Extracto
estudios de asociación
genoma completo (GWAS) de cáncer colorrectal (CCR) han conducido a la identificación de una serie de variantes comunes asociados con un riesgo modesto. Varias variantes de riesgo mapa en las proximidades de TGF /BMP de señalización vía genes, incluyendo rs4939827 dentro de un intrón de
SMAD7
en 18q21.1. Un estudio previo implicado una novela SNP (novela 1 o rs58920878) como una variante funcional dentro de un elemento potenciador en
SMAD7
intrón 4. En este estudio, mostramos que cuatro SNPs incluyendo novela 1 (rs6507874, rs6507875, rs8085824 y rs58920878) en desequilibrio de ligamiento (LD) con los rs4939827 SNP índice de demostrar los efectos potenciadores específicos de alelo en un gran potenciador, multi-componente de
SMAD7
. Todos los cuatro SNPs demuestran proteína específica de alelo unión a extractos nucleares de las líneas celulares de CRC. Además, algunos de los alelos de riesgo asociado se correlacionan con una mayor expresión de
SMAD7
en tejidos de colon normales. Finalmente, se muestra que el potenciador es sensible a la estimulación BMP4. Tomados en conjunto, proponemos que el riesgo de CCR asociado a 18q21.1 se debe a cuatro variantes funcionales que regulan
SMAD7
expresión y potencialmente perturban un bucle de retroalimentación negativa BMP en TGF /BMP vías de señalización.
Visto: Fortini BK, Tring S, Plummer SJ, Edlund CK, Moreno V, Bresalier RS, et al. (2014) Riesgo Múltiple funcional variantes en un reforzador SMAD7 Implicate un haplotipo de riesgo de cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (11): e111914. doi: 10.1371 /journal.pone.0111914
Editor: Ludmila Prokunina-Olsson, Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de mayo de 2014; Aceptado: 1 de octubre de 2014; Publicado: 6 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Fortini y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (R01 CA143237, CA148107 U19 de GC). El desarrollo científico y la financiación de este proyecto fue apoyado en parte por las asociaciones genéticas y mecanismos de Oncología (GAME-ON), una iniciativa Post-GWAS del Cáncer del NCI. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional del Cáncer o los Institutos Nacionales de Salud, que no participó en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación de la manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores declaran que no existen intereses en competencia
Introducción
señalización de TGF mucho tiempo se ha asociado con el cáncer colorrectal (CCR). Además de las funciones canónicas en la regulación de la apoptosis, la diferenciación celular y el crecimiento de células de epitelio intestinal, la señalización de TGF es un jugador importante en la respuesta inmune y la enfermedad inflamatoria intestinal, un factor de riesgo para CRC (revisiones [1] - [3] ). TGF y la señalización de BMP definen las dos ramas principales de la vía TGF. La activación de las dos ramas conduce a la contratación de R-Smads, SMAD2 /3 en el caso de TGF o Smad1 /5/8 en el caso de las BMP, que forman un complejo con SMAD4. Este complejo entonces dirige la transcripción de muchos genes diana, incluyendo
SMAD7
. SMAD7, un inhibidor SMAD como SMAD6, a su vez sirve como un regulador de realimentación negativa de la señalización de TGF y BMP, además de actuar como un nodo de diafonía con otras vías incluyendo TNF [4], [5].
SMAD7 también desempeña otras funciones importantes en la etiología de la CRC, como interactuar con β-catenina para regular
MYC
expresión y señalización WNT [6].
SMAD7
sobreexpresión se ha visto en algunas células de CRC, y la reducción de
SMAD7
expresión usando ARN antisentido conduce a la disminución de la proliferación en la línea celular HCT-116 CRC y explantes neoplásicas CRC humanos, y la reducción de la tumorigénesis en el APC
min /- ratón [7]
CRC GWAS han conducido a la identificación de varias regiones genómicas asociadas con el riesgo que incluyen genes en la vía de señalización de TGF incluyendo
SMAD7.
,
BMP2
,
BMP4
, y
GREM1
[8] - [14]. Esto incluye rs4939827 polimorfismo de nucleótido único (SNP), que se encuentra en
SMAD7
intrón 4, que ha sido reportado en varios estudios. Pittman et al. informó que una novela SNP (denominado novela 1, más tarde renombrado rs58920878) asignada a un elemento potenciador que llevó a la expresión de GFP en
Xenopus
músculos renacuajo y colon y recto de una manera específica de alelo, que implican a rs58920878 como una variante funcional dentro de esta región [15].
