Extracto

Hay evidencia creciente de que la interferencia funcional entre los GPCR y EGFR contribuye a la progresión de colon, de pulmón, de mama, de ovario, de próstata y tumores de cabeza y cuello. En este estudio, hemos realizado múltiples análisis de la expresión de GPCR en una línea resistente a gefitinib cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) celular, H1975, que alberga una mutación L858R /T790M. Para determinar el perfil de expresión de los ARNm que codifican 384 GPCRs en fibroblastos de pulmón humano normal (NHLF) y las células H1975, se realizó un análisis de microarrays-GPCR específico. Un mapa de calor de los microarrays reveló diferencias considerables en la expresión de GPCR entre las células NHLF y H1975. A partir de la lista de expresiones GPCR, se seleccionaron algunos agonistas de GPCR /antagonista para investigar si los ligandos respectivos podrían afectar el crecimiento de las células H1975. Entre ellos, el tratamiento con un antagonista selectivo de los receptores de adenosina A2a, que fueron altamente expresado en células H1975 y otras células de NSCLC gefitinib resistente, las células HCC827GR o "pequeños ARN de interferencia" (siRNA) de orientación receptores de adenosina A2a produjo una disminución significativa en la celda viabilidad tanto de las células H1975 y HCC827GR. Entre hasta reguladas GPCR en células H1975, GS, Gi y los GPCR acoplados a Gq se expresaron casi por igual. Entre los GPCR-regulado, los GPCR acoplados a Gi se expresaron predominantemente en células H1975. Los presentes resultados sugieren que la interferencia de múltiples capas entre GPCRs y EGFR puede desempeñar un papel importante en la organización de las moléculas de señalización corriente abajo que están implicados en el desarrollo de NSCLC gefitinib resistente

Visto:. Kuzumaki N, Suzuki A, Narita M, Hosoya T, Nagasawa A, Imai S, et al. (2012) Los análisis de múltiples proteínas G del receptor acoplado (GPCR) Expresión en el desarrollo de la resistencia a gefitinib en la transformación no de células pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (10): e44368. doi: 10.1371 /journal.pone.0044368

Editor: Pan-Chyr Yang, el Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán

Recibido: Septiembre 10, 2011; Aceptado: August 2, 2012; Publicado: 29 de octubre 2012

Derechos de Autor © 2012 Kuzumaki et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

cáncer de pulmón de células pequeñas no (NSCLC) es la principal causa de muerte por cáncer. Si bien, la quimioterapia puede prolongar ligeramente la supervivencia en pacientes con enfermedad avanzada, también se asocia con efectos adversos clínicamente significativos [1]. Epidérmico receptor del factor de crecimiento (EGFR) es un importante objetivo de la terapia anti-NSCLC molecular [2]. objetivos Gefitinib la hendidura ATP en la tirosina quinasa de EGFR, que se sobreexpresa en el 40-80 por ciento de NSCLC y muchos otros cánceres epiteliales [3]. la señalización de EGFR se desencadena por la unión de factores de crecimiento, tales como EGF, lo que resulta tanto en la dimerización de las moléculas de EGFR o heterodimerización con receptores relacionados, tales como HER2. La autofosforilación y transfosforilación de EGFR a través de sus dominios tirosina quinasa recluta efectores corriente abajo y activa las señales para la proliferación celular y la supervivencia [4]. Se han identificado mutaciones en el gen EGFR en muestras de pacientes con NSCLC que responden a los inhibidores de EGFR [5]. Estas mutaciones consisten en pequeñas deleciones que afectan a los aminoácidos 746 a través de 750 (delE746-A750) o mutaciones puntuales (con mayor frecuencia reemplazados leucina por arginina en el codón 858 [L858R]) [6], [7], [8]. Estas mutaciones modifican de señalización corriente abajo y mecanismos antiapoptóticos, y por lo tanto median los efectos oncogénicos [9]. Ambas mutaciones hacen que el tumor más sensibles a los compuestos que inhiben EGFR, lo más probable mediante el reposicionamiento de los residuos críticos que rodean la hendidura de unión a ATP del dominio tirosina quinasa del receptor, lo que estabiliza las interacciones tanto con ATP y sus inhibidores competitivos [6] , [7]. En nuestro caso, la secuencia de ADN del gen EGFR en una muestra de biopsia del tumor en la recaída mostró un segundo punto de mutación que cambió treonina a metionina en la posición 790 (T790M) de EGFR [5]. La eficacia de gefitinib es de duración limitada, debido principalmente a la resistencia a fármacos conferida por una segunda mutación puntual.

