Extracto
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. En los Estados Unidos, sólo uno de cada seis pacientes con cáncer de pulmón sobreviven cinco años después del diagnóstico. Estas estadísticas pueden mejorar si se identifican nuevos blancos terapéuticos. Hemos informado anteriormente de que una enzima del metabolismo del ácido graso, muy de cadena larga acil-CoA sintetasa 3 (ACSVL3), se sobreexpresa en glioma maligno, y que agotan las células de glioblastoma de ACSVL3 disminuye sus propiedades malignas. Para determinar si la expresión ACSVL3 también se incrementó en el cáncer de pulmón, se estudiaron los cortes histológicos tumorales y líneas celulares de cáncer de pulmón. El análisis inmunohistoquímico de pulmón humano normal mostró expresión ACSVL3 moderada sólo en las células epiteliales bronquiales. Por el contrario, todos los 69 tumores de pulmón diferentes probados, incluyendo adenovirus, de células escamosas, de células grandes, y carcinomas de células pequeñas, habían elevado los niveles de firmeza ACSVL3. Western blot de líneas celulares de cáncer de pulmón derivados de estos tipos de tumores también habían aumentado significativamente proteína ACSVL3 comparación con las células epiteliales bronquiales normales. La disminución de la tasa de crecimiento de líneas celulares de cáncer de pulmón no cambió la expresión ACSVL3. Sin embargo, derribando expresión ACSVL3 por interferencia de ARN reduce las tasas de crecimiento celular en cultivo por 65 a 76%, y la capacidad de las células tumorales de formar colonias en agar blando suspensión por 65 a 80%. También llevamos a cabo estudios para obtener una mejor comprensión de las propiedades bioquímicas de ACSVL3 humano. ACSVL3 mRNA se detectó en muchos tejidos humanos, pero el patrón de expresión tanto diferente de la del ratón. La enzima activada largo y de cadena larga muy saturados sustratos de ácidos grasos, así como mono- de cadena larga y ácidos grasos poliinsaturados en sus derivados respectivos coenzima A. Endógeno proteína ACSVL3 humana fue encontrado en un compartimiento subcelular puntiforme que parcialmente colocalized con mitocondrias como se determinó por microscopía de inmunofluorescencia y fraccionamiento subcelular. A partir de estos estudios, se concluye que ACSVL3 es una nueva diana terapéutica prometedora en el cáncer de pulmón
Visto:. Pei Z, Fraisl P, Shi X, Gabrielson E, Forss-Petter S, Berger J, et al. (2013) Muy larga cadena acil-CoA sintetasa 3: Sobreexpresión y Dependencia de crecimiento en el cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (7): e69392. doi: 10.1371 /journal.pone.0069392
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Julio, 2012; Aceptado el 13 de junio de 2013; Publicado: 23 de julio 2013
Derechos de Autor © 2013 Pei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud subvenciones HD024061, NS037355, y NS062043 (PATA) y el Fondo de Ciencias de Austria (FMF) P14163-MOB. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
acil-CoA sintetasas (ACS) catalizar la tioesterificación dependiente de ATP de ácidos grasos (FA) a la coenzima a (CoA) [1]. Esta "activación" paso es necesario para la AF para participar en casi todas las reacciones metabólicas posteriores. Sobre la base de su acilo preferencia de longitud de cadena, así como su homología de secuencia de aminoácidos, el 26 SCA diferentes que se encuentran en los seres humanos se puede dividir en varias familias distintas de enzimas, incluyendo el "de cadena larga muy" (ACSVL) de la familia, que contiene 6 miembros. Cinco enzimas de la familia ACSVL pueden activar largo de cadena larga a sustratos muy FA; el sexto miembro de esta familia es una sintetasa de ácidos biliares-CoA específico de hígado [2]. Además de sus funciones metabólicas, estas enzimas también se han investigado como proteínas de transporte (FA FATP) [3], ya que tres de los seis miembros de la familia promover la captación celular de cadena larga FA [4]. La designación oficial de los genes que codifican la familia ACSVL /FATP es
SLC27A1-6
propiedades previamente descritos de ACSVL3 ratón (Slc27a3; FATP3). [5]. Cuando ACSVL3 se sobreexpresa en células COS-7, la proteína localizada en el retículo endoplásmico. Sin embargo, la enzima endógena en las células de Leydig MA-10 de testículo de ratón parcialmente colocalized con mitocondrias tanto por centrifugación diferencial y la inmunofluorescencia. caída transitoria de ACSVL3 usando siRNA disminuyó la capacidad de MA-10 células para activar ya sea de cadena larga (palmitato; C16:0) o de cadena larga muy (lignocerato; C24:0) FA. Sin embargo, ACSVL3 caída no afectó a la capacidad de las células MA-10 para tomar C16:0. Esta última observación se confirmó posteriormente cuando la expresión del ACSVL3 de mamífero en la levadura no para promover la absorción de cadena larga FA [4]. transferencia de Northern y análisis de Western blot de los tejidos de ratón adulto revelaron que la enzima se expresa principalmente en la glándula suprarrenal, ovario y testículo, con la expresión más débil en otros tejidos tales como cerebro, pulmón, riñón y [5]. Los altos niveles de mRNA ACSVL3 estaban presentes en embrionaria (E12) de cerebro de ratón; Sin embargo, la expresión disminuyó rápidamente y por un mes de edad, el ARNm fue apenas detectable.
