Extracto
Antecedentes
La metástasis es un proceso mediante el cual las células cancerosas aprenden a formar tumores en órganos distantes vía satélite y representa la principal causa de muerte de los pacientes con tumores sólidos. NSCLC es el cáncer humano más letal debido a su alta tasa de metástasis.
Análisis
Metodología /Principales conclusiones
La falta de un modelo animal adecuado ha dificultado hasta el momento de la progresión metastásica. Hemos examinado c-MYC por su capacidad para inducir la metástasis en un modelo de ratón impulsada por el C-RAF para el cáncer de pulmón de células no pequeñas. c-MYC inducida por sí solo el crecimiento del tumor franca sólo después de mucho tiempo de latencia en el que se detectaron mutaciones secundarias de tiempo en K-Ras o LKB1 reminiscencia de NSCLC humano. Combinación con C-RAF llevó a la aceleración inmediata del crecimiento del tumor, la conversión a las células epiteliales papilares y la inducción cambio angiogénico. Por otra parte, además de c-myc fue suficiente para inducir macrometástasis en hígado y ganglios linfáticos con corta latencia asociada con episodios de cambio de linaje. Por lo tanto hemos generado el primer modelo condicional para la metástasis del NSCLC e identificado un gen, c-MYC que es capaz de orquestar todos los pasos de este proceso.
Conclusiones /Importancia
Los posibles marcadores para la detección de metástasis fueron identificados y validado para el diagnóstico de biopsias humanas. Estos marcadores pueden representar dianas para la intervención terapéutica futuro, ya que incluyen genes tales como Gata4 que se expresa exclusivamente durante el desarrollo del pulmón
Visto:. Rapp UR, Korn C, Ceteci F, Karreman C, Luetkenhaus K, Serafin V, et al. (2009) Myc es un gen de metástasis no pequeñas de pulmón de células. PLoS ONE 4 (6): e6029. doi: 10.1371 /journal.pone.0006029
Editor Syed A. Aziz, Health Canada, Canada |
Recibido: Abril 29, 2009; Aceptado: 25-may de 2009; Publicado: 24 Junio 2009
Derechos de Autor © 2009 Rapp et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por Deutsche Krebshilfe - Fundación Mildred Scheel (subvención 106253) y por la DFG (subvenciones TR17). Emanuele Zanucco fue apoyado por una beca de la Iniciativa de Excelencia alemana a la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Würzburg. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la metástasis es un proceso de múltiples pasos complejo por el cual las células del tumor primario sean capaces de entrar y salir de la vasculatura, ubicarse en sitios distantes y eventualmente crecer a los tumores secundarios macroscópicos [1]. En general se cree que la conversión metastásico es un proceso de mutación impulsada. Un número de genes y productos génicos han sido identificados que positiva o negativamente afecta a la probabilidad de líneas celulares de tumores humanos establecidos de metástasis [2], [3], [4]. Los productos génicos incluyen receptores y elementos de sus intracelulares cascadas de transducción de señales del factor de crecimiento. Reguladores de la polaridad celular representan una segunda clase de genes que pueden promover la metástasis [5], [6]. Mediante el uso de una línea celular de cáncer de pulmón de ratón, carcinoma de pulmón de Lewis (LLC), una tercera categoría de los reguladores de metástasis recientemente se ha descrito que puso de relieve la importancia de la inflamación como motor [7]. Por otra parte, el candidato metástasis inductores o -suppressing genes también incluyen genes que codifican micro ARN que regulan conjuntos de genes asociados con la proliferación, invasión o migración [8], [9].
Si bien el trabajo con líneas de células tumorales humanas in los ratones ha sido esclarecedor, la falta de conocimiento acerca de su repertorio de genes del cáncer, así como la incapacidad para estudiar la cinética de la progresión tumoral espontánea en estos modelos limitar su utilidad. Por ello, hemos establecido un modelo de ratón para el cáncer de pulmón de células no pequeñas humano (NSCLC) en el que el adenoma premalignas es inducida por un
RAF
transgén expresado específicamente en alveolares de tipo II las células epiteliales del pulmón [10]. NSCLC es el cáncer de pulmón humano más frecuente y la principal causa de muerte por cáncer en el hombre. Generación de ratones que llevan compuestos además de
RAF en otras transgenes que codifican las proteínas que modulan las vías de señalización alteramos frecuencia en NSCLC humano nos permitió desentrañar dos pasos clave en el proceso de metástasis, la inducción de la cambio angiogénico y la progresión a micrometástasis asocia con la reprogramación de los genes selectores intestinales [11]. β-catenina fue identificado como el inductor interruptor crítico para ambas etapas y también promovió el crecimiento invasivo [11].
