumores y las muestras de plasma por escrito antes de la participación en este estudio. Ocho ml de sangre periférica se tomaron muestras en un tubo de preparación de la célula BD Vacutainer (CPT) que contiene heparina de sodio, que permite plasma y la separación de células mononucleares durante una única etapa de centrifugación. El tubo se invierte un mínimo de 8 veces para asegurar una mezcla completa de la muestra, y después se centrifugó a 1800 g durante 15 min. El sobrenadante de plasma resultante se transfirió a un tubo limpio y se almacenó a -80 ° C hasta su análisis. Además, 20 voluntarios sanos proporcionan 8 ml de sangre para el análisis mediante este método. También se pidió correspondientes muestras FFPE (primaria y /o sitios de metástasis) para cada paciente. El comité de ética independiente de regulación y relevante (Servicio Nacional de Ética de la Investigación (NRES) Comité de Londres-Chelsea, Reino Unido) aprobó este estudio antes de que comience el juicio.
aislamiento del ADN y la cuantificación
Para los análisis de las muestras tumorales, hemotoxylin- y diapositivas eosina fueron revisados por un patólogo certificado por el consejo (KT) para asegurar un tumor viable y adecuada para determinar la zona tumoral al núcleo. ADN de las muestras FFPE se extrajo a partir de núcleos de 1 mm o cuando sea posible a partir de 10 micras secciones no teñidas con biopsias más pequeños usando el kit de ADN de tejidos FFPE QIAamp (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El ADN extraído se eluyó posteriormente en 30 l de tampón ATE y se almacenó a -20 ° C hasta su posterior análisis. ADN se cuantificó usando el Nanodrop 1000 espectrofotómetro (Thermo Scientific).
Para la extracción cpDNA, plasma se descongeló a temperatura ambiente y cpDNA extrae de 2 ml de plasma usando un kit QIAamp DNA Blood Midi (Qiagen, Valencia, CA , EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con las siguientes modificaciones: para cada 2 ml de muestra de plasma, se añadió una etapa de centrifugación adicional (16.000 g, 5 min, RT) antes de que el procedimiento de extracción con el fin de eliminar los restos celulares de la plasma. Al final del procedimiento, el ADN se eluyó en 100 l de tampón de elución AE. concentración de ADN se midió con tinción fluorescente, usando el kit de ensayo Quant-iT ™ Pico-Green® ADN de doble cadena (dsDNA) (Invitrogen, Carlsbad, CA) y el lector de microplacas SynergyHT (Biotek). ADN de las líneas celulares de cáncer analizadas se extrajo a partir de sedimentos utilizando el QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para fines de comparación, todas las concentraciones cpDNA presentados en este manuscrito se expresan como ng /ml de plasma.
tecnología de espectrometría de masas y el panel TypePLEX OncoCarta (v1.0)
El panel OncoCarta (v1 0.0) consta de 24 grupos de pares de cebadores y cebadores de extensión, y tiene la capacidad de detectar 238 mutaciones en 19 genes. El protocolo proporcionado por Sequenom (San Diego, CA) fue seguido con modificaciones menores. La cantidad de ADN añadido a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue 20 ng por reacción para muestras de ADN FFPE. Para las muestras de ADN de plasma, se añadieron 30 l de ADN de 30 l de agua pura, y se utilizan para el procesamiento de paneles OncoCarta (v1.0). ADN se amplificó usando los grupos de cebadores de PCR OncoCarta, los nucleótidos no incorporados se inactivaron por la fosfatasa alcalina de gamba (SAP), y una única reacción de extensión de base se llevó a cabo usando cebadores de extensión que hibridan inmediatamente adyacentes a las mutaciones y una mezcla personalizada de nucleótidos. Las sales se eliminaron mediante la adición de una resina de intercambio catiónico. multiplexados reacciones fueron avistados en las matrices SpectroCHIP II, y los fragmentos de ADN se resolvieron mediante MALDI-TOF en el espectrómetro de masa compacta (Sequenom, San Diego, CA).