secciones de cerebro de ratón adulto mostraron inmunotinción débil ACSVL3 en las neuronas corticales, las neuronas del hipocampo y células de Purkinje del cerebelo, pero no se detectó la proteína en las células gliales [5]. Por consiguiente, era inesperado cuando encontramos ACSVL3 a ser marcadamente sobreexpresado en los gliomas malignos y en líneas celulares de glioblastoma humanos [6]. El derribo de expresión ACSVL3 en células de glioblastoma humano U87 disminuyó su comportamiento maligno tanto en cultivo como cuando se inyecta por vía subcutánea o por vía intracraneal en ratones. Por lo tanto, nos preguntamos si ACSVL3 se expresa en otros tumores malignos humanos, tales como cáncer de pulmón, que es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo [7]. En el presente trabajo, se muestra que ACSVL3 está altamente sobreexpresado en todos los tumores de pulmón y las líneas celulares examinadas. En líneas celulares de cáncer de pulmón, el agotamiento ACSVL3 mejoró significativamente sus propiedades de crecimiento malignos. También se describen las propiedades bioquímicas adicionales de ACSVL3 humano.
Materiales y Métodos
Materiales
[1-
14C] ácido palmítico (C16:0), [1 -
14C] ácido oleico (C18:1), [1-
14C] ácido araquidónico (C20:4), [1-
14C] ácido docosahexaenoico (C22:6) y [1-
14C] lignócerico (C24:0) se obtuvieron de Moravek Bioquímicos Inc. (Brea, CA, EE.UU.). [1-
14C] ácido linoleico (C18:2) era de American radiomarcados Chemicals (St. Louis, MO, EE.UU.). Policlonal antisuero ovejas a 70 kDa proteína de la membrana peroxisomal (PMP70) fue una donación del Dr. S. Gould (Johns Hopkins Univ. Sch. Med.). anticuerpo monoclonal de ratón para la proteína disulfuro isomerasa y el anticuerpo policlonal de conejo al manganeso-superóxido dismutasa (MnSOD), eran de Stressgen (San Diego, CA, EE.UU.). anticuerpo policlonal de conejo a la ATP sintasa fue de Chemicon (Chemicon Internacional, Temecula, CA, EE.UU.). anticuerpo policlonal de conejo a fosfatidiletanolamina N-metiltransferasa 2 (PEMA), fue un regalo del Dr. D. Vance (Universidad de Alberta, Edmonton, Canadá). policlonal de conejo purificado por afinidad de anticuerpos anti-ACSVL3 se describió anteriormente [5]. anticuerpos secundarios conjugados con HRP para transferencias Western fueron ya sea de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, EE.UU.) o Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, EE.UU.), y los anticuerpos secundarios para inmunofluorescencia fueron de Jackson ImmunoResearch (West Grove , PA, EE.UU.). De-identificados, fueron obtenidos y utilizados de acuerdo con un protocolo aprobado por la Oficina de la Universidad Johns Hopkins de Sujetos Humanos de Investigación Juntas de Revisión Institucional (Protocolo NA_00003308) secciones de parafina de formaldehído-fijo de tejidos humanos de cáncer de pulmón de dos pacientes; Este protocolo permite el uso de tejidos sin identificación, sin el consentimiento por escrito adicional (aparte de la incluida en las formas procedimiento de consentimiento). Una matriz de tejido (catálogo#CBL-TMA-078) que contiene pulmón humano normal y 67 tumores de pulmón diferentes se adquirió de creativo BioLabs (Port Jefferson Station, Nueva York).