Como 50% de NSCLC humanos llevan mutaciones en los genes que codifican activadores de la cascada mitogénica (RAS-RAF- MEK-ERK) [12] y esta cascada se sabe que inducen un gen diana de la ß-catenina, c-myc [13], se decidió examinar directamente la capacidad de c-MYC para promover la progresión tumoral en nuestra murino impulsado por la RAF modelo de cáncer de pulmón. Por otra parte MYC era un candidato, ya que se sabe que afectan a la reprogramación de los tumores en base a nuestros resultados anteriores de la cooperación RAF /MYC en el sistema hematopoyético murino [14], [15]. En los seres humanos, la amplificación y reordenamientos de genes Myc se encontraron en una fracción de NSCLC [16]. Varios grupos han comenzado a evaluar c-myc en modelos de ratón de NSCLC. Endógeno c-MYC está involucrado en no NSCLC inducida por K-Ras metastásico como se demostró mediante el uso de un negativo c-MYC mutante dominante [17]. expresión o función de transgénicos c-MYC inducible demostraron cooperación con mutante K-Ras en la progresión tumoral en diversos grados [18], [19], pero ninguno de los modelos dieron lugar a metástasis. Aquí mostramos que la expresión constitutiva o inducible de c-MYC, además de C-RAF en las células de tipo II es suficiente para inducir rápidamente la metástasis a hígado y ganglios linfáticos. La combinación de transgenes c-myc y C-Raf causados aparición de un interruptor fenotípica de cuboidal a /de las células papilares alveolar columnares epiteliales (APEC) que son las células tumorales de crecimiento más rápido y también predominan en la metástasis de hígado. Además c-MYC induce la producción de VEGF por las células tumorales que llevan a la vascularización del tumor con los vasos inusuales que son mosaicos que contienen PECAM-1 positivo y PGP 9.5 células endoteliales positivas. PGP 9.5 se conocía anteriormente como un marcador de las células neuroendocrinas inmaduros [20]. conversión metastásica por c-myc puede ser reconstruido en el cultivo celular mediante el uso de células y la infección no metastásicos A-549 con CPNM con un MYC transducción de retrovirus.
Resultados
c-MYC coopera con C- RAF en la causa de muerte relacionada con el cáncer
Para probar si C-RAF y c-MYC cooperan en la transformación de pulmón de células epiteliales de tipo II in vivo, los ratones SPC-C-RAF bXB se cruzaron con SPC-c-myc transgénico ratones. Observación por un período de ≥2 años demostró muerte acelerada en el compuesto (SPC-C-RAF BXB /SPC-c-MYC) ratones (Figura 1A), aunque el grado de aceleración fue de menos de visto previamente en el sistema hematopoyético con MYC /RAF retrovirus [21]. Sin embargo, los ratones compuesto tenía una latencia media que difería significativamente de los ratones transgénicos sola SPC-c-myc mediante el análisis de log-rank. El examen histológico en diferentes puntos temporales reveló que ratones transgénicos individuales difieren en la supervivencia libre de tumor. Considerando SPC-C-RAF BXB o ratones compuestos eran tumor uniformemente positivo a las dos semanas de edad, SPC-c-myc individuales ratones transgénicos desarrollaron tumores tarde y con penetrancia incompleta que indica que c-MYC no es limitante de la velocidad para la proliferación de las células de tipo II y /o que las células sensibles son eliminadas por apoptosis (Figura 1B).