Impulsados por nuestro descubrimiento de múltiples variantes funcionales dentro de la región 11q23 CRC GWAS [16], hemos examinado exhaustivamente la región genómica que rodea a los rs4939827 CRC tagSNP en 18q21.1 para otros SNPs funcionales potenciales. Se identificaron 4 SNPs, rs6507874, rs6507875, rs8085824 y rs58920878 (novela 1), en una región de aproximadamente 2 kb, que demuestra cada potenciador de la actividad específica de alelo. Se determinó además que los alelos correspondientes al haplotipo de riesgo correlacionado con una mayor expresión de
SMAD7
en los tejidos epiteliales de colon normales. Secuencias que abarcan los cuatro SNPs también unidos a proteínas nucleares a partir de líneas celulares de CRC de una manera específica de alelos en los ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA). Por último, hemos demostrado que el potenciador era responsable de la señalización inducida por BMP4 en ensayos de luciferasa, mientras que ni haplotipo era sensible a TGFß1. Tomados en conjunto, proponemos que el riesgo de CCR en el cromosoma 18q21.1 es debido a las contribuciones de 4 variantes funcionales en un promotor que afectan a la expresión de
SMAD7
, que puede conducir a una regulación perturbada del bucle de retroalimentación negativa en BMP BMP /TGF vías de señalización.
resultados
Análisis Región
el índice de rs4939827 SNP asociado con el CRC en el cromosoma 18q21.1 se encuentra dentro del intrón 4 de la
SMAD7
gen. Hay 20 SNPs en LD con rs4939827 con un r
2≥0.2 en la población CEU (1000 Proyecto Genoma, junio de 2011 la liberación), nuestro umbral LD seleccionada para los candidatos potenciales funcionales (Figura 1A y 1C). Todos los 21 SNPs se encuentran dentro de una región de 16 kb de la
SMAD7
intrón 4. Con el fin de identificar posibles secuencias de regulación genómica de esta región, los SNPs en LD con rs4939827 se alinea con la inmunoprecipitación de la cromatina y secuenciación (chip-ss ) canciones de metilación de las histonas y acetilación de marcas asociadas con los potenciadores, H3K4me1 y H3K27ac (Figura 1B). Para este estudio, que hace referencia sigmoide acetilación H3K27 Colón de la Hoja de Ruta Epigenómica Consorcio [17], y el CRC líneas celulares SW480 y monometilación HCT-116 H3K4 generado en nuestro laboratorio y del proyecto ENCODE, respectivamente [16], [18], [ ,,,0],19]. Varios picos potenciadores potenciales que contienen SNPs en LD con rs4939827 se identificaron en el colon sigmoide, SW480, o células HCT-116, incluyendo una región de 2 kb que contiene rs58920878 (franja verde, Figura 1B). Con el fin de caracterizar la región de manera integral, los picos más pequeños por debajo del umbral para el software llamando pico también se clonaron y se analizó la actividad si contenían un SNP cumplir con nuestra LD corte. DNasa I hypersenstitivity pistas del proyecto ENCODE también fueron alineados, pero no hay picos coinciden en parte con cualquiera de los candidatos SNPs en LD con rs4939827 [20], [21].
(A) El
SMAD7
gen representado con coordenadas genómicas (hg19) y la posición de SNPs en LD (r
2≥0.2, CEU población) con rs4939827 tagSNP. (B) UCSC Genome Browser vista de SMAD7 con SNPs en LD con rs4939827 indicados. pistas de chip-ss para las marcas de las histonas son potenciadores de colon sigmoide (SC) H3K27ac del REMC /UCSD para el Consorcio Epigenómica Hoja de Ruta, SW480 (SW) H3K4me1, y HCT-116 (HCT) H3K4me1 del consorcio ENCODE. Me hipersensibilidad DNasa un seguimiento de HCT-116 (HCT) y Caco-2 a continuación son del conjunto de datos ENCODE UW. La franja verde representa el fragmento potenciador A. rayas rojas indican los fragmentos clonados B a G (de izquierda a derecha) que se muestra a carecer de potenciador de la actividad. Coordenadas para cada fragmento se proporcionan en S1 Archivo. parcela de desequilibrio (C) Vinculación para rs4939827 incluyendo todos los SNPs en el proyecto de 1Kg con r
2≥0.2, creados con Haploview. r
2 = 1- negro, 1 & gt; r
2 & gt; 0,2 - escala de grises. (D) Vista ampliada de un fragmento de una visita sub-fragmentos A1-A4. El ENCODE en capas H3K4me1 un registro de 7 líneas celulares se muestra para identificar picos específicos de tipo celular. (E) Los haplotipos y porcentajes de población (CEU) para los 4 SNPs en el fragmento A y rs4939827. Haplotipos asociados con el alelo de riesgo rs4939827 T están en morado claro.