Se realizó un análisis de datos
Análisis de los datos utilizando software MassArray Typer Analizador 4.0.4.20 (Sequenom), que facilita la visualización de los patrones de datos y los espectros en bruto. Typer automatiza la identificación de mutantes mediante la comparación de proporciones de la cima de tipo salvaje a la de todos los mutantes sospechosos y genera un informe que detalla OncoMutation mutaciones específicas y las relaciones de tipo salvaje y mutación picos. Todas las mutaciones del informe Oncomutation fueron revisados manualmente por 2 operadores ciegos, con mutaciones revisados seleccionados del informe OncoMutation comparación y se confirmó que concordantes. Se llevó a cabo la revisión manual de las mutaciones en todos los espectros OncoCarta para identificar picos "reales" mutantes de picos de sal u otros picos de fondo. Los análisis estadísticos se detallan en los métodos suplementarios S1.
mutación FFPE confirmación
KRAS
mutaciones también se detectaron utilizando el kit de mutación KRAS TheraScreen (Qiagen, Alemania), basado en la amplificación Sistema refractario a las mutaciones (ARMS) -Scorpion PCR [19].
BRAF V600E
mutaciones también se detectaron mediante el análisis de conformación de cadena electroforesis de un solo capilar (CE-SEAC). Se proporcionan más detalles en los métodos suplementarios S1.
Resultados
Características de los pacientes
Un total de 105 pacientes remitidos para la fase I se inscribieron participación en el ensayo entre septiembre de 2009 y agosto de 2010 (Tabla 1, Tabla S1). Un paciente fue encontrado posteriormente que no es elegible para los ensayos de fase I y, por tanto, este estudio ya que no había agotado todas las líneas de tratamientos antitumorales disponibles. Los diferentes tipos de tumores representados en los 104 pacientes restantes fueron el cáncer colorrectal (CRC) (n = 25), el cáncer de mama (n = 19), melanoma (n = 15), cáncer de ovario (n = 15), cáncer de próstata resistente a la castración ( CRPC) (n = 11) y otros tipos de tumores (n = 19), incluyendo el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), mesotelioma, sarcoma, glioblastoma, el adenocarcinoma de origen primario desconocido (ACUP), colangiocarcinoma, y de cuello uterino, endometrio, duodenal , esófago, páncreas y cáncer renal (Tabla 1).
de los 104 pacientes analizados en el estudio, se obtuvieron muestras de tumor primario FFPE para 69 (66%) de los sujetos, con FFPE ganglionar y /o siendo disponibles muestras de tumores metastásicos durante otros 31 (30%) pacientes. cpDNA se recogió de 101 (97%) pacientes; no fue posible para extraer la sangre de 1 paciente por razones técnicas y la sangre no se recogió a partir de 2 pacientes debido a errores de logística. Un total de 60 pacientes murieron durante el seguimiento, mientras que los datos de 44 pacientes fueron censurados para los fines de esta publicación. La mediana de seguimiento fue de 5,8 meses (rango 0,3 a 17,5) (Tabla 1).
experimentos de dilución en serie de ADN para el desarrollo del ensayo
Las diluciones de ADN extraídas de la
KRAS
línea celular mutante humano HCT116 cáncer de colon mostró que el
KRAS
mutación G13D era reproducible detectable por el panel v1.0 OncoCarta concentraciones de ADN de tan bajas como 40 ng /ml (Figura S1). cpDNA también se recogió de voluntarios sanos (Tabla 2); en estas muestras, se encontró que la concentración cpDNA a ser baja: se detectaron mediana de 6,5 ng /ml de plasma (intervalo de 4,5 a 13,3 ng /ml de plasma), y no hay mutaciones en ninguna muestra. se encontró un paciente con cáncer de mama avanzado que tenía niveles muy altos cpDNA (1600 ng /ml de plasma) para tener un
PIK3CA
mutación en tanto FFPE y muestras cpDNA; diluciones en serie de este cpDNA mostraron que la
PIK3CA
mutación fue detectable hasta una concentración de 2,5 ng /ml de plasma que utilizan este ensayo.
Plasma cpDNA niveles de concentración y de detección de mutación
La concentración total cpDNA media fue de 17 ng /ml en estos pacientes con tumores avanzados (rango: 0,5 a 1600) (Figura 1; Tabla S1). La concentración cpDNA media fue de 18 ng /ml (rango: 5-230) para los pacientes con CCR; 7 ng /ml (rango: 2-50) para los pacientes con melanoma, 17 ng /ml (rango: 0,5 a 1600) para los pacientes con cáncer de mama, 15 ng /ml (rango: 4-49) para los pacientes con cáncer de ovario y 53 ng /ml de plasma (rango: 7-1177). para pacientes con CRPC que tenían las mayores concentraciones de ADN en plasma
los diagramas de caja y bigotes que muestran 25
ª, 50
º y 75
º percentiles, superiores y valores adyacentes inferiores (filamentos) y los valores extremos de Tukey (•). valor de p es para una prueba t no pareada de dos caras en las concentraciones de ADN log10 usando la corrección de Welch para varianzas desiguales.