(a) gráfico de Kaplan-Meier para SPC-C-RAF bXB (n = 24), SPC-c-MYC (n = 52 ), el compuesto (n = 35) y ratones de control de la misma camada de tipo salvaje (n = 28). Log-rank análisis por ciento de supervivencia para los ratones compuesto vs SPC-C-RAF BXB = p & gt; 0,05; SPC-C-RAF BXB vs SPC-c-MYC = p & lt; 0,0001; ratones compuesto vs SPC-c-MYC = p & lt; 0,0001. n: número de animales. (B) incidencia de tumores en SPC-C-RAF BXB (n = 51), SPC-c-MYC (n = 30), los ratones compuesto (n = 109) y los ratones de control de camada de tipo salvaje (n = 58). Log-rank análisis de la supervivencia libre de tumor de SPC-C-RAF BXB vs SPC-c-myc = p & lt; 0,0001; ratones compuesto vs SPC-c-MYC = p & lt; 0,0001; tipo salvaje vs SPC-c-myc = p & lt; 0,0001. n: número de animales. (C) Cinética de la progresión del tumor. secciones de tumores pulmonares representativas teñidas con hematoxilina y eosina (H & amp; E). El cuadro amarillo y flechas destaca adenoma de células cúbicas (recuadro) en ratones SPC-C-RAF BXB; la caja roja y las flechas indican las células pleomórficas (recuadro) en ratones SPC-c-myc y las cajas blancas muestran un adenoma de células columnares (recuadro) en ratones compuestas. Para la evaluación de la invasividad en la interfase tumor-estroma, las áreas enmarcadas de la tercer panel se magnifican en el panel inferior. Los genotipos y las edades de los ratones como se indica. Aislados pequeños grupos de células tumorales de todo el tumor principal se indican con flechas rojas. Barra de escala: 100 micras. (D, E) H & amp; E tinción de secciones de pulmón incluidos en parafina a partir del compuesto (D) y los ratones SPC-c-myc único transgénico (E) que muestra los tumores papilares en los bronquiolos. Edad de los ratones como se indica. (F) la progresión desmoplásico de los tumores de pulmón de un ratón compuesto. Edad de los ratones como se indica. Barra de escala, 100 micras.
Lesiones premalignas en SPC-c-myc ratones transgénicos sola
Antes de la aparición de tumores malignos en franca SPC-c-MYC individuales grupos de ratones transgénicos de células pleomórficas se detectan en los pulmones que son fuentes potenciales de metástasis células iniciadoras (CIM) (Figura 1C). Curiosamente, las agrupaciones pleomórficas en pulmones de supervivientes a largo plazo a menudo se disminuidos o completamente ausente (datos no mostrados). Con el fin de caracterizar estos posibles lesiones premalignas, la expresión de genes que regulan la proliferación y el desarrollo del pulmón se examinó mediante inmunotinción (Figura S1). Como se esperaba, se detectó fuerte nuclear c-MYC y la expresión de C-RAF a bajos niveles endógenos en estos grupos (Figura S1). células pleomórficas proliferar a juzgar por la tinción de PCNA y tienen una alta tasa de apoptosis, que es presumiblemente responsables de su falta de expansión hiperplásica (Figura S1 y Figura S2), que también establece estas lesiones aparte de la hiperplasia adenomatosa atípica (AAH). Los marcadores de neumocitos de tipo II se mantienen en la focos positivos c-MYC incluyendo Gata6 que acciona TTF-1 de expresión [22]. En contraste Gata4 y sus mucina de genes diana no se expresan (Figura S1). De los efectores aguas abajo de la Gata6-TTF-1 cascada solamente pro SP-C pero no CCSP se expresa a niveles bajos en comparación con los neumocitos tipo II fuera de los grupos que demuestran la ausencia de células madre alveolares bronquio (BASCs) (Figura S1) [ ,,,0],23]. la expresión de c-myc en racimos pleomórficas se asocia con la inducción de la proliferación y la apoptosis (Figura S1 y Figura S2). De hecho utilizando un doxiciclina (DOX) inducible transgén c-MYC, se observó apoptosis masiva después de la inducción de un día y extensa pérdida de tejido pulmonar cuatro semanas después de la inducción (Figura S3A-S3C). La prolongación del período de inducción condujo a la formación de clusters pleomórficos y aislados los tumores de pulmón papilar (Figura S3D-S3E).
A continuación analizamos Acuaporina 5 expresión que se comparte entre el tipo I y neumocitos tipo II [24] y Nos pareció que para ser mantenido en racimos pleomórfico (Figura S1). Para obtener más conocimientos sobre las características de estas células progenitoras, se examinó una serie de marcadores de las vías de desarrollo. Estos incluyen HNF-3ß, Sox9 [20], y los factores que son notoriamente involucrados en células madre o progenitoras tales como Bmi-1 [25], ß-catenina y ID2 [20]. Todos estos genes se encontraron para ser expresado (Figura S1). Id2 se ha descrito para mediar en la señalización de Myc en conjunción con una proteína retinoblastoma [26]. Llegamos a la conclusión de que las células de la alta c-myc que expresan las agrupaciones tienen características de células progenitoras, pero difieren de BASCs.
