Extracto
Para entender los efectos de la interacción entre Mycoplasma y las células sobre la función celular del huésped, es importante para dilucidar las influencias de la infección de las células con Mycoplasma sobre enzimas nucleares tales como el tipo de ADN de la topoisomerasa I ( Topo I). Topo I humana participa en los procesos de transacción de ADN y es el blanco de fármacos contra el cáncer, las camptotecinas (CPT). Aquí se investigó el mecanismo por el cual la infección de las células tumorales humanas con
Mycoplasma fermentans
afecta a la actividad y expresión de Topo celular I, y la eficacia anti-cáncer de CPT. Las células cancerosas humanas fueron infectadas o tratados con
M en vivo o sonicado. fermentans
y se determinó la actividad y expresión de Topo.
M. fermentans
redujeron significativamente (en un 80%) la actividad Topo I en las células tumorales infectadas /tratadas sin afectar el nivel de proteína Topo I. Se demuestra que esta reducción en la actividad de la enzima resultó de ADP-ribosilación de la proteína Topo I por la polimerasa de poli-ADP-ribosa (PARP-1). Además, pERK fue activada como resultado de la inducción de la vía de transducción de señal MAPK por
M. fermentans
. Desde que se muestra PARP-1 para ser activado por pERK, concluimos que
M. fermentans
modificaron la actividad celular Topo I por la activación de PARP-I a través de la inducción de la vía de transducción de señal MAPK. Por otra parte, la infección de células tumorales con
M. fermentans
disminuido el efecto inhibidor de la CPT. Los resultados de este estudio sugieren que la modificación de la actividad de la Topo I por
M. fermentans
puede alterar la expresión génica celular y la respuesta de las células tumorales a los inhibidores de la topo I, que influyen en la capacidad de lucha contra el cáncer de antagonistas de Topo I
Visto:. Afriat R, S Horowitz, Priel E (2013)
Mycoplasma fermentans
inhibe la actividad de la ADN topoisomerasa I celular mediante la activación de PARP1 y altera la eficacia de sus propiedades anti-cáncer inhibidor. PLoS ONE 8 (8): e72377. doi: 10.1371 /journal.pone.0072377
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: April 2, 2013; Aceptado: 9 Julio 2013; Publicado: 27 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Afriat et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación proporcionada por el Fondo de Investigación de Semillas, la Universidad de Ben Gurion. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
micoplasmas, que pertenecen a la clase Mollicutes, son los más pequeños eubacterias autorreplicantes, desprovistas de una pared celular y rodeadas solamente por una membrana de plasma. Su pequeño tamaño del genoma (que van 580-1380 kpb) da como resultado capacidades metabólicas limitados y parasitismo [1], [2]. Los micoplasmas se pueden encontrar como parásitos en una amplia gama de huéspedes incluyendo humanos, animales, insectos, plantas, y las células cultivadas en cultivo de tejidos.
En los seres humanos, algunas especies de Mycoplasma se encuentran como habitantes comensales, mientras que otros se mostraron que se asocia con las enfermedades infecciosas y patologías después de la infección [3], [4].
la mayoría de las especies de Mycoplasma conocidos se encuentran como parásitos de la superficie de la membrana, y recientemente, algunos se demostró que entrar en las células y se convierten residentes intracelulares [5].
Mycoplasma pueden causar infecciones crónicas debidas a mecanismos sofisticados para la evasión de la vigilancia inmunológica (es decir, el mimetismo molecular, un tipo único de variación antigénica), hasta la regulación o hacia abajo-regulación de la secreción de citoquinas, moléculas de adhesión de expresión, la expresión de factores de transcripción, MAP quinasas actividad, las vías de apoptosis, y mucho más [2], [3].
Recientemente, muchos informes han apoyado fuertemente la capacidad de Mycoplasma para provocar o promover la transformación oncogénica [6 ] -. [9], y la búsqueda de la relación entre el cáncer de Micoplasma y actualmente se está estudiando [10]
las lipoproteínas (LPMf) de
Mycoplasma fermentans
, un patógeno humano, era investigado a fondo durante la última década. LPMf se demostró para alterar las funciones de las células del sistema inmune mediante la inducción de la expresión de oncogenes [1], que afecta a varios factores que participan en las proteínas de transducción de señales [11] - [13], la transcripción [14], y el proceso de apoptosis [11], [15], [16].