La actividad de Akt, que también se conoce como la proteína quinasa B (PKB), es estimulada por varios factores de crecimiento , y esta quinasa serina-treonina desempeña funciones conservadas evolutivamente en muchas funciones celulares, tales como la síntesis de proteínas y el crecimiento celular [10], [11]. Se ha informado de que inhibidor de EGFR cambia fuerte fosforilación de Akt, transitoria a débil fosforilación de Akt, sostenida. Debido a las características del filtro de paso bajo de la vía de Akt, esto conduce a la fosforilación fuerte de S6, que es una molécula de aguas abajo de Akt, de que, en ausencia del inhibidor. Por lo tanto, el inhibidor de EGFR podría actuar como un activador de aguas abajo de EGFR [12]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que el proceso de gefitinib resistencia conduce a la exacerbación de las células tumorales.

Una gran cantidad de evidencia indica que los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) juegan un papel crucial en la tumorigénesis, y están implicados en pasos importantes en la progresión del cáncer de transformación, el crecimiento y la supervivencia a la metástasis. Otra forma importante que los GPCR contribuyen a la tumorigénesis implica diafonía intensivo con una vía canónica. Hay pruebas considerables de que los agonistas de algunos GPCRs, a través de un proceso llamado transactivación, pueden activar receptores de tirosina quinasas del factor de crecimiento (RTK) en ausencia de factor de crecimiento añadido [13], [14], [15]. Esta es una vía importante que contribuye a la actividad promotora del crecimiento de muchos ligandos de GPCR. Por otro lado, los resultados recientes han indicado que las RTK transducen señales a través de la utilización GPCR moléculas de señalización y RTK propios ligandos pueden transactivar GPCRs. Para mediar en la supervivencia y la proliferación tumoral, GPCRs pueden interactuar con EGFR vías de señalización aguas abajo, incluyendo las vías de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /Akt, y Janus quinasa /transductores de señal y activadores de la transcripción (Jak /Stat3). De hecho, la interferencia funcional entre GPCRs y EGFR contribuye a la progresión de colon, de pulmón, de mama, de ovario, de próstata y tumores de cabeza y cuello [16], [17]. Por lo tanto, GPCR podría ser un sitio excelente para bloquear las señales oncogénicas, lo que haría las funciones de GPCR mediada dianas terapéuticas prometedoras en el desarrollo de fármacos para lograr una intervención innovadora en el CPNM. En el presente estudio, hemos realizado múltiples análisis de la expresión de GPCR en una línea celular de NSCLC gefitinib resistente, H1975.

Materiales y Métodos

Cultivo de células

El no humana pequeña célula de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) líneas HCC827, NCI-H1975 (H1975; American Type Culture Collection Co., MD, EE.UU.) y HCC827GR se cultivaron en medio RPMI 1640 con HEPES Modificación (Sigma-Aldrich, MO, EE.UU.) con 10% de suero bovino fetal (FBS; Invitrogen ™ Life Technologies Co., CA, EE.UU.) y 1% de penicilina-estreptomicina (PS; Invitrogen ™ Life Technologies Co.). Normales fibroblastos de pulmón humanos (NHLF; Lonza Inc., NJ, EE.UU.) se cultivaron en medio basal de fibroblastos con insulina, rhFGF-B, GA-1000 y FBS (todos de Takara Bio Inc., Tokio, Japón). Todas las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 a 37 ° C.