Rescate y el crecimiento acelerado de c-MYC tipo II pneumocytes transformado por C-RAF
contraste con pulmones de SPC-c-MYC sola ratones transgénicos que sólo desarrollan lesiones premalignas, nódulos tumorales en los pulmones de compuesto o individuales ratones transgénicos finales SPC-c-Myc estaban expandiendo rápidamente y contenían con frecuencia tumores macroscópicos con células columnares que estaban ausentes en CE adenomas-RAF -C impulsadas por bXB (Figura 1C). Varias líneas de evidencia indican que surgen a partir de células columnares células cúbicas en ratones compuestos. En primer lugar, la incidencia tumoral en dos semanas y dos meses de edad es la misma para los ratones compuestos SPC-C-RAF BXB individual y SPC-C-RAF BXB /SPC-c-myc (Figura 2A). En segundo lugar, las células columnares surgen sobre todo dentro de los focos tumorales cuboidal (Figura S4A). Finalmente, las células columnares pueden ser inducidos rápidamente y con frecuencia in vivo por tratamiento DOX de los ratones transgénicos triples compuestos (SPC-C-RAF BXB /SPC-rtTA /tet-O-c-MYC) (Figura S4B y S4C). Para probar la reversibilidad de c-myc expresión del transgen DOX fue eliminado una semana después de la inducción por un período de cuatro semanas (Figura S4D). El análisis histológico del tumor de pulmón fotografiado mostró la persistencia de células columnares en el centro de un tumor restante que de otro modo muestra un fenotipo cuboidal (Figura S4D). Extensión del período de observación después de la eliminación DOX a 10 semanas eliminación de células columnares demostrado en los tumores de todos los ratones analizados (datos no presentados). Comparación de la carga tumoral entre los ratones y los ratones que fueron tomadas de DOX durante diez semanas después de un período de inducción de cuatro semana tomó no mostraron diferencias significativas inducidas de forma continua (datos no mostrados). Estos datos sugieren que un "choque de retirada oncogén" -efecto [27] es responsable de la desaparición de APEC a pesar de la reversibilidad de la cúbico MYC inducida a columnar interruptor fenotípica es una posibilidad alternativa.
(A) Tumor incidencia en SPC-C-RAF bXB (azules cuadrados blancos) y los ratones compuestos (triángulo abierto de color rojo). Cada símbolo representa un pulmón. Los valores se normalizaron para el tamaño de los pulmones para compensar las diferencias de edad. No hay diferencia significativa entre las medias. (B) Porcentaje de células positivas pro SP-C que son PCNA positivas. Los valores representan la SD de la media. Genotipos y categorías tumorales se indican como sigue: SPC-C-RAF BXB cúbico (azules cuadrados blancos), cúbico compuesto (cuadrados rojos abiertos) y columnar compuesto (rojo círculos abiertos). Cada símbolo representa un tumor. (C) dos semanas y dos meses de edad se inyectaron ratones diariamente con BrdU durante una semana y perseguidos por un día. Parafina incrustados secciones de pulmón de un solo transgénicos y compuestas ratones SPC-C-RAF BXB se tiñeron doble para BrdU (verde) y Ki67 (rojo) para identificar las células en el ciclo. DAPI se destacan los tumores de pulmón. Barra de escala: 100 micras. (D, E) Porcentaje de células BrdU y Ki67 positivos en los tumores de ambos genotipos en diferentes edades. 30 tumores de 3 ratones se analizaron por genotipo. Los valores representan la SD de la media. (F) El volumen del tumor se calculó mediante la medición de área de tumor asumiendo forma esférica de tumores. Los símbolos representan los tumores individuales. Cada columna representa un ratón. Genotipos y categorías tumorales son como se describen en B. Todos los tumores de cada categoría se compararon entre los genotipos. Los valores representan la SD de la media. Las diferencias estadísticas entre los grupos que se indican. ns: no significativo
Los tumores papilares crecen más rápidamente que los tumores cúbicas de ambos genotipos. Consistentemente la fracción de células que expresan positivo, pro SP-C PCNA fue mayor en los tumores papilares (Figura 2B). Datos similares se obtuvieron por BrDU y etiquetado Ki67 (Figura 2C-2E). Como se espera de los datos de proliferación, los volúmenes tumorales aumentaron más rápidamente en los tumores papilares de los ratones compuestos (Figura 2F). Para caracterizar mejor las células columnares que son el sello de adenocarcinoma avanzado, que se hayan escrito para los marcadores de linaje y de células progenitoras como en el caso de las lesiones pre-malignas en ratones transgénicos individuales SPC-c-myc. Al igual que en las agrupaciones pleomórficas, las células columnares en focos