Ensayos de actividad Enhancer
Siete regiones potenciadoras putativos fueron clonados en un vector de ensayo de luciferasa para determinar potenciador de la actividad en las líneas celulares de CRC HCT-116 y SW480. Sólo el fragmento 2 kb (franja verde en la Figura 1B) en el extremo 3 'de
SMAD7
intrón 4 mostró actividad en nuestros ensayos, pero sólo en la orientación inversa (Figura 2A). Regiones probados, pero que carecen de actividad en este ensayo se indican en las rayas rojas en la figura 1B (Figura 2B). La región de promotor de 2 kb, que denominamos fragmento A, contiene 4 SNPs en LD con rs4939827: rs6507874, rs6507875, rs8085824 y rs58920878 (1) nuevos. Una vista ampliada del fragmento A se muestra en la Figura 1D. Como se muestra en la Figura 1C, estos cuatro SNPs están en LD (r
2 = 1 a 0,494) entre sí y definen 5 haplotipos en la población CEU. Estos haplotipos se muestran en relación con la variante rs4939827 (alelo de riesgo T) en la Figura 1E [22], [23].
(A) actividad de luciferasa relativa para el control positivo, fragmento A en el delantero, y el fragmento a en la orientación inversa. columnas de luz indican la actividad en HCT-116, columnas oscuras indican la actividad en SW480. (B) Los fragmentos B a G, que se muestra en la figura 1B como rayas rojas no muestran actividad potenciadora en cualquier orientación en HCT-116. Los controles positivos se muestran para cada grupo de constructos analizados en la misma placa. Fragmento E contiene las rs4939827 tagSNP. (C) Actividad del fragmento A en la orientación inversa con todos los SNPs en el fragmento con su alelo C, con cada alelo cambiado de forma independiente para el alelo alternativo, mostrado como factor de cambio en relación con la construcción que contiene los cuatro alelos C. Los cuatro alelos resultan en una reducción estadísticamente significativa en la actividad: rs6507874 T
p = 8,25
× 10
-3 (HTC-116),
p
= 3.30 × 10
-2 (SW480); rs6507875 G
p
= 3.40 × 10
2 (HCT-116),
p = 6,79
× 10
-3 (SW480); rs8085824 T
p =
1.20 × 10
2 (HCT-116),
p =
3.12 × 10
-3 (SW480); rs58920878 G
p = 2,09
× 10
-3 (HCT-116),
p =
3.05 × 10
-3 (SW480).
primero probamos si había diferencias específicas de alelo en potenciador de la actividad para cada uno de los SNPs a partir individualmente con un fragmento de 2 kb con los 4 alelos que contienen SNP C. Mientras que este haplotipo no se ve en la población CEU, esta combinación alelo mostró el potenciador de la actividad más alta de todos los fragmentos analizados. Hemos observado cambios específicos de alelo en potenciador de la actividad para cada uno de las cuatro variantes cuando los alelos se cambiaron mediante mutagénesis dirigida (Figura 2C). Los 4 SNPs mostraron una disminución en la actividad potenciador cuando alelos se cambiaron a la forma alternativa. La mayor disminución en la actividad se observó cuando rs58920878 fue cambiado de C a G. Mientras que los alelos de menor importancia para rs6507874 SNPs (T, la frecuencia del alelo menor (MAF) = 0,44) y rs58920878 (G, MAF = 0,34) mostraron una menor actividad potenciadora, el menor alelos de SNP rs8085824 (C, MAF = 0,34) y rs6507875 (C, MAF = 0,49) mostraron una actividad potenciadora mayor en estos ensayos.