Establecimiento de la línea celular resistente a gefitinib, HCC827GR

HCC827 células fueron expuestas a 1 micra de gefitinib durante 48 h en medio que contiene suero bovino fetal 10%. Posteriormente fueron lavadas y cultivadas en medio libre de fármaco hasta que las células supervivientes fueron 80% de confluencia. Estas células fueron luego re-expuestos a concentraciones crecientes de gefitinib (1-5 M). Las células fueron finalmente capaces de crecer en 5 M gefitinib se obtuvieron 1,5 meses después de la exposición inicial. Las células resistentes establecidos se mantuvieron en medio que contiene 1 mM de gefitinib. Para todos los estudios in vitro, las células resistentes se cultivaron en medio libre de fármaco durante al menos 1 semana para eliminar gefitinib. Las células resistentes a gefitinib se conocen como HCC827GR

Reactivos

Los reactivos utilizados en el presente estudio fueron gefitinib (Toronto Investigación Chemicals Inc., Canadá), [Arg
8]. - vasopresina sal de acetato (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.), la angiotensina II (Sigma Chemical Co.), 2- (metiltio) adenosina 5'-trifosfato de sal tetrasódica hidrato (Sigma Chemical Co.), beraprost sódico ( Toray Industries Inc., Tokio, Japón), a-metil-5- (2-tienilmetoxi) -1H-indol-3-etanamina monohidrocloruro (BW723C86; Sigma Chemical Co.), 2-
p
- ( 2-carboxietil) fenetilamino-5'-N-etilcarboxamidoadenosina clorhidrato hidrato (CGS- 21.680; Sigma Chemical Co.), 7- (2-feniletil) -5-amino-2- (2-furil) - pirazolo [4, 3-e] -1,2,4-triazolo [1,5-c] pirimidina. (SCH-58261; Sigma Chemical Co.)

se determinó la viabilidad de la célula de ensayo

Las células viabilidad por el-2,5-difenil tetrazolio bromuro de ensayo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) (MTT). Twenty l de solución de MTT se añadió (5 mg /ml) a cada pocillo de medio de cultivo. Después de la incubación durante otras 2 horas, se retiró el medio y se añadieron 100 l de DMSO para resolver cristales de formazán. Se midió la densidad óptica hechos usando un lector de microplacas a una longitud de onda de absorción de 600 nm. En cada experimento, se prepararon tres réplicas para cada muestra. Se determinó la proporción de células vivas en base a la diferencia en la absorbancia entre muestras y controles.

GPCR TaqMan matriz

A TaqMan matriz de tarjeta de GPCR humano disponible comercialmente (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EE.UU.), que permite cuantificar la expresión de los ARNm que codifican GPCR de 50 subfamilias (343 receptores, sin incluir el odorante, olfativas, gustativas y los receptores de feromonas), se utilizó con el ARN extraído de células NHLF y H1975. El ARN total, obtenido de células NHLF y H1975, se extrajo utilizando el kit de aislamiento mirVana ™ miARN (Applied Biosystems Inc.). Para este ensayo, se preparó ADNc con un ARN de alta capacidad de kit cDNA (Applied Biosystems Inc.). Cada puerto se cargó con ADNc (de 1,5 g de ARN) y TaqMan Expresión Génica Master Mix (Applied Biosystems Inc.) según las instrucciones del fabricante. La placa fue analizada utilizando el software SDS2.3 y RQ Manager 1.2 proporcionado por Applied Biosystems. Los tiempos de ciclo se normalizaron aaato la limpieza gen GAPDH. Un enfoque comparativo Ct se utilizó para cuantificar los niveles relativos de ARNm utilizando RQ software 1.2. los niveles relativos de expresión se calcularon como 2 × 10
5. Los resultados de cada GPCR fueron examinados, y si la muestra tenía un umbral calculado por debajo de 0,1, se consideró para ser indetectable. En estos casos, para los propósitos de procesamiento de datos, el número de ciclo se fijó en 35,0.

preparación de ARN y el análisis semi-cuantitativo por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR)