Clonación de ADNc humano ACSVL3 y construcción de plásmidos de expresión se obtuvo
secuencia ACSVL3 de longitud completa usando un enfoque combinatorio de etiqueta de secuencia expresada de cribado (EST) y el aislamiento de secuencias asociadas utilizando diversas estrategias de clonación. En resumen, un solo clon (C24355, Stratagene;. De Acceso GenBank no BC003041) que contenía un marco de lectura abierto largo, pero sin límites 5 'se utilizó como base para obtener adicional secuencia 5', empleando genómico primer walking. La posteriormente identificado 5 'secuencia de ADN genómico ampliado sirve para identificar un clon adicional EST, procedentes de una biblioteca enriquecida en clones de longitud completa que se había obtenido a través del método Cap-trapper [8], que se encuentra aguas arriba de la primera ATG en BC003041 clon . Este nuevo clon EST (GenBank adhesión no. BG720126), podría estar alineado con el ADN genómico y siempre que la nueva secuencia de cDNA a partir de la posición -115 a +179, que sirvió como molde para su posterior diseño de cebadores para obtener ADNc de longitud completa . Una construcción con un marco de lectura abierto completo del gen ACSVL3 humano fue montado en un protocolo de dos pasos. En primer lugar, un 2480-bp
Hind III-
EcoR I
fragmento se escindió del C24355 clon de ADNc y se inserta en el vector de expresión pcDNA3.1 (+) (Invitrogen), produciendo P434. En el segundo paso, un fragmento de PCR de 915 pb se amplificó a partir del exón 1 del clon ACSVL3 genómico, utilizando el cebador, 549 (5'-CGCCAAGCTTAGCCAGATGCCTAAA-3 '), con el ATG (1) hacia adelante subrayado, y el cebador inverso 530 (5'-AGCGCCACAGTTGCTCCAGGT-3 '), se purificó, se digirió con
Hind III
(introducido con el cebador 549) y
Eco47
III, un sitio de restricción único en el cDNA ACSVL3, y se clonó en
Hind III
,
Eco47 III digerido
P434, P435 dando como resultado el plásmido, que contiene la construcción de longitud completa del ACSVL3. La secuenciación del ADN se realizó por MWG Biotech (Ebersberg, Alemania).
Líneas celulares y condiciones de cultivo
HepG2 de hepatoma humano, COS-1, y el A549, H82, H460, EKVX, y U1752 de pulmón líneas celulares de cáncer eran de ATCC (Rockville, MD). células HepG2 se mantuvieron en medio esencial mínimo (Mediatech, Manassas, VA) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Gemini Bioproducts). células COS-1 se cultivaron en DMEM (Mediatech) suplementado con 10% FBS. Todas las líneas celulares de cáncer de pulmón se mantuvieron en RPMI (Mediatech) suplementado con 10% FBS. Las células inmortalizadas humanas epiteliales bronquiales (HBEC) [9] fueron proporcionados generosamente por el Dr. Jerry Shay (Universidad de Texas Medical Center suroeste) y se mantuvieron en BEGM libre de suero (Medio de Crecimiento epitelial bronquial, Lonza, Walkersville, MD). Todas las células se cultivaron en un incubador humidificado a 37 ° C en 5% de CO
2/95% de aire.
Producción de líneas clonales con Estable ACSVL3 Derribo y medición de anclaje independiente de crecimiento de la célula y tarifas Adherente
los clones con caída estable de ACSVL3 se produjeron utilizando el pSilencer ™ 4.1-CMV vector hygro (Ambion) como se ha descrito anteriormente [6]. Los vectores que contienen secuencias de derribo ACSVL3-3 (dirigidas a los nucleótidos 397-415) y ACSVL3-4 (dirigidas a los nucleótidos 1863-1881), que ambas se mostraron previamente para disminuir la expresión ACSVL3 en las células humanas, se transfectaron conjuntamente en el A549, EKVX, H82, y líneas celulares de cáncer de pulmón H460 por electroporación. Control de las células fueron transfectadas con un vector pSilencer (suministrados por Ambion) que no se dirige ni a cualquier secuencia de ARNm humano. Los clones que albergan establemente control y plásmidos desmontables fueron seleccionadas por la higromicina (250 g /ml) de resistencia y se analizaron para la expresión ASCVL3 por inmunofluorescencia y Western blot. La proliferación celular y el crecimiento independiente de anclaje se midieron como se describe anteriormente [6].