M. fermentans
ha demostrado inhibir el proceso de apoptosis inducida por el factor de necrosis tumoral α (TNF) [17], [18]. Todos estos llevado a la suposición de que la infección de células tumorales por Mycoplasma puede afectar a la actividad y la expresión de las enzimas nucleares esenciales, tales como las topoisomerasas, que son los objetivos de varios fármacos contra el cáncer y por lo tanto interferir con la eficacia anti-cáncer de estos fármacos. las topoisomerasas de ADN son una familia de enzimas nucleares esenciales que son responsables de controlar el estado topológico de las moléculas de ADN. Participan en la mayoría de las transacciones de ADN como la replicación, transcripción, recombinación, y remodelación de la cromatina [19] - [21]. topoisomerasas de ADN se clasifican como de tipo I (escinde una cadena de ADN) o de tipo II (escinde dos cadenas de ADN). Ambos tipos de enzimas se clasifican además en subgrupos de acuerdo con las características estructurales y funcionales. Los miembros de cada familia de enzimas son distintos en secuencia, estructura y funciones [22].
La actividad catalítica de las topoisomerasas de ADN implica la formación de puentes covalentes transitorios de enzima ADN complejos. Un grupo tirosil en el sitio activo de la enzima ataca un enlace fosfodiéster en el esqueleto de ADN y permanece unido de forma covalente a un lado de la rotura, dejando un hidroxilo libre opuesto (OH) extremo que permite el paso de la religación, después de la topología del ADN se resuelve, por un segundo ataque nucleófilo del enlace fosfotirosina enzima ADN-covalente, la liberación de la enzima para el siguiente ciclo catalítico. La implicación de estas enzimas en procesos celulares esenciales etiquetada topoisomerasas como objetivos importantes para los tratamientos contra el cáncer y para el desarrollo de fármacos potentes y más eficaces contra el cáncer, [22], [23]. La citotoxicidad de los inhibidores de topoisomerasas tales como camptotecina (CPT) y sus derivados TPT y CPT-11 (que están aprobados para uso clínico), se deriva de su capacidad para estabilizar el complejo escindible de Topo-DNA, que introduce pausas individuales y de doble cadena en el ADN [21], [24], [25]. la actividad de topoisomerasa se ve influida por varias modificaciones después de la traducción, entre ellos la fosforilación, poli-ADP-ribosilación, y ubiquitinación. Un trabajo reciente realizado en nuestro laboratorio demostró que la junta de GlcNAcylation Topo IB, que afecta a su actividad [26].
La fosforilación de la DNA topoisomerasa I por la caseína quinasa II (CK II) y la proteína quinasa C (PKC) hasta de regular la actividad de relajación de ADN de la enzima, mientras que la defosforilación por la fosfatasa alcalina inhibe esta actividad. Además, se encontró ribosilación poli-ADP ribosa polimerasa por poli-ADP (PARP-1) de la proteína enzima para regular a la baja su actividad [20], [27]. Se sabe PARP-1 para ser activado por roturas en el ADN; Sin embargo, recientemente, se informó de que PARP-1 puede ser activado por ERK2 fosforilados en ausencia de condiciones de estrés o daño en el DNA [28]. En estudios recientes Mycoplasma se demostró que era capaz de activar varios MAPKs, tales como SAPK /JNK, p38, NF-kB, AP-1 y ERK media en respuesta a las lipoproteínas de membrana de Mycoplasma derivados de [11], [29] - [31]. Por lo tanto, es importante investigar la posibilidad de que el celular Topo I y la eficacia de los TTC como agentes anticancerígenos podrían verse afectados por la infección por Mycoplasma.