tumorales de los ratones temprana compuesto expresan marcadores de células progenitoras (Figura S5A). Una diferencia importante sin embargo era el alto nivel de expresión de c-RAF del transgén que media rescate de crípticos transformantes c-Myc de la apoptosis (Figura S2A y S2B) que conduce a la expansión de focos tumorales temprano. En contraste, los grupos pleomórficas en ratones compuestos fueron similares a aquellos en los pulmones de SPC-c-MYC sola ratones transgénicos en términos de tasa de apoptosis (datos no presentados). La expresión de marcadores de células progenitoras en focos tumorales de los ratones compuestos también difieren en la expresión ID2 en las etapas finales del tumor cuando las células positivas eran muy raros (Figura S5B). Estos datos son coherentes con los informes de una función de supresor de tumor de Id2 en el epitelio intestinal donde se conduce la diferenciación [28]. Una tercera diferencia se refiere a la homogeneidad de la expresión del transgen. Considerando c-MYC expresión era uniforme en todos los grupos pleomórficas, C-RAF y c-MYC expresión del transgén en focos tumorales columnar fue heterogénea y la disminución en las etapas finales (Figura S5B), sugiriendo la fluctuación de la expresión génica [29]. Finalmente, como en el caso de las agrupaciones pleomórficos y en adenomas SPC-C-RAF BXB [30], BASCs no fueron detectados en las primeras o últimas etapas en los tumores compuestos (Figura S5a y S5B).
c-MYC promueve la progresión tumoral concomitante con la angiogénesis en la ausencia de transición epitelial mesenquimal (EMT)
en aceleración ratones compuestos tumor era evidente histológicamente en todas las edades analizadas con tumores pulmonares macroscópicas no invasivos frecuentes que eran ausentes en SPC-C-RAF bXB ratones transgénicos individuales (paneles inferiores Figura 1C). tumores pulmonares macroscópicas generalmente eran del tipo papilar y clasificados como adenocarcinoma. En casos raros (2 de cada 50 casos para cada genotipo) encontramos tumores papilares de oclusión bronquiolos y ejemplos de desmoplasia en compuesto e individuales ratones transgénicos SPC-c-MYC, las características adicionales que son una reminiscencia de la patología NSCLC humano (Figura 1D-1F).
c-MYC se ha informado de inducir la angiogénesis [31]. Se detectaron significativamente mayores niveles de sangre y vasos linfáticos en los tumores pulmonares de compuesto y SPC-c-myc sola ratones transgénicos (Figuras S6A-C). El mecanismo de inducción de cambio angiogénico por c-myc no implica interferencia con la expresión de E-cadherina en contraste con nuestros hallazgos anteriores destacando ß-catenina [11], sin ß-catenina nuclear se detectó (Figura S5C). células otra parte de mástil que se requieren para la angiogénesis Myc inducida por tumores insulares pancreáticas ([17] están ausentes de los adenocarcinomas de pulmón en ratones de ambos genotipos (datos no mostrados). Se detectó lugar la expresión del VEGF en las células tumorales de los tumores de pulmón de SPC-c individuales transgénicos o compuestos ratones myc (Figura S7a). Myc también es capaz de inducir VEGF en células humanas en cultivo a-549 y el ratón MLE-15 NSCLC (Figura S7B). Los datos combinados sugieren que Myc induce la angiogénesis por la regulación de VEGF en las células NSCLC.
una observación sorprendente fue hecho cuando exploramos las funciones neuroendocrinas potenciales de nuestra NSCLC mediante tinción con PGP 9.5. PGP 9.5 es un marcador neuroendocrino inmaduro y un marcador tumoral candidato para NSCLC humano donde es expresado en células tumorales de & gt;.. 70% de fase II y los tumores IIIA [32] en nuestro modelo NSCLC, la mayor parte de las células tumorales son negativos para esta enzima deubiquitinating en todas las etapas independientes de los genotipos (datos no mostrados) en cambio, la tinción parece marcar los vasos en los tumores primarios de SPC-c-myc sola ratones transgénicos y compuestos (comparar Figura S6D). De hecho co-tinción de secciones tumorales con PGP 9.5 y PECAM-1 mostró colocalización de estos marcadores en los mismos vasos (Figura S6E). Con el fin de examinar si PGP 9.5 es un marcador de la angiogénesis patológica, también manchadas secciones de pulmón de tipo salvaje donde no se encontró tinción exclusivamente en buques de gran tamaño, pero no en los capilares (Figura S6E) de acuerdo con una publicación reciente que muestra la expresión de PGP 9.5 en humanos arterias carótidas [33]. Nuestros resultados son el primer informe en relación con la ocurrencia de este tipo de células endoteliales de la vasculatura del tumor
.