ARN de transferencia por puntos y transferencia Northern Los análisis
Una expresión de múltiples tejidos (MTE) matriz que contiene poli (A) -seleccionado ARN de 61 diferentes tejidos humanos adultos se obtuvo de Clontech. Una sonda de ADNc se preparó mediante amplificación por PCR de un fragmento de 657 pb (posición 1631 a 2287 de ACSVL3 mRNA SLC27A3 /, NCBI nº de acceso NM_024330) utilizando 5'-GCACTGTATGGCCACATCTCC-3 'y 5'-TCTCTCAGGTGCCTCAGGTGT-3' como avance y retroceso cebadores, respectivamente, y el plásmido que contiene P435 de longitud completa ACSVL3 cDNA como plantilla. Para verificar la especificidad de la sonda para ACSVL3, una búsqueda BLAST y múltiples alineamientos de secuencias usando los otros miembros de la familia ACSVL /SLC27A se llevó a cabo y no revelaron ninguna similitud con SLC27A1, 4, y 5, y sólo bajo similitud con SLC27A2 y 6 ( no mostrada). Para el control, una sonda de 528 pb gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se preparó por PCR utilizando 5'-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3 'y 5'-CTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3' como cebadores directo e inverso, respectivamente. Condiciones para la marcación de la sonda, la hibridación y la detección fueron como se describe anteriormente [10], [11]. La hibridación con la sonda de GAPDH fue robusto para todos los puntos de ARNm (no mostrados).
Para el análisis de transferencia de Northern, la misma sonda como para array MTE se hibridó a un tejido múltiple de transferencia de Northern humana (Ambion, Austin, TX, ESTADOS UNIDOS); una sonda de pollo β-actina se utilizó como control. La hibridación se llevó a cabo utilizando soluciones expresan hibridación (Clontech) durante la noche a 65 ° C y lavado a baja severidad usando 2 x SSC, 0,05% de SDS durante 40 min a 65 ° C, seguido de 0,1 x SSC, 0,1% SDS durante 40 min a 50 ° C para una mayor rigurosidad. La hibridación de sondas se detectó por la exposición a la Molecular Imager FX System (Bio-Rad).
fraccionamiento subcelular y células HepG2 Western Blot Analysis
se fraccionaron como se ha descrito anteriormente [12]. La transferencia Western se realizó como se describió anteriormente [13]. Para la inmunodetección del ratón anti-MnSOD, conejo anti-PEMA o de conejo anti-ACSVL3 anticuerpos primarios se utilizaron junto con HRP-conjugado anti-conejo y anticuerpos secundarios anti-ratón.
Inmunofluorescencia indirecta e inmunohistoquímica
células HepG2 cultivadas a ~ 60% de confluencia en cubreobjetos de vidrio fueron fijadas en formaldehído al 4% en PBS y se permeabilizaron con 1,0% Triton X-100 antes de la incubación con primaria (conejo anti-ACSVL3, de oveja anti-PMP70, anti-proteína de ratón disulfuro anticuerpos isomerasa, o de conejo anti-sintetasa ATP) y secundario (conjugado con FITC anti-conejo o conjugado con rodamina anti-ratón o anti-IgG de oveja) como se describe anteriormente [14]. La fluorescencia se visualizó usando un microscopio de epifluorescencia Zeiss Axiovert. Detección inmunohistoquímica de ACSVL3 en las secciones histológicas de los tumores de pulmón humanos fue descrito como anteriormente [5], [6].
acil-CoA sintetasa Ensayo
COS-1 células fueron transfectadas con la expresión ACSVL3 P435 plásmido o vector vacío mediante electroporación como se describe anteriormente [15]. Las células se cosecharon 3 días después de la transfección, se lavaron, se suspendieron en tampón de homogeneización, y se almacenaron a -80 ° C antes del ensayo. La activación de [1-
14C] marcado con FA (C16:0, C24:0, C18:1, C18:2, C20:4 o C22:6) a sus tioésteres CoA se realizó como se describió anteriormente [15] . Los ensayos con C16:0 contenían 15 g de proteína de células COS, los ensayos con C24:0 contenían 60 g de proteína, y los ensayos con el resto de la FA contenían 50 g de proteína.
Composición de Ácidos Grasos
H460 y las células fueron cultivadas a EKVX cerca de la confluencia, se recogieron por tripsinización suave, y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato. Se extrajeron los sedimentos celulares que contienen proteína de 1,0 mg, derivatizado con bromuro de pentafluorobencilo, y se cuantificaron por cromatografía capilar de gas-captura de electrones espectrometría de masas de iones negativos (GC /MS) como se describe por Lagerstedt et al. [dieciséis]. Los resultados se presentan como porcentaje del total de ácidos grasos.