Materiales y Métodos
Las células
líneas celulares de cáncer de mama humano -MCF7 (American Type Culture Collection, HTB-22) y glioblastoma humano U251 células- (HTB-17) amablemente recibidos de Porgador A, Universidad Ben-Gurion. Las células se cultivaron como monocapas en DMEM y medio RPMI 1640 (Biological Industries, Beith Haemek, Israel), respectivamente, suplementado con 10% de suero fetal bovino, 50 UI de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina y L-glutamina (0,29 μγ /ml ). Las líneas celulares se cultivaron en una incubadora humidificada suplementada con 5% de CO
2 a 37 ° C.
enzimas, anticuerpos y compuestos
Las soluciones madre de camptotecina (Sigma, Israel) a 20 mM (disuelto en 100% DMSO) se almacenaron en alícuotas a -70 ° C y se diluyen en DMSO antes de ser añadido a la mezcla de reacción o al medio de cultivo celular. Superenrollado de ADN plásmido pUC19 fue adquirido de MBI Fermentas (Hanover, MD, EE.UU.). PD98059 y 3-aminobenzamida (3AB) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Rehovot, Israel)
El antisuero primario fueron los siguientes:. Ratón monoclonal anti-β-actina de anticuerpos (MP Biomedicals, LLC); policlonal de cabra IgG (C-15) contra la guía I, IgG monoclonal de ratón antiphospho-ERK (E-4), y la IgG policlonal de conejo anti-ERK (C-16) (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, EE.UU.); Los anticuerpos anti-ribosa poli-ADP monoclonales de ratón, (Serotec, Oxford, Reino Unido); y de cabra anti-ratón y segundos anticuerpos IgG anti-conejo (Biolabs Inc., Ipswich, MA, EE.UU.). Para los ensayos de inmunoprecipitación, se utilizó anticuerpo anti-Topo I derivado del suero del paciente esclerodermia (TopoGene, Florida, EE.UU.).
quimioluminiscencia (ECL) los reactivos se adquirieron en Biological Industries (Beit Haemek, Israel).
Mycoplasma Crecimiento
p>
M
K7 se cultivó en caldo SP4 a 37 ° C y 5% de CO
2 hasta la fase de registro. Uno alícuotas ml que contenían 2 x 10
8 unidades formadoras de colonias (CFU) se mantuvieron congeladas a -70 ° C hasta su uso. Para cada experimento, una parte alícuota se descongeló, cultivado en caldo SP4 a una dilución de 1/10 durante 24 h (37 ° C, 5% de CO
2), seguido de una dilución adicional de 1/50 hasta una fase logarítmica era observado (después de aprox. 24 horas). La cantidad exacta de
M. fermentans
se determinó por recuento de UFC, como se describe anteriormente [32], [33].
Proteína micoplasma Extracto Preparación
M. fermentans
fue cultivado como anteriormente; el cultivo de 500 ml se sedimentaron (13.000 xg, 30 min a 4 ° C) y se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). El sedimento se resuspendió después en PBS. se determinó CFU /ml, y el precipitado resuspendido se almacenó a -70 ° C para experimentos adicionales. gránulos congelados de
M. fermentans
se descongelaron y se sonicaron a 4 ° C durante 4 × 30 segundos a una potencia del 80% (ciclo de trabajo 50%; Heat Systems Ultrasonics, Inc.) en la presencia del inhibidor de la proteasa fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF; 0,001 M). Estas condiciones de sonicación dio lugar a una preparación de micoplasma no vivo (sin crecimiento se observó en los procedimientos de cultivo repetidas). La concentración de proteína de la
M sonicado. fermentans
se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad (Richmond, CA); 1 × 10
8 UFC correspondieron a 10 g de proteína por micoplasma.
Tratamiento de líneas de células malignas con Live
M.
fermentans
o
M. fermentans
Total Protein
células
MCF7 y U251, prelavado una vez con PBS (1.200 rpm, 5 min a 4 ° C) y se resuspendieron en un nuevo medio de cultivo a una concentración de 2 × 10
5 células /ml, se cultivaron en placas de 96 pocillos estériles (Corning Inc., Corning, NY) a una concentración final de 4 × 10
4/200 l /pocillo. Publicado
M. fermentans
en la fase de registro, previamente lavada una vez en PBS (13000 × g, 30 min a 4 ° C), y se resuspendieron en medio RPMI 1640 que contiene 10% de FCS inactivado, 1% de penicilina y 1% de glutamina, se añadieron a los cultivos celulares a MOI 1000:1 (4 × 10
7 UFC /pocillo). Los co-cultivos se incubaron durante cinco horas a 37 ° C, 5% de CO
2. Para los experimentos con
M. fermentans
proteína total, una concentración de 20 mg /ml (correspondiente a 2 × 10
8 CFU) se añadió a las células tumorales examinadas (2 × 10
5 células /ml) durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO
2.
