Extracto
invasión de células de cáncer es el primer paso crítico de la metástasis, sin embargo, poco se sabe acerca de cómo las células cancerosas invaden e inician la metástasis en una matriz extracelular compleja. El uso de una línea celular de metástasis ósea del cáncer de próstata (PC3), analizamos cómo las células de próstata cancerosas migran en un Matrigel fisiológicamente relevante 3D. Se encontró que las células PC3 migraron de manera más eficiente como grupos multicelulares que las células individuales aisladas, lo que sugiere que la presencia de adhesión célula-célula mejora la migración de células 3D. La perturbación de la función N-cadherina mediante transfección de o bien el N-cadherina dominio citoplásmico o shRNA específico para N-cadherina abolió la migración celular colectiva. Curiosamente, las células PC3 no expresan α-catenina, una proteína de unión en el complejo cadherina actina. Cuando se reintrodujo el de larga duración α-catenina, el fenotipo de las células PC3 volvió de nuevo a un fenotipo epitelial más con una tasa de migración de las células disminuido en 3D Matrigel. Curiosamente, se encontró que la media N-terminal de α-catenina era suficiente para suprimir el fenotipo invasivo. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la formación de uniones N-cadherina promueve la migración de células 3D de células de cáncer de próstata, y esto se debe en parte a una regulación aberrante del complejo de N-cadherina en ausencia de α-catenina.
Visto: Cui Y, Yamada S (2013) N-cadherina dependientes de células Colectivo invasión de las células del cáncer de próstata es regulado por el extremo N-terminal de α-catenina. PLoS ONE 8 (1): e55069. doi: 10.1371 /journal.pone.0055069
Editor: Chih-Hsin Tang, de la Universidad Médica de China, Taiwán
Recibido: 12 Octubre, 2012; Aceptado: 24 Deciembre 2012; Publicado: 24 Enero, 2013
Derechos de Autor © 2013 Cui, Yamada. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por un Premio Beckman Investigador joven, el Premio Hellman Nueva Facultad de la familia, un NIH GM094798 EUREKA, y los fondos de la Universidad de Comité de Coordinación de Investigación del cáncer de California. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
invasión de células de cáncer es el primer paso crítico de la metástasis y la transición fenotípica de un tumor benigno a cáncer invasivo requiere cambios en el perfil de expresión génica. Para los cánceres epiteliales derivadas, esta transición epitelio-mesenquimal se inicia por factores de transcripción que regulan hacia abajo-supresores de tumores y hasta de regular oncogenes, y se cree que gobernar la metástasis del cáncer [1]. Los marcadores epiteliales y mesenquimales clave que definen los respectivos fenotipos son epiteliales (E) y neuronales (N) cadherinas, y este interruptor cadherina a menudo coincide con la transición de benigno a cánceres agresivos [2].
en varias cáncer células, la expresión anormal de N-cadherina se correlaciona con la inducción de la motilidad celular. Por ejemplo, la expresión de N-cadherina induce la migración celular en células de cáncer de mama [3] - [7], melanoma [8], cáncer de próstata [9], cáncer gástrico [10] y carcinoma escamoso [11]. Curiosamente, la sobreexpresión de N-cadherina aumenta la motilidad celular y la invasión sin disminuir los niveles de E-cadherina [4], lo que sugiere que el aumento de la motilidad celular se debe a la expresión de N-cadherina en lugar de una falta de E-cadherina. Por lo tanto, la estricta regulación de la expresión de la N-cadherina es esencial en la función normal de las células epiteliales. En consonancia con esta idea, la regulación de la N-cadherina por microRNA-145 se ha demostrado que suprimir la invasión y la metástasis en el cáncer gástrico [10].
Mientras que la función canónica de N-cadherina es establecer célula-célula la adhesión, la presencia de N-cadherina también induce la señalización pro-migratorio. El dominio extracelular de N-cadherina interactúa con FGF-receptor 1 [12], y esta interacción reduce al mínimo la internalización del receptor, prolongando de este modo la activación de MAPK-ERK [5], [6]. Además la migración de células, inducida por N-cadherina depende del nivel de Akt3 reducida y la activación en células de cáncer de mama [7]. En contraste, el papel de la adhesión célula-célula mediada por N-cadherina en la migración de células de cáncer no está claro. Si uniones N-cadherina funcionan de manera similar a los cruces E-cadherina mediante la estabilización de las interacciones célula-célula y la prevención de la migración celular (inhibición por contacto), a continuación, las uniones N-cadherina obstaculizarían la migración de células de cáncer. Por lo tanto, este tipo de uniones celulares serían contraproducentes para la N-cadherina inducida por señales pro-migratorias.
El uso de líneas celulares de cáncer de próstata como un sistema modelo, hemos tratado de analizar la forma de N-cadherina regula la invasión de las células cancerosas. En el cáncer de próstata, la expresión de N-cadherina se regula hacia arriba y la expresión de E-cadherina es el regulado [13], [14]. Un interruptor de cadherina similares también se asocia con recurrencia clínica [15], y se identificó en lesiones metastásicas [16]. Además, los niveles de N-cadherina aumentaron en los tumores resistentes a la castración en pacientes con metástasis establecidos [17]. Además, se observaron niveles elevados de N-cadherina en los tumores de próstata de alto grado en comparación con los tumores de grado bajo [18]. El tratamiento con un anticuerpo monoclonal reduce la proliferación, adhesión N-cadherina-específica y la invasión de células de cáncer de próstata
in vitro
, y se desaceleró el crecimiento de varios xenoinjertos establecidos, bloqueó la invasión y metástasis local y, a dosis más altas, dirigido para completar la regresión [9]. Tomados en conjunto, estos estudios ponen de relieve la relación entre la expresión de N-cadherina y la progresión del cáncer de próstata, sin embargo, el papel específico de uniones N-cadherina durante la invasión de células de cáncer se desconoce.