ARN total en NHLF, H1975, HCC827 y HCC827GR se extrajo utilizando el sistema de aislamiento de ARN total SV (Promega, Madison, WI) siguiendo las instrucciones del fabricante. ARN total purificado se cuantificó espectrofotométricamente a A260. Para preparar la primera cadena de ADNc, 1 g de ARN se incubó en 100 l de tampón que contenía ditiotreitol 10 mM, MgCl 2,5
2, mezcla de dNTP, 200 U de la transcriptasa inversa II (Invitrogen), y 0,1 mM oligo-DT12 -18 (Invitrogen). Cada gen se amplificó en 50 l de solución de PCR que contenía 0,8 mM de MgCl
2, mezcla de dNTP, y ADN polimerasa con cebadores sintetizados de receptor A2a humano (sentido: GGCTGCCCCTACACATCATCAACT, antisentido: TGGGCCAGGGGGTCATCT) y GPR87 (sentido: 5'-CTCTAAAGGGGTAAGGGAGA -3 ', antisentido: 5'-TGGGTTCAGCATAGGTTATT-3'). Las muestras se calentaron a 95 ° C durante 1 min, 55 ° C durante 2 min, y 72 ° C durante 3 min. El final de incubación fue a 72 ° C durante 7 min. La mezcla se ejecuta en la electroforesis en gel de agarosa al 2% con los marcadores y cebadores indicados para el deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato estándar interno. El gel de agarosa se tiñó con bromuro de etidio y se fotografió con transiluminación UV. La intensidad de las bandas se analizó y semi-cuantificado por densitometría asistida por ordenador utilizando el software ImageJ.

Preparación de muestras y Western Blot

Las células se solubilizaron con tampón que contiene 20 mM Tris-HCl (pH 7 0,4), 0,3% (w /v) de Triton, MgCl 3 mM
2, 1 M de sacarosa, α-Me 5 mM, y 1 /1.000 inhibidor de la proteasa durante 15 minutos. Los lisados ​​celulares se centrifugaron a 2350 g durante 10 min a 4 ° C y el sobrenadante se retuvo como la fracción lisado para transferencia Western. Una alícuota de la muestra se diluyó con un volumen igual de tampón de muestra 2 × electroforesis (Protein Gel colorante de carga-2X, Amresco, Solon, OH) que contiene 2% de dodecilsulfato de sodio (SDS) y 10% de glicerol con 0,2 M de ditiotreitol. Proteínas (7 l /carril) se separaron por tamaño en gel de gradiente de SDS-poliacrilamida al 4-20% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa en tampón de Tris-glicina que contiene Tris 25 mM y glicina 192 mM. Para la detección de inmunotransferencia, las membranas fueron bloqueadas en solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía 1% de leche descremada (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.), que contiene 0,1% de Tween 20 (Research Biochemicals, Inc., MA, EE.UU.) durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. La membrana se incubó con el anticuerpo primario diluido en TBS [1:1000 GPR87 (Abcam, Cambridge Reino Unido), 1:200,000 gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; Chemicon International Inc., Temecula, CA, EE.UU.)] que contiene 1% sin grasa leche en polvo con 0,1% de Tween 20 durante la noche a 4 ° C. La membrana se lavó en TBS que contiene 0,05% de Tween 20 (TTBS), y después se incubó durante 2 h a temperatura ambiente con IgG de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL, EE.UU.) diluido 1 :10,000 en TBS que contiene 1% de leche sin grasa seca que contiene 0,1% de Tween 20. Después de esta incubación, las membranas se lavaron en TTBS. El complejo antígeno-anticuerpo peroxidasa finalmente fue detectado por un aumento de quimioluminiscencia (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante y se visualizó mediante exposición a Amersham Hyperfilm (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL, EE.UU.).

"pequeños ARN de interferencia" (siRNA) transfección

H1975 y las células fueron transfectadas con HCC827GR disponible en el mercado "pequeños ARN de interferencia" (siRNA) dirigidos a los receptores A2A de adenosina (Nippon EGT CO., Toyama, Japón) tras la inversa método de transfección. La correspondiente secuencia de ARNm diana de receptor A2a de adenosina para el ARNsi fue el siguiente: 5'-ACAGCAACCTGCAGAACGT-3 ', (número de acceso: NM_000675.4). En pocas palabras, siRNA específicos del gen del receptor de adenosina A2A se diluyeron en Opti-MEM (Invitrogen) y se mezclan con RNAimax (Invitrogen) previamente diluido en Opti-MEM. Después de 20 min de incubación a temperatura ambiente, se añadieron los complejos a la 96 pocillos. Después de eso, las células (5 × 10
3 células) fueron sembradas en ese pozo. Después de 3 días de cultivo, la viabilidad celular se detectó mediante un ensayo MTT.