plasma igualadas y FFPE estaban disponibles para el análisis de 84 pacientes. Se detectaron un total de 42 mutaciones en uno o ambos tumoral FFPE especímenes y cpDNA obtenidos de estos pacientes (Tabla 3; Tabla S1; Figuras S2A-S2D). La concordancia general de mutaciones detectadas entre FFPE y especímenes cpDNA era 60% (25 de 42 mutaciones detectadas) (Tabla 3). No paramétrico de análisis ROC se utilizaron para evaluar el límite de la plataforma Sequenom para detectar mutaciones en el panel OncoCarta cpDNA (Figura 2A). La concentración de cpDNA con la capacidad óptima para detectar una mutación era 29.95 ng /ml (relación de probabilidad = 7,3043). La AUC calculada fue de 0,8075 (IC del 95% desde 0,6552 hasta 0,9598). La Figura 2B muestra los diferentes tipos de mutaciones en una gama de tipos de tumores en las respectivas concentraciones cpDNA que se detectaron en
2A:. No paramétrica ROC análisis se utilizaron para evaluar el límite de la plataforma Sequenom para detectar mutaciones del panel OncoCarta en cpDNA. Cada punto en el gráfico corresponde a la sensibilidad y especificidad en una de las concentraciones observadas. Las mutaciones se consideran "disponibles para la detección de" si se detectaron en el tejido FFPE del paciente. Las mutaciones se detectaron en muestras de FFPE de 37 pacientes. La concentración de cpDNA con la capacidad óptima para detectar una mutación es 29,95 ng /ml (cociente de probabilidad = 7,3043). La AUC calculada es de 0,8075 (IC del 95% 0,6552 a 0,9598). Los pacientes cuyos FFPE no estaban disponibles o fueron negativos para las mutaciones fueron excluidos del análisis. Las líneas de referencia especificidad para los cuartiles de las concentraciones de ADN se indican en líneas de trazos rojos. 2B: gráfico que muestra los tipos de mutaciones y concentraciones cpDNA en que fueron detectados en diferentes tumores. Las mutaciones se detectaron en seis oncogenes. Los símbolos representan diferentes tipos de tumores.
La correlación con la evolución del paciente.
La mediana de supervivencia global (OS) para todos los pacientes fue de 7,9 meses (IC del 95% 5.8, 9.2) . Los pacientes se clasificaron en grupos de concentración de cpDNA bajo y alto en base a la concentración de ADN cohorte voluntario sano máxima de 13,3 ng /ml; 61 pacientes fueron clasificados con altas concentraciones de cpDNA con 40 que tiene niveles bajos. La mediana de SG en pacientes clasificados como que tienen bajas concentraciones cpDNA fue de 10,5 meses (95% CI 6,0, Carolina del Norte), mientras que aquellos en el grupo de alta concentración de cpDNA tenían una mediana de SG de 6,5 meses (IC del 95% 4.5, 8.4) (log-rank p = 0,0383) (Figura 3A). Como una variable continua, se produjo un índice de riesgo OS de 2.4 (95% CI 1.4, 4.2) para cada aumento de 10 veces en la concentración cpDNA (Figura 3B).
(3A) de Kaplan-Meier gráfico que muestra la supervivencia curvas de concentración cpDNA en 101 pacientes con tumores sólidos avanzados. Los pacientes en la categoría desfavorable tenían concentraciones mayores de un saludable cohorte voluntario máxima de 13,3 ng /ml (rango logarítmico p = 0,0383). función (3B) superviviente estimada a partir de univariante que muestra la regresión de Cox predijo curvas de supervivencia para un intervalo de concentraciones cpDNA. Un riesgo relativo de 2,4 (p = 0,002) se muestra entre las curvas adyacentes.
Recientemente hemos validado prospectivamente una puntuación pronóstica (puntuación RMH) Correlación con RMH puntuación pronóstica. De los pacientes que participan en ensayos clínicos fase I en base a la combinación de tres factores pronósticos: la albúmina sérica inferior a 35 g /L; lactato deshidrogenasa (LDH) mayor que el límite superior de lo normal (ULN); y dos o más sitios de metástasis. La presencia de cada una de estas variables asociadas con el empeoramiento de los resultados [20]. La concentración media cpDNA fue mayor en los pacientes con una puntuación pronóstica RMH peor (F [3,98] = 9,97, p & lt; 0,0001); Después de los ensayos revelaron una tendencia lineal positiva significativa entre log10 (cpDNA) y la puntuación RMH (beta = 0,247, p & lt; 0,0001) (Figura 4)
Diagrama de dispersión que muestra la relación entre la concentración de cpDNA y la puntuación pronóstica RMH.. Hubo una tendencia lineal positiva significativa entre log
10 (cpDNA) y la puntuación RMH (beta = 0,252, p & lt; 0,0001)..