Resultados
Distribución tisular de ARNm humano ACSVL3
expresión ACSVL3 mRNA fue examinado por RNA dot análisis utilizando una expresión de múltiples tejidos borrar (MTE ™) de matriz que contiene 61 muestras de tejido humano adulto (fig. 1A). La intensidad de señal de cada punto individual se cuantificó y se calculó ACSVL3 expresión relativa a la de GAPDH. Las señales más fuertes ACSVL3 normalizados estaban presentes en el páncreas, el estómago, la aorta, y el bazo. En el sistema cardiovascular, ACSVL3 ARNm fue particularmente enriquecido en la aorta, en relación con todas las áreas del corazón. La transcripción ACSVL3 fue relativamente abundante en todo el sistema digestivo, lo que indica un posible papel en el metabolismo intestinal FA. El mRNA también se pudo detectar fácilmente en la mayoría de los tejidos linfoides, y en el sistema reproductor y el tracto urinario. moderada intensidad de la señal se obtuvo de la mayoría de las glándulas, excepto la glándula mamaria y la hipófisis, donde apareció el nivel más alto. Casi todas las regiones del sistema nervioso central, excepto el cerebelo y la glándula pituitaria, tenían niveles muy bajos de ARNm ACSVL3. ACSVL3 expresión en el músculo esquelético era también muy débil. No hay señal indicativa de la unión no específica de la sonda ACSVL3 a diversas muestras de ARN de control y de ADN se observó.
Análisis (
Un
) ARN expresión de múltiples tejidos humanos (MTE ™) matriz de transferencia por puntos. El ARN de transferencia de mancha se hibridó con un fragmento de PCR
32P marcado con, 657 pb derivado de la ACSVL3 cDNA humano como se describe en Métodos. La membrana fue despojado y se hibridó con una sonda de GAPDH para el control de la abundancia de ARNm. intensidad de señal de los puntos individuales se cuantificó usando el software ImageJ (disponible a partir de: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html), y se calculó la expresión ACSVL3 relación a la de GAPDH. (
B
) tejido de transferencia de Northern múltiple humana que contiene 2 g de poli (A)
+ - seleccionado ARN se hibridó con la misma sonda ACSVL3 cDNA como en
(A)
. Los carriles son: M, marcadores Millenium ™; 1, el cerebro; 2, hígado; 3, la placenta; 4, el intestino delgado; 5, colon; 6, el timo; 7 bazo; 8, de la próstata; 9, testículos; y 10, ovario. tamaño aproximado de las bandas detectadas se muestran a la derecha. la hibridación de control con una sonda de β-actina se muestra en el panel inferior.
Para establecer el tamaño de ACSVL3 mRNA, una transferencia de Northern de múltiples tejidos humanos se hibridó con la sonda utilizada para el blot MTE. Esta sonda detecta un 2,7 kb ACSVL3 transcripción en todos los tejidos excepto el cerebro (Fig. 1B, parte superior). La ausencia de una señal de la muestra de cerebro es probablemente debido a la baja cantidad de ARNm presente en este carril, tal como se documenta por el control de β-actina (Fig. 1B, parte inferior). El tamaño del ARNm es similar a la predicha a partir de ACSVL3 cDNA. Una segunda especie de ARNm de aproximadamente 1,5 kb aparecieron en el hígado, testículos y la próstata (Fig. 1B, parte superior). Este ARNm más pequeño era más abundante en el hígado y, por tanto, más probable es que contribuyó a la alta señal en el hígado en la transferencia de puntos. El pequeño tamaño de esta secuencia de hibridación cruzada no sería capaz de acomodar el marco de lectura abierto de un ACS típico y por tanto no se analizó adicionalmente. En general hay una buena correlación de los niveles de expresión entre la transferencia de Northern y la matriz de tejido múltiple.
Acil-CoA sintetasa Actividad de ACSVL3 humano
Se analizó la capacidad funcional de la proteína humana para activar ACSVL3 FA a sus tioésteres CoA siguientes sobreexpresión en células COS-1. En comparación con células COS-1 transfectadas con el vector vacío, las células que expresan ACSVL3 mostraron una mayor actividad ACS cuando se ensaya con varios sustratos FA. No se observaron aumentos estadísticamente significativos en la activación de ácido palmítico (C16:0), ácido oleico (C18:1ω9), ácido α-linoleico (C18:2ω6) y ácido araquidónico (C20:4ω6) (Fig. 2). A pesar de que habitualmente mide el aumento de la capacidad para activar la cadena muy larga FA, lignócerico (C24:0), esto no alcanzó significación estadística. También se observó un ligero aumento en la activación de ácido docosahexaenoico (C22:6w3), pero no fue estadísticamente significativa. De manera similar a lo que se ha demostrado para otras enzimas ACSVL [15], [17], [18], sobreexpresa la proteína activa ACSVL3 de cadena larga FA en mayor medida que los de cadena larga muy FA.