amplificación de ADN de
M. fermentans fotos: por PCR con transcripción inversa (RT-PCR) utilizando una secuencia de nucleótidos dentro de la secuencia de inserción-Como elemento
El ARN total se extrajo de las células MCF7 y U251 infectadas utilizando el reactivo TRI (T9424; Sigma Aldrich, Rehovot, Israel), y luego a transcripción inversa utilizando 1 g de ARN total a partir de las células examinadas con oligo-dT, utilizando RevertAid Kit (K1621; Fermentas, Vilnius, Lituania). Varios ADNc aislado de
M. fermentans
células infectadas para diferentes intervalos (1,5, 3, 6, 12 y 24 horas) fueron amplificados utilizando RedTaq Ready Mix (r2523; Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel). Secuencias de la pareja de cebadores de oligonucleótido sintético (RWO04 y RWO05) utilizados para la amplificación de ADN específica de
M. fermentans Opiniones y sus posiciones en la secuencia de inserción-Como elemento (IS-como elemento) fueron descritos anteriormente [34]. Las secuencias de los cebadores y tamaños de los productos de la PCR fueron las siguientes: Primer RW004 (24 nt): 5'GGA CTA TTG TCT TTT AAA CAA CCC y RW005 Primer (24 nt): 5'GGT TAT TCG ATT TCT AAA TCG CCT. El tamaño de la banda de ADN de diagnóstico es 206 pb. El perfil de ciclo térmico de la amplificación compuesta de 40 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos (240 segundos en el primer ciclo), 62 ° C durante 60 segundos, y 72 ° C durante 60 segundos (aumento de 10 minutos para el ciclo final). Los productos de PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio.
proteína nuclear Extractos Preparación
se prepararon como Nuclear extractos para los ensayos de la topoisomerasa y análisis de transferencia Western de las células MCF7 y U251 descritos anteriormente [27], [35] - [40] y una mezcla de inhibidores de la proteasa (concentraciones finales: 2 mg /ml de aprotinina, 2 mg /ml de leupeptina, 1 g /ml de pepstatina a, 2 g /ml de antipaína, 100 g /ml PMSF) se añadió a los tampones de extracción. La concentración total de proteína se determinó usando el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Lab, CA, EE.UU.).
Determinación del Nivel de Topo I de proteínas por Western blot
Las cantidades iguales de proteínas nucleares derivados de Mycoplasma tratadas o las células MCF7 y U251 no tratadas, se analizaron mediante análisis de transferencia Western utilizando anticuerpo anti-Topo I (Santa Cruz Biotechnology Inc.) o anti-β-actina de anticuerpos (MP Biomedicals, LLC) tal como se describe anteriormente [36], [39], [41]. Los inmunocomplejos se detectaron mediante quimioluminiscencia potenciada (ECL).
Topo I Ensayo
Topo I ensayo se realizó como se describe anteriormente [26], [37]. Concentraciones crecientes de proteínas nucleares se añadieron a una mezcla de reacción Topo I que contiene, en un volumen final de 25 l: 20 mM Tris-HCl (pH 8,1), ditiotreitol 1 mM, KCl 20 mM, MγCl 10
2, 1 ácido mM etilendiaminotetraacético (EDTA), 30 mg /ml de albúmina de suero bovino y 250 ng de pUC19 superenrollado plásmido de ADN (MBI; Fermentas, Hanover, MD). Después de incubación a 37 ° C durante 30 min, la reacción se terminó por adición de 5 l de tampón de parada (concentración final: 1% de dodecil sulfato de sodio, 15% de glicerol, 0,5% de azul de bromofenol, y EDTA 50 mM, pH 8). Los productos de reacción se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1% usando /borato /EDTA buffer Tris (89 mM Tris-HCl, 89 mM de ácido bórico, y EDTA 62 mM) a 1 V /cm, teñido de bromuro de etidio (1 mg /ml) y se fotografiaron usando una lámpara UV de onda corta (ChemiImager ™ 5500 equipos, Alpha Inotech Corporation, San Leandro, CA). El análisis densitométrico de los resultados se realizaron con el software EZ-Quant-Gel análisis (EZ-Quant, Rehovot, Israel), y el porcentaje de actividad de la Topo I se calculó usando la siguiente ecuación: (1 - (muestra /control)) × 100 [37].