Análisis estadístico

Todos los datos se presentan como la media ± S.E.M. La significación estadística de las diferencias entre grupos se evaluó mediante el análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni /Dunn. La significación estadística de las diferencias entre los dos grupos se evaluó con de Student
t-test
.

Resultados

Efecto de la gefitinib inhibidor de tirosina quinasa en el crecimiento de células no pequeñas cáncer de pulmón de células (NSCLC) guía
la adición del inhibidor de tirosina quinasa gefitinib (0,0001 M-1 M) a HCC827 células, que se han clasificado como la línea celular de NSCLC sensibles a gefitinib [5], producido por 2 días una disminución dependiente de la concentración en el crecimiento de células tumorales (Figura 1a-i, p & lt; 0,001 grupo no tratado vs.). En contraste, la adición de gefitinib (0,0001 M-1 M) durante 2 días no afectó el crecimiento de células H1975 (Figura 1a-ii).

HCC827 (a) o H1975 (b) se incubaron células durante 2 días con gefitinib, y luego la viabilidad celular se midió (*** p & lt; 0,001 frente a grupo no tratado).

diferente expresión de GPCR entre NHLF y H1975 células

para el perfil de expresión de los ARNm que codifican 384 GPCRs en NHLF y H1975 células, se realizó un análisis TaqMan-GPCR específico de microarrays (Figuras 2, 3, Figuras S1-1, S1-2, S1-3 de la lista de genes de GPCR en la matriz). El gráfico de dispersión mostró que había muchas más GPCRs regulados hasta que los GPCR-regulados negativamente en comparación con las células H1975 NHLF. Un mapa de calor de los microarrays reveló diferencias considerables en la expresión de GPCR entre las células NHLF y H1975 (Figuras 2, 3).

expresión de GPCR humano se analizó mediante microarrays.

cada GPCR se muestra como una sola barra en base a sus valores de Ct y un código de colores que se muestra a continuación, con un gradiente de color verde (negativo y menores valores de Ct) a rojo (positivo y altos valores de Ct).

los cambios en los coeficientes de la expresión de subunidades Gα (Gs, Gi y Gq) en células H1975

los patrones de expresión de subunidades Gα entre GPCRs arriba-abajo o regulada de células H1975 en comparación con NHLF se asignan a la siguiente grupos: hasta reguladas Gs acoplado a GPCR (Tabla 1-a), hasta reguladas Gi acoplado a GPCR (Tabla 1-b), hasta reguladas Gq acoplado a GPCR (Tabla 1-c), las reguladas Gs acoplado GPCR (Tabla 2-a), las reguladas Gi-GPCR acoplados (Tabla 2-b) y las reguladas Gq acoplado a GPCR (Tabla 2-c).

El ARNm y sus expresiones de proteínas de GRP87, que era el más GPCR hasta reguladas que se encuentra en la matriz de GPCR, fueron significativamente hasta reguladas en H1975 células en comparación con los de las células NHLF (Figura 4a: p & lt; 0,01 frente NHLF, Figura 4b: p & lt ; 0,001 vs. NHLF)

(a) superior: Representante RT-PCR para ARNm de GPR87 y GAPDH, un patrón interno, en cada tipo de célula.. Baja: La intensidad de las bandas se determinó semi-cuantitativamente usando ImageJ. Los valores para GPR87 mRNA se normalizaron por el valor de ARNm de GAPDH. Los datos representan la media con S.E.M. de 3 muestras independientes (*** p & lt; 0,001 vs. NHLF). (B) Parte superior: Western blots representativos de GPR87 Baja: transferencias de Western representativas de GPR87 en fracciones membranosas de las células H1975. Cada columna representa la media con S.E.M. de 3 muestras independientes (** p & lt; 0,001 frente a grupo no tratado).