COS-1 células que sobreexpresan ACSVL3 (barras grises) a partir del plásmido P435 (ver Métodos) y células de control transfectadas con vector vacío (barras blancas) se ensayó la actividad ACS usando el ácido graso C14 indicado
como sustrato como se describe en Métodos. Una unidad (U) de la enzima de actividad = 1 mmol /min. Los resultados se presentan como la media ± S.D. de tres experimentos de transfección independientes. ns: no significativo. p-valores: * Se convierte la 0,05; ** & Lt; 0,01; ***. & Lt; 0,001
ACSVL3 localización subcelular en células HepG2
La inmunofluorescencia indirecta se utilizó para localizar ACSVL3 endógeno en la línea celular de hepatoma humano HepG2. ACSVL3 exhibió un patrón de fluorescencia punteada cuando se observa por microscopía confocal (Fig. 3a, d, y g). ACSVL3 inmunotinción de estas estructuras punteadas no colocalize, ya sea con el marcador de peroxisomal, PMP70 (Fig. 3b y c) o el marcador del retículo endoplásmico, la proteína disulfuro isomerasa (Fig. 3E y F). ACSVL3 inmunofluorescencia colocalized parcialmente con mitocondrias visualizaron utilizando ATP sintasa como un marcador (Fig. 3 h y i).
La microscopía confocal se usó para detectar ACSVL3 endógena en las células HepG2 por inmunotinción con anticuerpo anti-ACSVL3 (a, d, y g). Doble etiquetado con anti-ACSVL3 (a) y anti-PMP70 (b) demostró que las vesículas que contienen ACSVL3-puntiformes no eran peroxisomas cuando las imágenes se fusionaron (c). Doble etiquetado con anti-ACSVL3 (d) y disulfuro isomerasa anti-proteína (e) como un marcador para el retículo endoplásmico no reveló colocalización en la imagen combinada (f). Haga doble etiquetado utilizando anti-ACSVL3 (g) y anti-ATP sintasa (h) mostró colocalización parcial de ACSVL3 con mitocondrias en la imagen combinada (i).
Para caracterizar mejor la localización subcelular de ACSVL3 , las células HepG2 se fraccionaron por centrifugación diferencial. Los homogeneizados se separaron en fracciones enriquecidas en los núcleos (N), mitocondria (M), peroxisomas (L), retículo endoplásmico (P), y el citosol exento de membrana (S), y se analizaron por transferencia Western. ACSVL3 se encuentra principalmente en el M-fracción (Fig. 4), como se indica por la presencia de la proteína marcadora mitocondrial MnSOD. En menor medida la proteína también puede ser detectada en la N-fracción. No hay señal ACSVL3 se pudo detectar en el L-, P, o S-fracciones. La presencia de ACSVL3 en el N-fracción es probablemente debido a la contaminación con células incompletamente homogeneizado, como MnSOD y fosfatidiletanolamina N-metiltransferasa 2 (PEMA) también fueron detectados en esta fracción (Fig. 4).
células HepG2 se fraccionaron en nuclear (N), mitocondria (M), mitocondrial luz (L), microsomal (P), y citosólica (S) fracciones por centrifugación diferencial, y un mitocondrial total (ML) fracción se separó adicionalmente en mitocondrial purificada (Mito ) y de membrana (MAM) fracciones mitocondrias asociada, como se describe en Métodos. Cada carril se cargó con ~ 30 g de proteína. análisis de Western blot de la misma membrana se llevaron a cabo utilizando anticuerpos contra ACSVL3, el marcador mitocondrial Mn-superóxido dismutasa (MnSOD), y el marcador de MAM fosfatidiletanolamina N-metiltransferasa (PEMA).