El interruptor angiogénico de suponer que no fue acompañada por una transición epitelio mesenquimal típica (EMT) en los bordes tumorales, ya que no se detectaron células doblemente positivas para la i SP-C y vimentina o pro SP-C y N-cadherina (Figura S8B). Por otra parte uniones E-cadherina de células columnares en el tumor se mantuvo intacta (Figura S8A). Consistentemente no observamos frentes invasoras en los tumores papilares (Figura 1C). No se encontraron grupos en lugar aislados de células tumorales en el entorno de los tumores primarios que recuerdan a la migración colectiva [34] (Figura 1C).
tumores latencia en ratones SPC-c-myc son positivos para
K -ras
o
LKB1
mutaciones
a medida que la cinética de desarrollo de tumores en ratones se retrasó SPC-c-MYC en comparación con SPC-C-RAF bXB o ratones compuestos y el número de los tumores de pulmón por finales de los años fue menor (Figura 3A) se realizaron búsquedas de mutaciones secundarias. Con este objetivo, un panel de genes (Texto S1) que se alteran con frecuencia en NSCLC humano fue examinado en una colección aleatoria de los tumores de diez ratones que condujeron a la identificación de mutaciones puntuales frecuentes en
K-Ras y
LKB1
genes (Figura 3B). La mayoría de los
K-Ras
mutaciones estaban en el exón 1 y fueron heterocigotos. Hubo un caso de una mutación del exón 2 (Figura 5B) y en tres casos no se encontraron mutaciones en
K-Ras
o cualesquiera otros genes en el panel excepto
LKB1 gratis (Figura 3B) . En las mutaciones de hecho en el exón 6 de este supresor tumoral que está mutado en el 34% de NSCLC humano [35] se encontraron en cada uno de tres
K-Ras
tumores negativos de pulmón SPC-c-myc (Figura 3B). Sólo en un caso fueron
LKB1 CD - y
sobre K-Ras - mutaciones encontradas para coexistir. En este ejemplo se observó una mutación diferente de
LKB1
que estaba presente en ambos alelos (Figura 3B). En todos los demás casos,
K-Ras
mutaciones o presencia de oncogénico C-RAF eran mutuamente excluyentes con
LKB1
mutación (Figura 3B). Este hallazgo puede sugerir que el K-Ras /C-RAF señalización en las células tipo II normalmente puede conducir a la inactivación de este gen supresor tumoral. Se encontró una relación similar entre los
K-Ras
mutaciones y presencia de oncogénico C-RAF, consistentes con el patrón mutuamente excluyente de
RAF
y
RAS
mutaciones en tumores humanos [36] [37] (Figura 3B).
(a) la incidencia de tumores de pulmón en ratones por SPC-c-myc como una función de la edad. El número de animales son 17 por 2 meses, 10 meses para 6-10,5 y 15 para los 13-17 meses. Cada símbolo representa un pulmón individual. Tenga en cuenta que la ordenada es focos /cm
2 mm en comparación con
2 en la Figura 2. (B) La aparición de
K-Ras
y
LKB1
mutaciones en pulmón primario tumores. 10 elegidos al azar ratones positivos tumorales fueron examinados por un panel de genes candidatos (
EGFR
,
K-Ras
,
B-RAF
,
C-RAF
,
p53
,
PI3K
,
PTEN
,
Akt
y
LKB1
). Se muestran aquí los datos para
K-Ras
y
LKB1
, los únicos genes del panel en el que se encontraron mutaciones. Cigocidad es como se indica. los ratones individuales se muestran por números de identificación para facilitar la comparación entre las tablas.