el fragmento a abarca varios picos más pequeños distinta HCT-116 H3K4me1, con la más a la izquierda pico específico para HCT-116 en comparación con el estratificado H3K4me1 super-pista de 7 ENCODE Tier 1 líneas de células [19] (Figura 1D). Para probar las contribuciones relativas de estas regiones y SNPs individual sobre la actividad global potenciador, 4 construcciones más pequeñas, A1-A4, fueron diseñados (Figura 1D). El fragmento A1 incluye rs6507874 SNP rs6507875 y el pico y abarca específica HCT-116. Estos dos SNPs solamente están separados por 13 pb, y están en LD uno con el otro con r
2 = 0,794, D '= 1. Como se muestra en la Figura 3A, el potenciador de la actividad fragmento A1 demostrado. La principal haplotipo de rs6507874 y rs6507875 alelos en la población CEU, CG, demostró el nivel más bajo de potenciador de la actividad en comparación con los otros tres posibles combinaciones de alelos (Figura 3B). El TC y CC haplotipos menores mostraron aproximadamente 1.3 a 1.5 veces y 2 a 2,5 veces mayor actividad en ambas líneas celulares, HCT-116 y SW480, respectivamente (Figura 3B). La combinación de alelos TG, aunque no es un haplotipo conocido CEU, mostraron una actividad menor que el haplotipo TC. Tomados en conjunto, se concluye que, si bien los dos SNPs, rs6507874 y rs6507875, contribuyen al nivel general de actividad potenciadora del fragmento A1, alelos rs6507875 muestran un efecto específico de alelo más grande que rs6507874, en la dirección coherente con el fragmento de 2 kb (Figura 2C ). Por el contrario, el efecto del alelo rs6507874 en potenciador de la actividad dependía de que rs6507875 alelo estaba presente, lo que sugiere un efecto contextual dentro de los componentes potenciadores. Estos datos implican que existe una relación funcional complejo entre SNPs adyacentes.
(A) El fragmento A se dividió en 4 fragmentos de ADN más pequeños, A1-A4, representado en la Figura 1D. Cada actividad más pequeño fragmento demostrado potenciador, tanto en HCT-116 (barras claras) y SW480 (barras oscuras). Para el experimento se muestra, todos los SNPs contenían sus alelos C. (B) Actividad del fragmento A1 que contiene rs6507874 y rs6507875, que se muestra como el cambio veces en relación con el principal haplotipo CG para HCT-116 (barras claras) y SW480 (barras oscuras). El TC haplotipo menor (
p
= 2.25 × 10
2 (HCT-116),
p = 8,59
× 10
2 (SW480)), y la combinación CC (
p = 5,06
× 10
-5 (HCT-116),
p
= 1.75 × 10
-5 (SW480)) no se ve en la población CEU mostrar mayor actividad que el principal haplotipo. Combinación TG (
p = 0,450
(HCT-116),
p = 0,287
(SW480)) demuestra una actividad similar a CG. (C) Fragmento A2 que contiene rs8085824 muestra 2 veces mayor potenciador de la actividad con el alelo menor de C que el alelo principal T (
p =
4,75 × 10
-3 (HCT-116),
p = 3,61
× 10
4 (SW480)). (D) Actividad del A3 fragmento que contiene rs8085824 y rs58920878 en relación con las principales TC haplotipo. El haplotipo menor CG demuestra mayor actividad que TC (
p =
2.49 × 10
2 (HCT-116),
p = 6,32
× 10
-3 (SW480 )). El T (mayor) alelo de rs8085824 muestra una actividad menor que C (menor) alelo independientemente del alelo rs58920878. La actividad más alta se observa en CC haplotipo que no se informó en la población CEU (
p =
6.35 × 10
-7 (HCT-116),
p = 1,47 × 10
-6 (SW480)). (E) Actividad del fragmento A4 abarca el pico que contiene rs58920878. El alelo menor de G rs58920878 muestra dramáticamente menos actividad que el alelo principal C (
p = 1,92
× 10
-4 (HCT-116),
p = 1,52 × 10
-5 (SW480)). (F) El fragmento A se ensayó para determinar la actividad con los dos haplotipos más comunes (Figura 1E) en la población CEU. El haplotipo CGTC muestra una mayor actividad en HCT-116 (barras de luz,
p
= 1,04 × 10
-11) y SW480 (barras medianas,
p = 8,60
× 10
-11), pero no hubo diferencia significativa en la actividad de la RKO (barras oscuras).