Debido colocalización de ACSVL3 y las mitocondrias por inmunofluorescencia no era completa, especuló que ACSVL3 podría encontrarse en la fracción de membrana asociada a mitocondrias (MAM), un compartimiento retículo endoplásmico derivado de que los sedimentos con las mitocondrias durante la centrifugación diferencial [19]. Por lo tanto, hemos resuelto la fracción MAM de las mitocondrias purificadas por centrifugación a través de Percoll. La proteína marcadora-MAM específica, PEMA, se detectó en sólo la fracción MAM, lo que demuestra la separación exitosa de las mitocondrias y MAM. Hubo un enriquecimiento significativo de la señal de ACSVL3 en la mitocondria purificada, pero la proteína no fue detectable en la fracción de MAM (Fig. 4). Como hemos observado solamente colocalización parcial de ACSVL3 con mitocondrias mediante análisis de inmunofluorescencia (Fig. 3), a pesar de su sedimentación en esta fracción y su ausencia de la fracción de MAM, se propone que la proteína ACSVL3 reside en una novela compartimento subcelular que es distinta de, pero estrechamente asociada con mitocondrias. Se obtuvo un resultado similar para ACSVL3 murino [5].
Expresión ACSVL3 en condiciones normales de pulmón humano y en tumores de pulmón
Hemos informado anteriormente de que, a pesar de la debilidad de expresión en el cerebro y esencialmente ninguna proteína detectable en glia, niveles ACSVL3 fueron elevados robustamente en glioma maligno y en líneas celulares de glioblastoma humanos [6]. Para determinar si otros tumores malignos sobreexpresa ACSVL3, examinamos la expresión de esta proteína en el pulmón humano normal y en tumores de pulmón por inmunohistoquímica. se observó expresión ACSVL3 Modest en células epiteliales bronquiales y bronquiolares normales (Fig. 5). No ACSVL3 tinción histoquímica se observó en tipo I o II de las células alveolares de tipo, células caliciformes, células del estroma, o células que comprenden la vasculatura pulmonar. Por el contrario, las secciones de tejido de tumores resecados de dos pacientes en el Hospital Johns Hopkins, uno diagnosticado como adenocarcinoma y el otro como el carcinoma de células escamosas, exhibió niveles muy elevados ACSVL3 (no mostrados). Para confirmar estas observaciones iniciales, se realizó un análisis inmunohistoquímico en una matriz de tejido que contiene 67 tumores de pulmón humanos diferentes. Representados en la matriz fueron de 25 carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas 21, 6 adenocarcinomas papilares, 7 carcinomas de células pequeñas, 3 carcinomas de células grandes, carcinoma bronquioloalveolar uno, un carcinoma de células escamosas basaloide, y 3 tumores carcinoides. De estos tumores, 100% mostró sobreexpresión de ACSVL3; varios tumores representativos se muestran en la Fig. 5. No hubo correlación obvia entre la extensión de la expresión ACSVL3 y el estado de diferenciación del tumor.
Las secciones en parafina de los tumores pulmonares presentes en una matriz de tejido fueron immunostained con anticuerpos anti-ACSVL3 (marrón) y contraste con hematoxilina (azul). Los tumores representante de los 67 tumores diferentes presentes en la matriz, así como el tejido pulmonar normal, se muestran. Todos los tumores se tiñeron positivo para ACSVL3. Aumento total, 400 ×. Bar = 50 micras.
Expresión ACSVL3 en el pulmón líneas celulares tumorales
Para confirmar y ampliar estas observaciones, se examinó la expresión ACSVL3 en las células epiteliales bronquiales humanas normales (HBEC), y en varias líneas celulares de cáncer de pulmón. expresión ACSVL3 era apenas detectable en HBEC (Fig. 6A y 6B). Las líneas celulares derivadas de tumores humanos de pulmón, que representan carcinoma de células pequeñas (H82), carcinoma de células no pequeñas (A549), adenocarcinoma (EKVX), carcinoma de células escamosas (U1752), y carcinoma de células grandes (H460), todos expresaron robustamente ACSVL3 ( Fig. 6A).
(
Un
) El crecimiento en condiciones de cultivo estándar. líneas celulares de cáncer de pulmón HBEC y cinco se cultivaron como se describe en Métodos y analizados para la expresión ACSVL3 por Western blot. líneas de células tumorales se derivan de carcinoma de células no pequeñas (A549), carcinoma de células pequeñas (H82), carcinoma de células grandes (H460), adenocarcinoma (EKVX), y carcinoma de células escamosas (U1752). expresión ß-actina se determinó como control de carga. (
B Opiniones) Efecto de la reducción de la tasa de crecimiento en la expresión ACSVL3 en líneas celulares de cáncer de pulmón. HBEC, cultivadas en BEGM libre de suero, crecer significativamente más lento que las líneas celulares de cáncer. Para frenar sus tasas de crecimiento, las células A549, H82, H460 y U1752 se transfirieron a BEGM. Todas las células se mantuvieron en este medio durante 3 semanas, momento en el que se recogieron y se sometieron a análisis de transferencia de Western. Las células tumorales cultivadas en medio estándar, RPMI más 10% de suero bovino fetal (FBS), se recogieron para la comparación. Las tasas de crecimiento en BEGM de todas las líneas celulares de cáncer se redujeron en más del 50%.