Myc es suficiente para inducir metástasis
Como hemos visto anteriormente la progresión de micrometástasis en ratones SPC-C-RAF BXB en el que la angiogénesis provocados por la ablación de E-cadherina, se examinaron los ratones para la metástasis a diferentes edades. Sorprendentemente múltiples hígado- macroscópica (Figura 4A y 4B) y no se observaron nódulos metástasis nodal (Figura 4C) tan pronto como diez meses de edad en el compuesto (SPC-C-RAF BXB /SPC-c-myc) y SPC-c- animales individuales trasngenic myc. ratones compuesto desarrollado metástasis significativamente antes, en mayor incidencia que SPC-c-MYC sola ratones transgénicos (Figura 5A). Mientras que en los ganglios linfáticos y metástasis macro micro fueron vistos, sólo metástasis macro se encontraron en el hígado. ganglios linfáticos y metástasis hepática eran eventos independientes al igual que la metástasis macro y micro que sugiere que la metástasis células iniciadoras (PRM) pueden ser diferentes para cada categoría (Figura 5A). Además de ratones transgénicos individuales SPC-c-myc, DOX expresión inducible de c-MYC que rápidamente da lugar a tumores de pulmón papilar en el fondo C-RAF BXB (Figura S4) se examinó para la generación de metástasis. Estos ratones desarrollaron tumores pulmonares (Figura S9A) y la metástasis de hígado (Figura 9D) y S9C formados por células columnares. De acuerdo con la frecuencia de metástasis en ratones constitutivos, en una cohorte de 10 ratones compuestos inducibles que fueron inducidos 11-12 meses, un ratón desarrolló metastastasis hígado macroscópica y un segundo animal era positivo para metástasis micro en un ganglio linfático regional (Figura S9B) . Una cohorte de ratones de control emparejados por edad (no inducida) que eran 14-17 meses de edad no mostraron metástasis (datos no mostrados). Al igual que en los ratones constitutivos, las secciones de la metástasis del hígado de los ratones compuestos inducible (SPC-C-RAF BXB /SPC-rtTA /tet-O-c-MYC) fueron positivos para la i SP-C y pan-citoqueratina (Figura S9E y S9F). En contraste con los ratones constitutiva, la metástasis de hígado en ratones compuestos inducibles provocó una respuesta del estroma pronunciada que separa el tejido tumoral a partir de hígado normal (Figura S9D). Cabe destacar que en esta zona fronteriza estroma rico aislados grupos de células tumorales que fueron positivos para pan-citoqueratina o pro SP-C estaban presentes (Figura S9E y S9F) consistente con la invasión por la migración colectiva [34]. Después de examinar el estado mutacional de K-Ras, un 1mutation exón se encontró en tumores primarios de pulmón y metástasis hepática correspondiente (datos no mostrados).
(A) Inspección de metástasis hepáticas (izquierda) de una SPC- c-MYC solo ratón transgénico. Un hígado normal (derecha) de un solo ratón transgénico no metastásica SPC-C-RAF BXB. (B) H & amp; E tinción de secciones de hígado incluidas en parafina de SPC-c-myc y los ratones compuestos. se muestran secciones representativas de papilar y metástasis quísticas. áreas enmarcadas se muestran a mayor aumento. Edades y genotipos como se indica. Barra de escala: 100 micras. (C) La tinción de hígado y metástasis de ganglios linfáticos de ratones compuestos para marcadores como se indica. Metástasis de ratones SPC-c-myc fueron indistinguibles en comparación con los ratones compuestos para mismos marcadores. áreas círculo en los ganglios linfáticos marcan metástasis (M). Barra de escala: 100 micras
(A) Resumen del patrón de la metástasis de un solo transgénicos y compuestas ratones SPC-c-myc.. Los animales que se enumeran los números de identificación y agrupados de acuerdo con el genotipo. La edad media de aparición de metástasis entre los grupos es significativa (p = 0,03). (B) Ausencia de
K-Ras
mutación en macrometástasis de RAF /MYC y tumores /MYC pulmonares RAS. N.m: no hay metástasis. N.D .: no se ha hecho. Δ: Supresión. -:. Negativo
Si la expresión aguda de c-MYC es suficiente para la conversión metastásico después introducción en las células NSCLC no metastásico debería generar clones metastásicos. Para probar esta posibilidad se emplearon células A-549 humanos. Un alto c-MYC que expresan un 549-clon de células (A-549 J5-1) (Figura 6A) se inyectó por vía subcutánea en inmunodeficientes Rag1
- /- ratones. La incidencia (Figura 6B) y la tasa de crecimiento del tumor local (Figura 6C) se incrementó por la expresión de MYC en un grado tal que los animales tuvieron que ser sacrificados después de seis semanas. A pesar de este lapso de tiempo limitado del experimento, se observó metástasis en pulmón e hígado a baja frecuencia (Figura 6 D y 6E). El análisis de secciones de pulmón de células A-549 J5-1 ratones inoculados mostró expresión de MYC pollo en la metástasis de pulmón que confirma el origen de las células (Figura S10). Los datos combinados establecen c-myc como un fuerte inductor de la metástasis gen para el NSCLC.