Ensayo de inmunoprecipitación
Mouse monoclonal anti-ribosa poli-ADP (PAR) de anticuerpos (MCA 1480) se adquirió de Serotec (Oxford, Reino Unido). Igual cantidad de proteínas nucleares (200 mg), que eran pre-hirvieron durante 5 min, se sometieron a inmunoprecipitación con Topo anti-humana I anticuerpo (SC) en un volumen final de 100 l de tampón nuclear (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 10 mM, MgCl 1,5 mM
2, y inhibidores de la proteasa: 2 mg /ml de aprotinina, 2 mg /ml de leupeptina, 1 mg /ml de pepstatina A, 2 mg /ml de antipaína, 100 g /ml PMSF) . La mezcla se hizo girar a 4 ° C durante la noche. Se añadió Proteína A-Sepharose (0,1 g /ml) en tampón TE (10 mM Tris-HCl, pH 8, EDTA 1 mM) para un adicional de 1 h. Las muestras se centrifugaron a 10.000 xg durante 2 min y se lavaron las perlas tres veces con tampón TE. El sedimento se resuspendió en 25 l de tampón de muestra (concentración final: 7,5% de glicerol, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% β-mercaptoetanol, y 0,025% de azul de bromofenol), se hirvieron durante 5 min, y centrifugó. Las muestras se cargaron en un 7,5% de SDS-PAGE y Western blot se realizó utilizando anticuerpos IgG policlonal de cabra (C-15) anti-Topo I o anti-ribosa poli-ADP (PAR).
pelado de los anticuerpos de la nitrocelulosa de membrana
la membrana se sumergió en un tampón de extracción (100 mM 2-β-mercaptoetanol, 2% de SDS, y 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,7) seguido de incubación a 50 ° C durante 30 min con agitación ocasional. La membrana se lavó dos veces con TPBS (Na 31,25 mM
2HPO4, Na 12,5 mM
2HPO
4, NaCl 13,7 mM, 0,1% de Tween) durante 10 min a temperatura ambiente.
Cell Ensayo de citotoxicidad
Las células (5000 /pocillo, por triplicado) fueron infectados con
M. fermentans
a 2 x 10
1-2 × 10
3 MOI durante 6 horas seguido de tratamiento con CPT 30 M o 0,01% de DMSO para un adicional de 12, 24 ó 36 horas. La supervivencia celular se analizó utilizando el ensayo Neutral Red [42].
Análisis estadístico
Estudiantes
t-test
se utilizó para determinar la significación entre las muestras experimentales y controles.
P
valores & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos (*);
Los valores P Restaurant & lt; 0,01 (**) y & lt; 0,005 (***) fueron considerados altamente significativa
Resultados
1.. Publicado
M. fermentans
inhibe la actividad de relajación del ADN de Topo I
El efecto de vivo
M. fermentans
sobre la actividad de la topoisomerasa celular fui examinado en dos tipos de líneas celulares de cáncer de mama humano (MCF7) y glioblastoma (U251). Las células fueron infectadas con vivo
M. fermentans
a una MOI de 10
3CFU /célula, durante varios intervalos (1.5, 3, 6, 12, y 24 horas). Los extractos nucleares se prepararon a partir de células infectadas y no infectadas y se midió la actividad de la Topo I. cantidades equivalentes de proteínas de extracto nuclear se añadieron a una mezcla de ensayo de relajación I ADN Topo que contiene el plásmido de ADN superenrollado como el sustrato para la enzima; los productos de reacción se analizaron por electroforesis en gel de agarosa. actividad Topo I se mide por la conversión de plásmido superenrollado a sus formas parcial o totalmente relajado [19]. Ambos tipos de células infectadas por
M. fermentans
demostró una disminución significativa, hasta 80%, en la actividad de relajación de ADN de la enzima, en comparación con células no infectadas. Se observó una disminución gradual de la actividad a partir Topo I 1,5 horas después de la infección con
M. fermentans
, y se detectó el pico de la reducción en la actividad de la enzima (80%) a las 6 hrs después de la infección. reducción significativa en la actividad de relajación del ADN de Topo I era también detectó 12 y 24 horas después de la infección (30-50% de MCF7, 25-40% de U-251, respectivamente) (Figura 1A-D). Sin embargo, el grado de la reducción en la actividad de la Topo I disminuyó con el tiempo, lo que sugiere que la eficacia de la señal mediada por Mycoplasma se debilita, como se demostró anteriormente para las vías de Mycoplasma mediada transducción de señales [31], [43]. Para confirmar que las células se infectan de hecho y el efecto observado es debido a la presencia de
M. fermentans
, que analizaron la presencia de ADN de Mycoplasma en las células infectadas por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) utilizando
M
.
fermentans-
cebadores específicos. Los resultados confirmaron que las líneas de células tumorales examinadas fueron de hecho infectados con
M. fermentans
(Figura 2A).