el fragmento A2 contiene rs8085824 SNP y se extiende a la región entre los dos picos más prominentes HCT-116 H3K4me1 en un potenciador (Figura 1D). Mientras fragmento A2 tenía una actividad por cuenta propia, que mostró la menor actividad de las 4 sub-regiones analizadas (Figura 3A). Cuando el alelo rs8085824 fue cambiado de T (alelo principal) a C (alelo menor), la actividad aumentó dos veces (Figura 3C), en consonancia con los resultados para el fragmento más grande (Figura 2C). El fragmento A3 abarca la región A2 (incluyendo rs8085824) y 160 pb para incluir rs58920878. Este fragmento mostró 2 veces más actividad que el fragmento A2. La principal haplotipo rs8085824 y rs58920878 de (r
2 = 1, D '= 1, CEU) es el TC. El haplotipo menor CG demostró 1.3 a 1.6 veces mayor que la actividad de la mayor haplotipo en células HTC-116 y SW480, respectivamente. La combinación CC alelo construido artificialmente tenía el más alto nivel de actividad probado para el fragmento A3. Comparando el fragmento de CC a los fragmentos de haplotipos TC y CG, se observó que una caída mayor de la actividad el resultado de cambiar el alelo rs8085824 que rs58920878. A la inversa, el cambio de rs58920878 en el haplotipo TC de TG no dieron como resultado una diferencia significativa en la actividad potenciador. Al igual que con el fragmento A2, para rs8085824 SNP estos resultados fueron consistentes con los efectos específicos de alelo visto utilizando el fragmento más grande (Figura 2C). Sin embargo, para SNP rs58920878, el efecto predicho por el fragmento de 2 kb dependía de qué alelo rs8085824 estaba presente, de nuevo, lo que sugiere que existe una relación funcional complejo entre SNPs adyacentes.
Finalmente, fragmento A4, que abarca la segunda más pequeño HCT-116 pico H3K4me1, sólo contenía rs58920878 SNP y demostró una actividad similar a fragmentos A1 y A3 (Figura 3A). Este fragmento mostró potenciador de la actividad se redujo 3 veces cuando el alelo principal C se cambió a la menor alelo G (Figura 3E). El fragmento de rs58920878 A4 que contiene fue el único de los fragmentos más pequeños donde el alelo menor o haplotipo demostrado una actividad menor que el alelo mayor /haplotipo.
Los dos haplotipos más comunes en los CEU de este grupo de 4 SNPs son CGTC (49,9%) y TCCG (33,4%) (Figura 1E). Estas combinaciones se ensayaron en el contexto de la 2 kb potenciador Una construcción. Como se muestra en la Figura 3F, en general la mayor haplotipo CGTC demostró potenciador de la actividad más alta que el haplotipo TCCG menor en HCT-116 y SW480. Curiosamente, cuando probamos los dos haplotipos en la línea celular RKO CRC, CGTG no fue significativamente más activo que el haplotipo TCCG, lo que indica que había alguna especificidad para fragmentar Una actividad incluso entre las líneas celulares de CRC. Ninguno de los dos haplotipos del fragmento A era activo en la línea celular no CRC HEK293 que sirvió como control negativo (Figura S1 A). Los fragmentos que contienen los haplotipos TCTC (9,5% de la población CEU) y CCTC (5,9% de la población CEU) demostraron que los niveles de actividad entre los haplotipos CGTG y TCCG (Figura S1B).
Movilidad electroforética cambio ensayos
para entender mejor estos efectos potenciadores específicos de alelo, el próximo investigó la unión a las secuencias que contienen cada uno de los 4 SNPs, rs6507874, rs6507875, rs8085824 y rs58920878 proteína nuclear. La hipótesis de que los factores de transcripción se unen selectivamente a los alelos C con mayor afinidad, como el fragmento de 2 kb y fragmentos A1-A4 con alelos C mostraron el mayor nivel de potenciador de la actividad. Por el contrario, las proteínas inhibidoras se pueden unir a la T o G alelos preferentemente para regular negativamente la actividad potenciador. Con este fin, 33 bp oligonucleótidos de doble cadena centradas en cada SNP, se sintetizaron. En cada caso, el alelo C se marcó con el colorante IR de color rojo (700). Los alelos alternativos, T o G se marcaron con tinte verde (800) IR (canales individuales se presentan como imágenes en blanco y negro en las figuras S2-S5 para facilitar la reproducción y análisis). Los extractos nucleares se prepararon a partir de células SW480 líneas, HCT-116 y RKO CRC y se incubaron con no específica y ADN competidor no marcado específico, como se indica en la figura 4. Los dos alelos de cada SNP se marcan con diferentes colores, lo que permite una comparación directa de la unión de cada alelo a las proteínas nucleares en la misma reacción. Como se muestra en la Figura 4, para probar cada sonda conjunto, hay bandas específicas para un alelo en comparación con el otro alelo.