Entre fueron expresadas hasta reguladas GPCR en células H1975, GS, GI y GPCR acoplados a Gq casi por igual . Entre los GPCR-regulado, los GPCR acoplados a Gi se expresaron predominantemente en células H1975 (Figura 5) guía
El porcentaje de patrón de expresión de la subunidad Gα. (Gs: rojo, Gi: azul y Gq: verde) en el hacia arriba o hacia abajo se muestra regulados GPCRs de células H1975 en comparación con NHLF.

Efectos de un agonista de GPCR selectiva o antagonista sobre el crecimiento de células H1975 gefitinib resistente

a partir de la lista de expresiones GPCR, se seleccionaron algunos GPCR agonista /antagonista disponible en el mercado para investigar si los ligandos respectivos afectaron el crecimiento de células (Figura H1975 S2). Un receptor de adenosina A2a (CGS-21680), un receptor de angiotensina II tipo 1 agonista (angiotensina II) y un receptor purinérgico P2Y acoplados a proteína G 2 agonista (2- (metiltio) adenosina 5'-trifosfato de hidrato de sal tetrasódica), que eran todos los agonistas de GPCR hasta reguladas en la lista de microarrays, no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento de células tumorales. Del mismo modo, el crecimiento celular no se vio afectada por una prostaglandina I
2 receptor agonista (IP) (beraprost sódico), un agonista de 5-hidroxitriptamina receptor 2B (BW723C86) y un agonista del receptor de la arginina vasopresina 1A ([Arg
8] -vasopresina sal de acetato), todas las cuales fueron clasificadas como "GPCRs regulados hacia abajo". En contraste, la adición del antagonista selectivo del receptor A2a de adenosina SCH-58261 (10 nM-10 mM) durante 7 días (Figura 6a) produjo una disminución dependiente de la concentración en el crecimiento celular H1975 (p & lt; 0,01, p & lt; 0,001 vs. no grupo tratado)

(a) se incubaron las células H1975 durante 7 días con la adenosina antagonista selectivo del receptor A2a SCH-58261 (10 nM-10 mM), y luego la viabilidad celular se midió (** p & lt;. 0.01 , *** p & lt; 0,001 vs. grupo no tratado). (B) El tratamiento con siRNA dirigidos a los receptores de adenosina A2A a H1975 células durante 3 días disminuyó significativamente la viabilidad celular de las células H1975 (** p & lt; 0,01 frente al grupo no tratado).

A continuación realizó a transducción de siRNA dirigidos a los receptores de adenosina A2A en células H1975. Las células se recogieron para la detección del nivel de ARNm del receptor A2a de adenosina semi-cuantitativamente por RT-PCR en 72 h después de la transfección. La expresión del receptor de adenosina A2a en presencia de siRNA dirigidos a los receptores de adenosina A2A se había reducido regulado en un 90% en comparación con el no tratamiento (datos no mostrados). En estas condiciones, el tratamiento con siRNA dirigidos a los receptores A2a de adenosina produjo una disminución significativa en el crecimiento celular H1975 (Figura 6b: p & lt; 0,001 vs. grupo no tratado).

Papel de los receptores de adenosina A2a en el crecimiento de gefitinib HCC827GR células resistentes

para confirmar la función de los receptores de adenosina A2A en gefiitnib-resistencia a NSCLC, que generan anaother células HCC827GR gefitinib resistente al exponer HCC827 células a concentraciones crecientes de gefitinib durante 1,5 mes. De acuerdo con un análisis de la secuencia, las células tenían HCC827GR segunda mutación puntual, debido a la resistencia causada principalmente de drogas, 2369 C & gt; T en el exón EGFR 20-21, lo que llevó a las transiciones Thr790Met (Figura 7a-i). Por lo tanto, la adición de gefitinib (0,01 mM-1 mM) durante 2 días no afectó el crecimiento de células HCC827GR (Figura 7a-ii). La expresión de mRNA del receptor de adenosina A2a se incrementó dramáticamente en las células HCC827GR comparación con las células HCC827 y NHLF (Figura 7b, P & lt; 0,001 vs. NHLF). En estas condiciones, el antagonista del receptor A2a de adenosina selectivo SCH-58261 (10 nM-1 M) durante 7 días produjo una disminución dependiente de la concentración en el crecimiento celular HCC827GR (Figura 7c, p & lt; 0,05, p & lt; 0,001 grupo frente a no tratada ). Además, el tratamiento con siRNA dirigidos a los receptores de adenosina A2a también produjo una disminución significativa en el crecimiento celular HCC827GR (Figura 7d: p & lt; 0,001 vs. grupo no tratado).