MCF7 (A, B) y U251 (C, D), las células cancerosas se infectaron con vivo
M. fermentans gratis (
M.f
) para diversos intervalos de MOI de 10
3CFU /célula. Se añadió proteína nuclear total (12,5 ng) a una mezcla de reacción específica para los productos de reacción Topo I. se analizaron por electroforesis en gel de agarosa. (A, C) una imagen representativa (n = 4-5) de la actividad de DNA-relajación Topo I. (B, D) análisis de cuantificación de la actividad de la Topo I. Símbolos: R y S son la forma más relajado y superenrollado del ADN pUC19, respectivamente; Topográficos ninguna proteína añadida a la mezcla de reacción.
t-test
:. *
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01, ***
p Hotel & lt; 0,005
las muestras de la MCF7 y U251 células infectadas (descritos en la Figura 1) se analizaron para la detección de ADN micoplasma por PCR (a, B). Los extractos nucleares derivados de MCF7 y U-251 células infectadas se analizaron para determinar el nivel de proteína Topo I usando análisis de transferencia de Western con anticuerpos anti-beta-actina anti-Topo I o, y se cuantificaron por análisis densitométrico utilizando el software EZquant (C-F).
Para examinar si la disminución de la actividad Topo I en las células tumorales infectadas es una consecuencia de una reducción en el nivel de proteína Topo I, extractos nucleares derivados de tanto las células infectadas y no infectadas se analizaron por transferencia Western con el Los anticuerpos anti-I-Topo apropiadas. Como se muestra en la Figura 2C-F, el nivel de proteína Topo I en las células infectadas fue similar a la encontrada en células no infectadas. Los resultados sugieren que la reducción de la actividad Topo I no era debido a una disminución en la cantidad de proteína enzimática.
2. Inhibición de la actividad de ADN La relajación de la Topo I por sonicada
M. fermentans
Para determinar si el efecto Mycoplasma en Topo I es ejercida por materiales secretados por Mycoplasma en vivo o por las proteínas estructurales de esta bacteria, se analizó la actividad de la Topo I en las células tumorales tratadas con la no-vivo, se sonicó ,
M. fermentans
. Las células (MCF7 y U251) se trataron durante 24 horas con el aumento de la concentración de proteína (5, 10, y 20 mg /ml) derivadas de
M sonicado. fermentans
. extracto nuclear se preparó a partir de las células tratadas y no tratadas y se midió la actividad de relajación de ADN I Topo. Como se muestra en la Figura 3A, D, una reducción significativa en la actividad de la Topo I se observó, de una manera dependiente de la dosis, en las células tratadas con
M. fermentans
proteínas (el baño de ultrasonidos). La cuantificación de la actividad de la Topo I [37] a partir de múltiples experimentos (n = 4) se realizó. Una reducción de 40 a 80% (
p
& lt; 0,05) en la actividad de la Topo I se observa en las células tratadas con 5 a 20 g /ml de
M sonicado. fermentans
proteínas durante 24 horas (Figura 3 B, E). Aunque se observó reducción de la actividad Topo I en células tratadas con Mycoplasma sonicado, el nivel de proteína Topo I no se vio afectada (Fig. 3C, F).
MCF7 (A-C) y U251 (D-F las células cancerosas) se trataron durante 24 horas con diversas concentraciones de
M. fermentans
proteínas. Se añadieron proteínas nucleares totales (12,5 ng) a una mezcla de reacción específica para los productos de reacción Topo I. se analizaron por electroforesis en gel de agarosa. (A, D) Una imagen representativa (n = 4-5) de la actividad de relajación me ADN Topo. (B, E) análisis de cuantificación de la actividad de la Topo I. nivel de proteína (C, F) Topo I examinó por análisis de transferencia Western. Símbolos: R y S son la forma más relajado y superenrollado del ADN pUC19, respectivamente, topográficas ninguna proteína añadida a la mezcla de reacción.
t-test
:. *
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01, ***
p Hotel & lt; 0,005
Este resultado indica que (sonicado)
M ya sea en vivo o no vivo. fermentans
ejercen efectos similares sobre la Topo I celular enzima.