(A) Nuclear extractos de SW480, HCT-116, y líneas de células RKO se incubaron con IR -dye 33mers etiquetados centradas en rs6507874 C (etiqueta roja) y T (etiquetas verdes) antes de la EMSA nativa. Los carriles 1 y 2 muestran la sonda sin extracto nuclear. Los carriles 3, 4, 9, 10, 15 y 16 muestran cada sonda marcada de unión a las proteínas nucleares individualmente con línea celular como se señaló anteriormente. Carriles 5-8, 11-14, y 17-20 son una competición 1:01 con sondas alelo etiquetados C y T. Los carriles 6, 12 y 18 contienen 200 veces competidor no marcado en exceso alelo C. Carriles 7, 13 y 19 contienen 200 veces en exceso no marcado competidor alelo T. Calles 8, 14 y 20 contienen 200 veces en exceso competidor de una secuencia de unmatching con contenido de nucleótidos similar. Bandas específicas para un alelo y perdidos en la competencia están marcados con flechas. Ver Figura S2 de color rojo de la imagen (700) de canal de la sonda C y el (800) del canal de la sonda T en blanco y negro verde para. (B) Como en el panel A, con el alelo rs6507875 C (sonda roja) y el alelo G (verde). Ver Figura S3 rojo de la imagen (700) de canal de la sonda C y el (800) del canal de la sonda G en blanco y negro verde para. (C) como en el panel A, con el alelo rs8085824 C (rojo) y el alelo T (verde). Ver Figura S4 rojo de la imagen (700) de canal de la sonda C y el (800) del canal de la sonda T en blanco y negro verde para. (D) Como en el panel A, con rs58920878 alelo C (rojo) y el alelo G (verde). Ver Figura S5 canal rojo (700) la imagen del canal de la sonda C y el verde para (800) de la sonda G en blanco y negro.
Para cada conjunto de alelo, carriles 3, 4, 9 , 10, 15 y 16 muestran una única sonda alelo se incubaron con el extracto nuclear. Carriles 5-8, 11-14, y 17-20 contienen las reacciones con 1:1 cantidades de cada alelo marcado. Para determinar la especificidad de los complejos cambiados, se añadieron los oligonucleótidos competitivos no marcados para cada alelo en exceso de 200 veces. Carriles 6, 12 y 18 contienen los alelos C no marcados y carriles 7, 13 y 19 contienen los alelos no marcados T o G. En los carriles 8, 14, y 20, un competidor no marcado de la composición base similar pero que no coincida con ninguna de las secuencias se añadió en una cantidad igual. Las bandas que desaparecieron cuando compitió con cualquiera SNP alelo, pero presente con el competidor no relacionado (no específica) se consideraron específico para la secuencia SNP. El más prominente de las bandas específicas se marcan en los márgenes con flechas.
En el caso de rs6507874 y rs58920878 (Figura 4A, 4D), había complejos que se encuentran en HCT-116 y SW480, que no se ve en la RKO. Esto puede explicar por qué la actividad específica de haplotipos no se observó en el experimento de la actividad luciferasa RKO. En las figuras 4A y S2, la banda marcada por la flecha era específico para la sonda alelo rs6507874 C. Tenga en cuenta que en HCT-116 y extractos RKO, incluso exceso de 200 veces del oligonucleótido no marcado alelo T no podría dejar fuera de competencia el alelo C para la unión. Para las sondas rs6507875 (Figura 4B y S3), mientras que hubo bandas específicas para los dos alelos (flechas), el alelo G atado con mayor afinidad que el alelo C. Curiosamente, las sondas rs6507875 se unió fuertemente a los componentes del extracto de RKO, incluso en presencia de un exceso de DNA no marcado (Figura 4B)
.