(A) La tinción de inmunofluorescencia de células A-549 infectadas con el pollo v-myc expresión de virus J5 muestra MYC (rojo) expresión. Dapi marca núcleos. Barra de escala: 50 micras. (B) la incidencia de tumores de control y células que expresan MYC A-549 seis semanas después de la inyección subcutánea. El número de animales (n) son los indicados. (C) La vigilancia del crecimiento del tumor durante seis semanas de periodo. Los tumores se midieron semanalmente. las células que expresan MYC dieron lugar a tumores estadísticamente más grandes en Rag1
- /- ratones. Los valores representan la SD de la media. *: P & lt; 0,05. n = 17 ratones para cada grupo. (D) Análisis de las metástasis. Parafina secciones incrustadas de pulmón, ganglios linfáticos y en los tejidos del hígado de los ratones transplantados fueron seleccionados para la metástasis mediante el uso de citoqueratina-7 anticuerpo (CK-7). Para demostrar la especificidad de la expresión de CK-7 en células A-549 tumores primarios se tiñeron en ausencia (control negativo) o en presencia (control positivo) de anticuerpo CK 7. Para cada órgano al menos 3 secciones fueron teñidas y seleccionados cuidadosamente por lo menos por dos personas. n = 17 ratones para cada grupo. Barra de escala: 50 micras. (E) La incidencia de la metástasis. LN:. Ganglios linfáticos
El uso de mutaciones en los tumores primarios de SPC-c-myc sola ratones transgénicos para el rastreo del linaje de metástasis
El descubrimiento de frecuentes
K-Ras Opiniones y
LKB1
mutaciones en los tumores de pulmón principalmente de SPC-c-myc sola ratones transgénicos sugirió que podríamos ser capaces de utilizar los datos de mutación para el rastreo de linaje. Por lo tanto, examinaron el ADN de las metástasis del hígado y de los ganglios linfáticos de las mutaciones presentes en los tumores primarios. Sorprendentemente, en caso de
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mutaciones, cuatro de los cinco casos de metástasis tumorales derivadas c-MYC que podrían ser analizados de esta manera fueron negativos para la mutación como fue el caso de un ratón compuesto que tenía un
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exón 1 mutación en el tumor primario y la metástasis a los ganglios linfáticos (Figura 5B). Sin embargo, uno de los cinco casos de
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positivo c-myc metástasis derivada del tumor fue positivo para el mutante
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. La mutación era idéntica a la del tumor de pulmón. Este ratón tenía múltiples metástasis de órganos que incluían además de hígado, riñón, páncreas y cerebro. Por otra parte, la metástasis en diferentes sitios compartida expresión de marcadores de pulmón. muestra la Figura S11 que dispersaron células positivas pro SP-C están presentes en metástasis a distancia en el hígado, páncreas, cerebro y riñón. Además en el riñón, se detectaron Clara proteína secretora celular (CCSP) células tumorales positivas (Figura S11). En el caso de un
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tumor pulmonar -mutant que dio lugar a la metástasis hepática, la metástasis de un resultado negativo para la mutación. El hecho de que las mutaciones presentes en los tumores primarios de pulmón son en su mayoría ausente en sus metástasis hepáticas sugiere fuertemente que la metástasis es un evento temprano.
Histopatología de metástasis de solo transgénicos y compuestas ratones SPC-c-myc
en las metástasis examen histopatológico de los dos genotipos fueron indistinguibles salvo por su abundancia (Figura 4A y Figura 5A). En ambos casos nos encontramos con dos tipos de metástasis en hígado, ganglios linfáticos, papilar y mixta quística papilar (Figura 4B). Comúnmente ambas formas coexisten en un mismo órgano diana (Figura S12). Si estas dos formas pueden interconvierten o si los quistes son formas precursoras tempranas de la metástasis mixta quística papilar es actualmente desconocido. Barra de escala: 50 micras. Barra de escala: 50 micras.