3.
M. fermentans
disminuyó la inhibición del efecto sobre la actividad CPT ADN La relajación de la Topo I
Es de interés para examinar el efecto de la infección por Mycoplasma en la capacidad inhibitoria de los antagonistas de Topo I conocidos como CPT. Inicialmente, se realizó una serie de experimentos en los que las células se trataron con varias concentraciones de CPT con el fin de seleccionar la dosis CPT que causa casi llena la inhibición de la actividad de la enzima dentro de un corto período de tiempo (no mostrado). Se seleccionó una dosis de CPT de 30 micras, lo que inhibió la actividad de la Topo I por 90 a 95% dentro de 1,5 h (Figura 4A, B; comparar el carril 4 con el carril 2). Las células fueron infectadas con vivo
M. fermentans
durante 6 horas a una MOI de 10
3 UFC /celular, seguido de 30 tratamientos M CPT durante 1,5 horas adicionales. Se observó una disminución significativa en el efecto inhibidor de CPT (de inhibición 95% a aproximadamente 60%) en las células MCF7 expuestos a la combinación de
M. fermentans
la infección y el tratamiento CPT (Figura 4A, B, comparar carril 6 con el carril 4,
p
& lt; 0,005). Se obtuvieron resultados similares con células U251 (Figura S1 A-B). El tratamiento de células con CPT se conoce para reducir la cantidad de proteína I Topo libre presente en el nucleoplasma debido a la estabilización de la enzima de ADN complejos escindibles por CPT. De hecho, el tratamiento de células tumorales con CPT reduce el nivel de proteína libre de Topo I (Figura 4C carril 3). La combinación de la infección por Mycoplasma y tratamiento CPT no afectó el nivel de proteína Topo libre que cuando se examina en relación con la cantidad de proteína β-actina (Figura 4C).
MCF7 células fueron infectadas con el
M. fermentans gratis (
M.f
) durante 6 horas seguidas de CPT (30 M) tratamientos para 1,5 horas adicionales. Se añadió proteína nuclear total (12,5 ng) a una mezcla de reacción específica para los productos de reacción Topo I. se analizaron por electroforesis en gel de agarosa. (A) una imagen representativa n = 5, de la actividad de I Topo DNA-relajación. (B) análisis de cuantificación de la actividad de la Topo I. nivel (C) Topo I proteína examinó por análisis de transferencia Western. Símbolos: R y S son la forma más relajado y superenrollado del ADN pUC19, respectivamente, topográficas ninguna proteína añadida a la mezcla de reacción
t-test
: *
p Hotel & lt; 0,05, * *
p Hotel & lt; 0,01, ***
p
. & lt; 0,005
4. Poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) Antagonistas impidió que el efecto inhibidor Mycoplasma inducida por el Topo I Actividad
Los resultados anteriores sugieren que la reducción de la actividad Topo I en las células tumorales ejercidas por
M. fermentans
podría ser debido a las modificaciones post-traduccionales de las proteínas enzimáticas. Topo I se somete a varias modificaciones después de la traducción, que afectan a su actividad: Fosforilación de Topo I por la caseína quinasa II o por PKC aumenta su actividad, mientras que ribosilación poli-ADP por PARP-1 disminuye su actividad. Además, la ubiquitinación de Topo I conduce a su proteólisis [44], [45]. Para determinar la vía por la que
M. fermentans
afecta la topoisomerasa I, se determinó en primer lugar el efecto de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) -3-inhibidor aminobenzamida (3AB) sobre la actividad de la Topo I, solo y como un pre-tratamiento con
M. fermentans
infección. células MCF7 se pre-incubaron con 3AB a diferentes concentraciones (1-3 mM) durante 1,5 horas seguido por
M. fermentans
infección (MOI de 10
3CFU /célula) y la incubación durante 6 horas adicionales. extracto nuclear se preparó y se analizó la actividad de la Topo I como se describe anteriormente. Los resultados representados en la Figura 5A-B muestran que el pretratamiento con 3AB impidió que el
M. la reducción inducida por fermentans
en la actividad de la Topo I. El tratamiento de células no infectadas con 3AB durante el tiempo indicado no influyó en la actividad celular Topo I (Figura 5A, B). Se obtuvieron resultados similares con las células U-251 (Figura S2 A-B).