Para las sondas rs8085824, encontramos de nuevo varios complejos específicos para cada alelo. Un complejo prominente, marcada por la flecha inferior, mostró que la sonda alelo C no se outcompeted completamente con un exceso de 200 veces de la alelo T. Parece que las proteínas unidas de este complejo se encuentran en mayores cantidades en SW480 y HCT-116 de extractos nucleares RKO. En el caso de las sondas rs58920878, encontramos varias bandas específicas para el alelo C, mientras que el alelo G se encuentra predominantemente en los complejos más grandes (bandas superiores) que el alelo C.
La determinación de la identidad de estos de alelo se requerirá proteínas de unión específicas para entender completamente la acción del promotor de SMAD7. software de predicción de unión de proteínas Biobase Partido, basado en la base de datos TRANSFAC motivo, se utilizó para identificar candidatos para cada región SNP [24]. Los resultados de este análisis se presentan como las Tablas S1, S2 y S3 en S1 Archivo. La proteína de unión al ADN con la diferencia en las puntuaciones de la parte superior de unión previsto entre alelos para rs6507874 /rs6507875 (analizada en conjunto debido a la proximidad) era NF-1A, para rs8085824 fue Churchill, y por rs58920878 fue ZF5. Sin embargo, para cada locus, ninguna de las proteínas con las mayores diferencias alélicas predichos son las proteínas con el núcleo o matriz más altas puntuaciones para cada secuencia.
Análisis eQTL en el tejido normal de colon
A continuación preguntó si el genotipo en estos SNPs correlacionada con los niveles de expresión génica en tejidos de colon normales. A medida que el potenciador se encuentra en el intrón 4 de la
SMAD7
gen,
SMAD7
era un gen diana candidato obvio. Además de rs6507874, rs6507875 y rs8085824, también genotipo rs4939827 los tagSNP en muestras humanas normales patológicamente tejidos obtenidos a partir de la colonoscopia de seguimiento a través de la /folato Polyp Prevention Study aspirina [25] - [27]. No hemos podido diseñar un ensayo TaqMan para rs58920878, sin embargo rs8085824 SNP rs58920878 y están en perfecto LD (r
2 = 1, D '= 1); Por lo tanto, rs8085824 también representa un indicador de rs58920878. No hay correlación estadísticamente significativa entre la expresión de los otros dos genes dentro de 0,5 Mb de rs4939827,
CTIF
o
DYM
, y cualquiera de los SNPs genotipo se observó (datos no mostrados).
Se encontró que los rs4939827 tagSNP no mostraron una asociación estadísticamente significativa con
SMAD7
niveles de expresión, a pesar de una tendencia mayor expresión con el alelo T del riesgo GWAS (p = 0,1130) (Figura 5). Sin embargo, rs8085824 SNP C (menor) alelo demostraron una correlación estadísticamente significativa (
p = 0,01197
) con un aumento de
SMAD7
expresión. Dado que rs8085824 SNP rs58920878 y están en perfecto LD, este resultado se puede extrapolar a implicar una correlación entre rs58920878 alelo G (menor de edad) y mayores niveles de
SMAD7
expresión. El rs6507874 T (menor) alelo (p = 0,07531) y el alelo rs6507875 C (menor de edad) (
p = 0,1337
) no mostraron una correlación estadísticamente significativa con un aumento de
SMAD7
expresión. Tenga en cuenta que en general el haplotipo TCCG (haplotipo menor) correlacionado con una mayor
SMAD7
expresión en los tejidos y en los ensayos de luciferasa en el contexto de fragmentos de A1, A2, y A3, pero fue opuesto al efecto observado para el potenciador de la actividad de el fragmento de 2 kb en los experimentos de luciferasa en el que el fragmento que contiene el haplotipo TCCG (haplotipo menor) correlacionada con potenciador de la actividad reducida en comparación con el fragmento que contiene el haplotipo CGTC.
se midió
doble cambio (FC) de expresión en condiciones normales SMAD7 muestras de tejido de colon de colonoscopias de vigilancia. Se utilizó el análisis no paramétrico basado en rango para estimar el efecto de cada alelo menor extra para rs6507874, rs6507875, rs8085824, rs4939827 y (modelo aditivo) sobre la expresión génica de ajustar por sexo, edad y raza. Dos caras
p
-valores se obtuvieron a partir de una prueba de razón de verosimilitud. Entrar
2 (ΔΔCt) se representa como una función de los genotipos utilizando un diagrama de caja - superposición gráfica de puntos. Número de muestras se observa en cada genotipo. Una asociación estadísticamente significativa se encontró para rs8085824.