(a-i) análisis de la secuencia en la celda HCC827GR. Un cambio de un solo nucleótido C & gt; T (exón EGFR 20) en el ADN, lo que crea un cambio de sentido erróneo en la secuencia de proteína que sustituye a una treonina con un residuo de metionina. células HCC827GR (a-ii) se incubaron con gefitinib durante 2 días, y luego se midió la viabilidad celular. (B) Parte superior: Representante RT-PCR para ARNm de receptor A2a de adenosina (ADORA2A) y GAPDH, un patrón interno, en cada tipo de célula. Baja: La intensidad de las bandas se determinó semi-cuantitativamente usando ImageJ. Los valores para ADORA2A mRNA se normalizaron por el valor de ARNm de GAPDH. Los datos representan la media con S.E.M. de 3 muestras independientes (*** p & lt; 0,001 vs. NHLF). Se incubaron (c) células HCC827GR durante 7 días con el antagonista selectivo del receptor A2a de adenosina SCH-58261 (10 nM-10 mM), y luego se midió la viabilidad celular (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 frente a no tratados grupo). (D) El tratamiento con siRNA dirigidos a los receptores de adenosina A2A a HCC827GR células durante 3 días, disminuyó significativamente la viabilidad celular de las células HCC827GR (*** p & lt; 0,001 frente a grupo no tratado).

Discusión

GPCRs tradicionalmente se han asociado con muchas de las funciones de, células post-mitóticas diferenciadas. Por otra parte, GPCRs se expresan también en la proliferación de células y contribuyen a la embriogénesis, la remodelación y reparación de tejidos, la inflamación, la angiogénesis, el crecimiento normal de las células y el cáncer.

Entre ellos, los receptores activados por proteasa (PAR), de quimioquinas receptores y receptores de lípidos bioactivos tales como LPA y la esfingosina-1-fosfato (S1P) han sido implicados en la proliferación celular aberrante en una amplia variedad de células cancerosas. Además, los neuropéptidos, como la endotelina, la bradiquinina, neuromedina B, colecistoquinina y la angiotensina II activan sus GPCRs afines para estimular la proliferación celular en varios tipos de células, y desempeñan un papel crucial en muchos cánceres humanos agresivos, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), cáncer de páncreas, carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC), y el cáncer de próstata [18], [19]. Sin embargo, ha habido pocos informes sobre el papel crítico de los GPCR en las células NSCLC gefitinib resistentes, tales como células H1975. Una mejor comprensión del papel de los GPCRs en NSCLC puede provenir de múltiples análisis de perfiles de expresión génica. es probable que sean herramientas útiles para este propósito Microarray estudios. Por lo tanto, se realizó un análisis de microarrays de GPCR de células H1975 gefitinib resistente en comparación con las células de fibroblastos de pulmón humanos normales. Por el perfil de la expresión de los ARNm que codifican GPCR, encontramos un gran número de GPCRs sobreexpresados ​​en células H1975. Se ha reconocido que muchos GPCRs que se sobreexpresa en varios tipos de cáncer de promover el crecimiento de células tumorales cuando se activa mediante la circulación o ligandos producidos localmente. Entre los GPCR, GRP87 fue catalogado como el más GPCR-regulada de manera ascendente en el presente conjunto de GPCR. Después de esta matriz, se validó la expresión arriba regulado de GRP87 mRNA y su proteína mediante RT-PCR y Western Blot, en comparación con los observados en las células NHLF. En las células H1975, GS, Gi y Gq-GPCR acoplados se sobreexpresa a casi la misma medida, mientras que algunos GPCR acoplados a Gi se redujeron reguladas en las células H1975.