La correlación con el análisis univariante y multivariante
univariante prueba para determinar predictores significativos de la supervivencia global, que incluye la concentración cpDNA como una variable continua (HR 2,4 por aumento de 10 veces, IC del 95% 1.4 a 4.2), albúmina & lt; 35 g /L (rango logarítmico p = 0,0003 ), y el estado funcional ECOG igual a 2 (rango logarítmico p = 0,0007). Cuando cpDNA, albúmina y el estado funcional se incorporaron en un modelo multivariado, se encontró que los tres parámetros a ser predictores independientes de la supervivencia (Tabla 4). No se encontró el número de sitios metastásicos ser un predictor significativo de la supervivencia en el análisis univariado y por lo tanto fue excluido del modelo multivariado.
detección mutacional y la concordancia entre FFPE y cpDNA
El cáncer colorrectal.
de los 25 pacientes con CCR, muestras cpDNA se obtuvieron de todos los pacientes, mientras que las muestras tumorales FFPE estaban disponibles para el análisis de 22 pacientes. En general, se detectaron mutaciones en 15 de 22 (68,2%) tumores FFPE disponibles y 14 de 25 especímenes cpDNA (56%) (Tabla S1). En concreto,
KRAS
,
BRAF
y
PIK3CA
mutaciones se detectaron en 10 (45%), 3 (14%) y 2 (9%) muestras de tumor, respectivamente . Comparativamente, 9 (36%)
KRAS
, 3 (12%)
BRAF
y 3 (12%)
se detectaron mutaciones PIK3CA
en muestras cpDNA.
la concordancia en la detección de mutaciones entre los tumores de archivo FFPE especímenes emparejados y cpDNA por Sequenom OncoCarta análisis fue del 70% (7 de 10 pacientes) para
KRAS
y el 100% (3 de 3 pacientes) para
BRAF
estado mutacional (Tabla 3). Ninguno de los pacientes con tipo salvaje
KRAS
o
BRAF
genotipos de tejido tumoral tenían mutaciones en sus respectivos cpDNA. Cinco pacientes tenían detectable
PIK3CA
mutaciones en uno o ambos tumoral FFPE y /o cpDNA: 1 paciente tenía una mutación Q546K detectado tanto en el tejido FFPE y cpDNA; 1 paciente tenía una mutación E545K detectó sólo en FFPE, pero no cpDNA; 1 paciente tenía una mutación E542K detectado en una metástasis de hígado (FFPE), pero no en el tumor primario (FFPE) o cpDNA; 1 paciente tenía E545K detectó sólo en el plasma pero no FFPE; y 1 paciente tenía una mutación Q546K encontrado en cpDNA pero ningún ejemplar FFPE estaba disponible. El oncogénico informó recientemente
AKT1
se detectó la mutación E17K [21] en 1 paciente, tanto en tejidos y plasma. No se detectaron mutaciones en otros oncogenes probadas.
No fue del 90% (9 de 10
KRAS mutado
muestras) de concordancia para FFPE tumoral
KRAS
estado mutacional entre el panel OncoCarta y los brazos-Escorpión plataformas de PCR. La concordancia entre el método BRAF panel y CE-SEAC OncoCarta fue del 100% (3 de 3
BRAF
muestras mutadas).
melanoma.
De los 15 pacientes con melanoma , las muestras tumorales FFPE estaban disponibles para el análisis de 10 pacientes, mientras que las muestras cpDNA se obtuvieron de los 15 pacientes. En general, se detectaron mutaciones en 8 de 10 (80,0%), los tumores FFPE disponibles y 6 de los 15 especímenes cpDNA (40%) (Tabla S1).