Se necesitan más estudios para determinar cómo este controles potenciador de múltiples componentes
SMAD7
la expresión génica durante el desarrollo y crecimiento de las células de colon, y para determinar si los componentes individuales del acto potenciador independientemente uno de otro.
Reglamento de la SMAD7 reforzador
a continuación, pretendemos determinar la relación entre la actividad y el promotor de la señalización de BMP /TGF. Como se ha mencionado en la introducción, SMAD7 actúa como un mediador clave del bucle de realimentación negativa, tanto para las vías de señalización TGF y BMP. Lo tanto, interesados para determinar si un potenciador era una parte de un circuito de retroalimentación, cada vez más activa en respuesta a cualquiera TGFß1 o BMP4 señalización. células SW480 HCT-116 y se privaron de suero durante la noche antes de 6 horas de tratamiento con 100 pmol TGFß1 o BMP4, y el fragmento de 2 kb A se utilizó para ensayar la actividad de luciferasa. Tras el tratamiento con TGFß1, fragmentos que contienen o bien el haplotipo CGTC (mayor) o el haplotipo TCCG (menor) demostró ningún cambio estadísticamente significativo en la actividad, ya sea en la línea celular (Figura 6A). En contraste, después del tratamiento con BMP4, potenciador de la actividad del fragmento que contiene la mayor haplotipo CGTC se aumentó 1,2 veces en las células HCT-116 y 1,5 veces en las células SW480 (Figura 6B). Un aumento de la actividad potenciadora también se observó con el fragmento que contiene el haplotipo menor TCCG en las células SW480 donde el tratamiento BMP condujo a un aumento de 1,4 veces en la actividad potenciador, pero no en células HCT-116 donde se observó ningún aumento significativo (
p
= 0,38) (Figura 6B). Debido a que los fragmentos de ADN que contienen los dos haplotipos fueron estimuladas por BMP4 en SW480 a una medida similar (cambio), postulamos que los 4 SNPs en el haplotipo de riesgo no interrumpen los componentes sensibles BMP reales del potenciador. Sin embargo, debido al déficit en la actividad con el haplotipo menor, después de la estimulación BMP4, el constructo de haplotipo TCCG todavía demuestra potenciador de la actividad más baja que el haplotipo CGTC sin estimulación BMP4 (Figura 6C). En total, estos datos implican el potenciador en un bucle de realimentación negativa en respuesta a la señalización de BMP pero no en el grupo de TGF de la cascada de señalización.
(A) potenciador de la actividad se midió por ensayo de luciferasa para el fragmento A contiene la principal (CGTC) y menor (TCCG) haplotipos en las células HCT-116 y SW480 privadas de suero se incubaron con TGFß1 durante 6 horas. Las muestras se representan como un cambio veces en la actividad con relación a células no tratadas en la misma placa. actividad (B) Mejorador fue estimulada por 6 horas de tratamiento BMP4 para el haplotipo CGTC en HCT-116 (
p = 4,14
× 10
-3) y las células SW480 (
p
= 1,22 × 10
-10). El haplotipo TCCG en el fragmento A muestra los niveles más bajos de estimulación, y sólo en SW480 (
p = 1,61
× 10
-6). (HCT-116
p = 0,38
). Efecto de la BMP se representa como factor de cambio sobre las muestras sin tratar para cada haplotipo en la misma placa. (C) Potenciador de la actividad de la comparación entre los haplotipos CGTG y TCCG siguientes BMP4 tratamiento. la actividad de luciferasa relativa se trazan para cada haplotipo en HCT-116 y SW480 utilizando el mismo conjunto de datos experimentales como (B).
Discusión
Recientemente, nuestro laboratorio y otros han empezado a tener en cuenta los efectos de múltiples variantes funcionales en desequilibrio de ligamiento (LD) que contribuyen al riesgo de enfermedad identificados a través de los GWAS en lugar de una sola variante funcional [28]. Por ejemplo, en 11q23.1 cromosoma, nuestro laboratorio identificó dos SNPs en LD (r
2 = 1) asociado con el riesgo de CCR, una en un promotor y una en un promotor bidireccional, que demostró una actividad específica de alelo y correlacionado con niveles de expresión de tres genes objetivos previamente no caracterizados [16].