HBEC creciendo a un ritmo lento, ya que se cultivan en medio sintético libre de suero (BEGM) para prevenir la diferenciación escamosa [ ,,,0],20]. Debido a que las líneas de células tumorales, cultivadas en medio rico que contiene suero bovino fetal, crecen significativamente más rápido que HBEC, nos preguntamos si los niveles de alta ACSVL3 eran simplemente una consecuencia de la rápida tasa de crecimiento. Cuatro líneas de células tumorales, A549, H82, H460, y U1752, se transfirieron a BGEM libre de suero y se mantuvieron en este medio durante tres semanas. A pesar de a & gt; 50% de disminución en la tasa de crecimiento, todas estas líneas celulares mantienen una expresión de alto ACSVL3 (figura 6B.). Esta observación sugiere que otros factores además de la tasa de crecimiento son responsables del mantenimiento de altos niveles de ACSVL3 en líneas celulares de cáncer.
Efecto de ACSVL3 Derribo de adherente y no adherente Crecimiento de Líneas de pulmón de células tumorales en Cultura y
caída estable de expresión ACSVL3 en células de glioblastoma disminuyó su fenotipo maligno en cultivo [6]. Tanto el crecimiento en placas de cultivo y la capacidad de formar colonias en agar blando suspensión fueron más característica de las células normales cuando ACSVL3 se agotó. Para determinar si la expresión ACSVL3 también influyó en el crecimiento de células de cáncer de pulmón, produjimos cuatro líneas con ACSVL3 estable desmontables utilizando la interferencia de ARN como se describe en Métodos. líneas celulares de control que albergan establemente un plásmido que codifica un ARN corto horquilla revueltos también se produjeron. Las cuatro líneas de células desmontables habían disminuido los niveles de proteína ACSVL3 por Western blot (Fig. 7).
El corto vector pSilencer horquilla productoras (Ambion) se utilizó para generar varias líneas celulares de cáncer de pulmón con disminución de la expresión como se describe ACSVL3 en los métodos. Se seleccionaron las líneas clonales de H460, H82, A549, y las células de cáncer de pulmón, con la eliminación EKVX estable (KD) de ACSVL3. Las líneas de control de forma estable albergan un plásmido que contiene una secuencia codificada que no se dirige ningún mRNA humanos o de roedores. (
Un
) ACSVL3 expresión en el control y KD células se evaluó mediante Western Blot. (
B Opiniones) software de Gel-Pro Analizador 4.0 se utilizó para cuantificar las señales de Western blot en (A). Expresión de ACSVL3 en relación con ß-actina se calculó para cada par de control y líneas de células KD. relaciones de línea celular de control se establecieron arbitrariamente a 100 y se calculó el, la expresión normalizada relativa de ACSVL3 en células KD. Las barras blancas, células de control; barras grises, KD células.
Luego midieron el efecto de la caída ACSVL3 sobre la proliferación de líneas celulares de cáncer de pulmón cultivadas H460 y H82. Como se muestra en la Fig. 8A, la falta de ACSVL3 disminución de las tasas de crecimiento de células de 65-76% (medido en el día 6). También se midió el crecimiento no adherente de cuatro líneas celulares, A549, EKVX, H82 y H460, en suspensión en agar blando. Como se muestra en la Fig. 8B, la formación de colonias se redujo en todas las líneas celulares deficientes en ACVL3 por 65 a 80%. Estos hallazgos indican que el agotamiento ACSVL3 en células de cáncer de pulmón, al igual que en las células de glioblastoma, disminuye su maligna
in vitro
fenotipo de crecimiento en.
(
Un
) El crecimiento de la cultura. De control (▪) y desmontables células (▴) H460 y H82 (5 × 10
3) fueron sembradas en placas de 6 pocillos. En los días 2, 4, 6 y 8, las células de pocillos por triplicado se recogieron por tripsinización y se contaron usando un hemocitómetro. Media ± S.D. se representa. (
B Opiniones) el crecimiento independiente del anclaje. Agradecemos a los Dres.