BRAF
,
ANR
y
MET
mutaciones se detectaron en 5 (50%), 3 (30%) y 1 (10%) de 10 muestras FFPE tumorales, respectivamente, y 3 (20%), 2 (13,3% ) y 2 (13,3%) de 15 muestras cpDNA, respectivamente. La concordancia en la detección de mutaciones entre FFPE emparejado y cpDNA fue del 60% (3 de 5 pacientes) para
BRAF
, el 66,7% de
ANR gratis (2 de 3 pacientes) y el 100% para
MET
estado mutacional (1 de 1 paciente) (Tabla 3). Otro
MET
mutación, T992I, fue encontrado en una muestra cpDNA, pero no muestra tumoral FFPE estaba disponible. Ninguno de los pacientes con genotipos de tejido tumoral de tipo salvaje tenían mutaciones en sus respectivos cpDNA.
Hubo un 100% de concordancia (5 de 5 muestras) para el
BRAF
estado mutacional entre el panel OncoCarta y CE-SEAC método.
El cáncer de mama.
FFPE muestras tumorales y muestras cpDNA estaban disponibles para el análisis de los 19 pacientes con cáncer de mama. En general, se detectaron mutaciones en 5 de 19 (26,3%), los tumores FFPE y 4 de 19 especímenes cpDNA (21,1%) (Tabla S1) guía.
El
PIK3CA mutación
H1047R se detectó en 4 de 19 (21,5%) muestras de tumor y 3 de 19 (15,8%) muestras cpDNA, con concordancia entre 3 de 4 (75%) emparejado muestras FFPE y cpDNA (Tabla 3). El
AKT1
se detectó la mutación E17K en 1 paciente tanto en el tejido FFPE y cpDNA. No hay mutaciones en cualquiera de los otros oncogenes estudiados se detectaron con el panel OncoCarta. Ninguno de los pacientes con genotipos de tejido tumoral de tipo salvaje tenían mutaciones en sus respectivos cpDNA.
La castración cáncer de próstata resistente.
De los 11 pacientes con CRPC, muestras cpDNA se obtuvieron de todos los pacientes, mientras que los tumores eran FFPE disponible para 8 pacientes. En general, se detectaron mutaciones en 3 de 8 (37,5%), los tumores FFPE, y 3 de 11 (27,3%) especímenes cpDNA (Tabla S1).
PIK3CA
,
HRAS
y
AKT1 gratis (todos los n = 1) mutaciones se detectaron en muestras tumorales FFPE, mientras que
ANR
,
PIK3CA
y
AKT1 (todo n = 1) se encontraron mutaciones en las muestras cpDNA. El correspondiente FFPE tumor
PIK3CA
y
AKT1
mutaciones se encontraron en las muestras cpDNA, pero el tumor FFPE
HRAS
mutación no se encontró en la muestra cpDNA emparejado (Tabla 3 ). El Q61K
ANR
mutación se encontró en 1 espécimen cpDNA, pero no en la muestra tumoral FFPE correspondiente
El cáncer de ovario..
De los 15 pacientes con cáncer de ovario avanzado, muestras cpDNA se obtuvieron de todos los pacientes, mientras que las muestras tumorales FFPE estaban disponibles para 14 pacientes. En general, se detectaron mutaciones en 5 de 14 (35,7%), los tumores FFPE, y 0 de 14 especímenes cpDNA (0%) (Tabla S1).
KRAS
mutaciones (G12V y G13D) (n = 3) y el
PIK3CA mutación
H1047R (n = 1) fueron detectados en muestras tumorales FFPE, pero no se encontraron mutaciones en ninguna muestra de cpDNA (Cuadro 3). Un paciente con carcinosarcoma ovárico tenía un KIT
P585P mutación detectada en FFPE, pero no en cpDNA.
Otros tipos de tumores.
De los 19 pacientes restantes con una gama de tipos de tumores, muestras cpDNA se obtuvieron de 17 pacientes, mientras que los tumores FFPE estaban disponibles para 12 pacientes.
El
ANR
G12D mutación se encontró en ambos tumoral FFPE y el plasma de un paciente con ACUP ( Tabla 3). Se detectó la
NRAS
G13R mutación en el plasma, pero no en FFPE tumor de un paciente con colangiocarcinoma. La
KRAS
mutación G12D se encontró en tumor FFPE, pero no en el plasma de un paciente con cáncer duodenal. No hay mutaciones se detectaron mutaciones en los otros pacientes, que no incluye el receptor del factor de crecimiento epidérmico (
EGFR
) en los 5 pacientes con NSCLC.