La activación de los receptores A2a ha informado de provocar efectos inmunosupresores, lo que disminuye la inmunidad anti-tumoral y por lo tanto estimula el crecimiento del tumor. En estudios de comportamiento, se ha sugerido que los antagonistas de A2a, debe añadirse a los protocolos de inmunoterapia para el cáncer para mejorar la inmunoterapia tumoral. Estos compuestos ya se han demostrado ser seguro en los ensayos con antagonistas de A2a en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson [20]. En el presente estudio, se investigó si los agonistas específicos /antagonista que actúan sobre los GPCR que son regulados hasta o hacia abajo-regulada en células H1975 podría afectar el crecimiento de las células H1975. Entre los GPCRs de la lista, un antagonista selectivo de receptor de adenosina A2a, que era uno de los ligandos disponibles comercialmente para GPCRs sobreexpresados ​​en las células H1975, produjo una disminución dependiente de la dosis en la viabilidad celular H1975. Similar al antagonista, el tratamiento con siRNA dirigidos a los receptores A2a de adenosina produjo una disminución significativa de la viabilidad celular H1975. Para investigar más a fondo el papel de los receptores de adenosina A2A en gefiitnib-resistencia a NSCLC, que generó otro clon resistente a gefitinib mediante la exposición de gefitinib a las células de NSCLC gefitinib sensible, HCC827 células. Como H1975 células, la expresión de ARNm del receptor A2a de adenosina se incrementó dramáticamente en las células HCC827GR geftinib resistente en comparación con las células HCC827 y NHLF. En estas condiciones, el tratamiento con el antagonista del receptor A2a de adenosina selectivos o receptores A2A de adenosina de orientación siRNA produjo una disminución significativa en el crecimiento celular HCC827GR. Estos hallazgos sugieren que, aunque más
in vivo
todavía se necesitan estudios, la capacidad de interferir con los receptores de adenosina A2a pueden ofrecer oportunidades únicas para la prevención y el tratamiento del NSCLC. Por otro lado, los agonistas selectivos para los receptores de adenosina A2a, la angiotensina II receptor-como 1, receptor purinérgico P2Y acoplados a proteína G 2, la prostaglandina I
2 receptor (IP), 5-hidroxitriptamina 2B receptor y el receptor de vasopresina arginina 1A tenía ningún efecto sobre la viabilidad celular H1975, que refleja las funciones complejas de GPCRs se expresan en estas células. Muchos de los ligandos o inhibidores de GPCR que estaban arriba o hacia abajo-regulada en células H1975 no estaban disponibles para el presente estudio. Por ejemplo, se considera que GPR87, que era la más grande GPCR sobreexpresa en las células H1975, juega un papel crucial en la supervivencia dependiente de p53 de las células cancerosas expuestas a los daños del ADN [21]. Sin embargo, el ligando específico y su antagonista aún no han sido identificados. Puesto que no hay duda de que los GPCR pueden ser actores clave en la regulación de diversas respuestas fisiopatológicas, incluyendo el desarrollo y progresión del cáncer, es probable que los enfoques que suponga una interferencia con el ARN nos permitirá comprender mejor las funciones especializadas de los GPCR expresado en gefitinib resistente CPNM células

en conclusión., hemos demostrado que un gran número de GPCRs son regulados, mientras que algunos se redujeron reguladas a través de la interferencia funcional entre EGFR y la transcripción aguas abajo de GPCR en el desarrollo de la resistencia a gefitinib en el CPNM.

Apoyo a la Información
Figura S1. List de GPCR símbolos de genes en microarrays. TaqMan Arrays tarjeta de GPCR humano que nos permite cuantificar la expresión de los ARNm que codifican GPCR de 50 subfamilias (343 receptores, sin incluir el odorante, olfativas, gustativas y los receptores de feromonas), se utilizó
doi:. 10.1371 /journal.pone .0044368.s001 gratis (PDF)
figura S2.
efectos de varios agonistas de GPCR en el crecimiento de células H1975. células H1975 se incubaron durante 2 días con cada ligando GPCR (1, 10 M) y el ensayo de MTT se realizó a continuación. Los datos de viabilidad celular representa la media con S.E.M. de 5 muestras independientes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044368.s002 gratis (PDF)