células MCF7 fueron pre-incubadas con 3-aminobenzamida (3AB) durante 1 hora a varias concentraciones, seguido de
M. fermentans
infección (MOI de 10
3 UFC /célula) durante 6 horas adicionales. Se añadió proteína nuclear total (12,5 ng) a una mezcla de reacción específica para los productos de reacción Topo I. fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa (A) y la cuantificación de la actividad de la Topo I se llevó a cabo (B). Símbolos: R y S son la forma más relajado y superenrollado del ADN pUC19, respectivamente, topográficas ninguna proteína añadida a la mezcla de reacción
t-test
: *
p Hotel & lt; 0,05, * *
p Hotel & lt; 0,01, ***
p
. & lt; 0,005
5. Inhibidor de MEK impidió que el Mycoplasma Reducción inducida por Topo I Actividad y ERK 1/2 fosforilación
Informes recientes demostraron que PARP-1 es fosforilada por ERK [28]. El efecto de vivo
M. fermentans
de MAPKs en general, no se ha estudiado a fondo. La mayoría de los estudios con respecto a
M. fermentans Opiniones y MAPKs se realizaron con productos micoplasmas o Mycoplasma inactivado por calor (HIM). Sin embargo, algunos estudios mostraron que la infección de las células con diferentes Mycoplasma puede conducir a la fosforilación de ERK-[11], [17], [30]. En este estudio se examinó el efecto de MEK inhibidor PD-98059 sobre la actividad de la Topo I, solo o antes de la infección con
M. fermentans
. células MCF7 y U-251 se pre-incubaron con PD durante 1,5 horas a una concentración de 25 mM, seguido de
M. fermentans
infección (MOI de 10
3CFU /célula) y la incubación durante 6 horas adicionales. extracto nuclear se preparó y se analizó la actividad de la Topo I y la fosforilación de ERK utilizando análisis de transferencia Western con un anticuerpo específico contra p-ERK media. Los resultados demostraron que la adición de inhibidor de MEK a la reacción de Topo I no afectó a la actividad de Topo I (Figura 6A, B) y, en contraste, el tratamiento de las células con el inhibidor (PD) impidió la
M. fermentans-
reducción inducida en la actividad de Topo I (Figura 3A, B para las células U-251). Además, se encontró que la cantidad de p-ERK1 /2 se incrementó en las células infectadas (Figura 6C para las células MCF7 y la Figura S3 C para U-251), mientras que el tratamiento previo con PD impedido este aumento. El nivel de ERK total que no se vio afectada por los diversos tratamientos (Figura 6C). Estos resultados sugieren que la reducción de la actividad Topo I en
M. fermentans-
células está mediada por la señalización de MAPK infectado.
células MCF7 fueron pre-incubadas con inhibidores de MEK (PD) durante 1 hora a una concentración de 25 mM, seguido de
M. fermentans
infección (MOI de 10
3CFU /célula) durante 6 horas adicionales. Se añadió proteína nuclear total (12,5 ng) a una mezcla de reacción específica para los productos de reacción Topo I. fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa (A) y la actividad de la Topo I se cuantificó (B). Fosforilada ERK nivel de proteína media de MCF7-extracto se examinó por análisis de transferencia Western (C). Símbolos: R y S son la forma más relajado y superenrollado del ADN pUC19, respectivamente, topográficas ninguna proteína añadida a la mezcla de reacción
t-test
: ***
p Hotel & lt; 0,005 .
6.
M. fermentans
infección ascendió poli-ADP-ribosilación de Topo I derivadas de células MCF7
PARP-1 regula la actividad de la Topo I por ADP-ribosilación de la proteína enzimática [46]. Para examinar si la infección por
M. fermentans
inducidos Topo I modificación por PARP, proteína de Topo I se inmunoprecipitó por anticuerpos anti-Topo I derivados de la esclerodermia (SC) de suero de los pacientes [47] y se analizó mediante transferencia de Western usando anticuerpo monoclonal anti-poli-ADP-ribosa (Figura 7A).