La concordancia en la detección de mutaciones entre FPFE y cpDNA para el tumor primario o especímenes metastásico
al considerar todos los pacientes con diferentes muestras, incluidos los que no tienen mutaciones detectadas (n = 83), la concordancia en la detección de mutaciones entre FFPE y cpDNA fue mayor en las metástasis (83,3% de los 18 especímenes) en comparación con tumor primario (78,5% de los 65 especímenes). Al considerar sólo los pacientes con mutaciones detectadas en al menos sangre y /o tumor primario (n = 40), la concordancia en la detección de mutaciones entre FFPE y cpDNA fue de nuevo mayor en metástasis (70,0% de los 10 especímenes) en comparación con el tumor primario (53,3% de 30 especímenes). Sin embargo, debido a la diferencia en el número de tumor primario (n = 65) y metastásico (n = 18) los especímenes obtenidos, no podemos sacar ninguna conclusión de estos datos estadísticos.
Discusión
Este estudio ha demostrado, por primera vez, la viabilidad de la detección múltiple de mutaciones en el ADN del tumor utilizando el panel OncoCarta multiplex tanto de ADN extraído de FFPE tejido tumoral de archivo y cpDNA. Hemos demostrado que los niveles totales de cpDNA en pacientes con cánceres avanzados son, en general, significativamente superiores a los de voluntarios sanos, las concentraciones más elevadas se encuentran en pacientes con cáncer de próstata y de mama avanzado, aunque esta diferencia no fue significativa en el melanoma y el cáncer de ovario (Figura 1). Se encontró que la concentración máxima detectada en voluntarios sanos para dividir los pacientes en dos grupos que se asociaron con significativamente diferentes pronósticos; los pacientes en el grupo de cpDNA baja tuvieron una SG significativamente mayor en relación con los del grupo de alta cpDNA [11], [13], [22]. Por otra parte, la concentración cpDNA permaneció altamente pronóstico para el sistema operativo en un análisis multifactorial utilizando los biomarcadores pronósticos para la fase I juicio población de pacientes que hemos descrito anteriormente [20]. También hemos demostrado una correlación entre las concentraciones de cpDNA y la puntuación pronóstica que hemos descrito previamente para predecir el resultado de los pacientes remitidos para la participación en ensayos de fase I; concentración cpDNA, albúmina & lt; 35 g /L y el estado funcional tenían valor pronóstico en nuestra serie de pacientes como predictores independientes de la supervivencia. Estos datos indican que en general cpDNA en esta población de pacientes está en gran medida del tumor deriva, aunque esto puede ser generada tanto por las células malignas del estroma y
.
El panel de Sequenom OncoCarta también nos ha permitido analizar más de 230 mutación conocida 'caliente mutaciones -spots 'en más de un centenar de pacientes en un alto rendimiento de la moda. El panel OncoCarta cubre un número grande y creciente de los oncogenes y puede ser adaptado para incluir genes adicionales de interés. Permite la detección de mutaciones tumor incluso con cantidades mínimas de ADN tumoral, la mala conservación del tejido y la presencia de cantidades significativas de ADN normal. Siguiente tecnología de secuenciación de generación permite una mayor cobertura de ADN y de adquisición de datos, lo que permite la secuenciación de cientos de genes de longitud completa, que será crítico para el estudio de genes donde las mutaciones se pueden encontrar en varias ubicaciones diferentes, como es el caso para muchos supresor de tumor genes como el BRCA1, BRCA2, p53 y PTEN.
a medida que avanzamos hacia el desarrollo de agentes dirigidos molecularmente para las poblaciones seleccionadas de pacientes, es crucial que la caracterización molecular de los tumores para la predicción de la eficacia de las terapias dirigidas se incorpora en los primeros ensayos clínicos [2], [3]. Tal enfoque puede aumentar las probabilidades de beneficio individual del paciente, disminuyendo el número de pacientes que reciben terapias ineficaces y agilizar la calificación clínica de biomarcadores predictivos. tejido tumoral Archivo, tomadas con frecuencia muchos años antes, se utiliza a menudo para estos análisis. la re-biopsia del tumor sigue siendo poco común, aunque es factible como se demuestra en el ensayo de adaptación primera batalla del cáncer de pulmón [23]. No obstante, la obligatoriedad de múltiples rebiopsies tumorales repetida plantea problemas logísticos, fiscales y éticas, mientras que la desaceleración de acumulación juicio y no abordar la cuestión de la heterogeneidad intra-paciente de la lesión a la lesión. La re-biopsia y análisis pueden cpDNA ambos abordar las preocupaciones que rodean la inestabilidad genómica del tumor y la evolución molecular clonal debido a las presiones de selección terapéuticos mientras que también potencialmente interrogar a la cuestión heterogeneidad intra-paciente.