Los estudios anteriores se centraron en la migración de células de cáncer en una de dos dimensiones (2D) de sustrato, mientras que se sabe poco acerca de cómo próstata células cancerosas migran en una matriz fisiológicamente más relevantes en tres dimensiones (3D). Usando microscopía de lapso de tiempo, se encontró que en 3D Matrigel, el cáncer de próstata (PC3) las células migran en grupos multicelulares, y esto la migración celular colectiva de células PC3 se potencia en presencia de la adhesión célula-célula. células de cáncer de próstata que sobre-expresan la N-cadherina células dominio citoplásmico o N-cadherina desmontables no migran en una matriz 3D. Además, como las células PC3 carecen endógeno α-catenina, re-expresión de α-catenina promueve un fenotipo epitelial en una matriz 3D. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que las uniones N-cadherina promueven la migración celular colectiva 3D de las células de cáncer de próstata, en parte debido a la ausencia de α-catenina.
Resultados
migración celular colectiva es un único propiedad de las células PC3 en 3D matriz
a diferencia de los cubreobjetos 2D rígidos usados a menudo para estudiar la migración de las células cancerosas, 3D Matrigel proporciona una matriz blanda que mejor imita el microambiente tumoral. Se comparó el fenotipo migratorio de líneas celulares de cáncer de próstata (PC3, 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 y RWPE-2) en la matriz 3D. Sólo las células PC3 invadieron la matriz circundante de manera eficiente, mientras que las células 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 y RWPE-2 permanecieron redondo y forman grupos de células esféricas sin extensiones de membrana evidentes (Figura 1A). Curiosamente, en la matriz en 3D, las células PC3 migran solamente cuando está en contacto con las células vecinas (Figura 1A, puntas de flecha de punto blanco a las células no migratorias individuales). Además, las células PC3 eran altamente migratorias en la superficie del cubreobjetos recubiertos con Matrigel (Figura 1B, la película S1), sin embargo, las células no mantenían contactos célula-célula en la superficie 2D y células que migran pasado entre sí sin formar por células estables adhesiones celulares (Figura 1B).
(A) Morfología de las líneas celulares de cáncer de próstata en 3D Matrigel. células PC3 forma de racimo invasiva multicelular pero 22Rv1, las células LNCaP, RWPE-1 y RWPE-2 forman esferoides multicelulares y no son invasivos. Las puntas de flecha indican las células PC3 individuales, no migratorias. El panel derecho muestra inmunotransferencias de N-cadherina (NCAD), E-cadherina (cadE), α-catenina (α-gato) y la tubulina (tina) de líneas celulares de cáncer de próstata. (B) La migración de células en la superficie 2D. estrella roja y la flecha negro marcan por separado y realizar un seguimiento de dos células vecinas que pasa entre sí sin formar y mantener el contacto célula-célula. Tiempo en minutos. (C) imágenes lapso de tiempo de la migración celular colectiva de células PC3 en 3D Matrigel. Tiempo en horas. (D) trayectorias representativas (izquierda), la velocidad media (en el centro) y el desplazamiento de extremo a extremo (derecha) de las células individuales (N = 33) y clusters multicelulares (N = 43) en 3D Matrigel (**, P & lt; 0,01 ). (E) Además EDTA interrumpe interacciones célula-célula. Se añadió EDTA a una concentración final de 1,4 mM. Tiempo en minutos. (F) La inmunotinción para N-cadherina en células PC3 sembradas en 3D Matrigel. N-cadherina (clon 6G11) co-localiza con la actina (faloidina) en los contactos célula-célula. La flecha indica el contacto célula-célula. Todas las barras de escala son de 10 micras.
En 3D Matrigel, grupos de células PC3 alargadas migrado en una dirección persistente (Figura 1 C, D, Película S2), mientras que las células individuales migraron al azar con una velocidad media inferior y desplazamiento neto que las células individuales dentro de los grupos de células (Figura 1D). Estos datos sugieren que la migración celular colectiva de las células PC3 son únicos para la migración de células en 3D Matrigel, y la presencia de interacciones célula-célula pueden promover la migración de células eficiente (velocidad de células y la persistencia) en 3D Matrigel.
Las cadherinas son posibles reguladores de la migración celular colectiva
Dado que muchas proteínas de adhesión célula-célula son dependiente de calcio, que analizan la migración celular colectiva en 3D Matrigel en condiciones de bajos de calcio. Al quelantes de calcio con EDTA, las células PC3 en racimos alargados disociados de células vecinas en el transcurso de 30 minutos (Figura 1E, Película S3). Esto sugiere que las proteínas de adhesión dependientes de calcio (por ejemplo, cadherinas) son probablemente responsables de las interacciones célula-célula PC3. Curiosamente, las células PC3 expresaron superior N-cadherina y los niveles de E-cadherina más bajos en comparación con las líneas celulares de cáncer 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 y RWPE-2 de la próstata (Figura 1A). Además, sólo las células PC3 invadieron la matriz 3D mientras que las otras líneas celulares de cáncer de próstata no lo hicieron (Figura 1A). En 3D Matrigel, N-cadherina localiza en los contactos célula-célula de células PC3 (Figura 1F), lo que sugiere que la N-cadherina media interacciones célula-célula en la matriz 3D.
La inmunomarcación de N y E-cadherina reveló que la mayoría de las células PC3 eran N-cadherina positiva (Figura 2A), pero muy pocas células PC3 eran E-cadherina positiva (Figura 2A). Curiosamente, se observó que, mientras que la mayoría de las células PC3 migró colectivamente en 3D Matrigel, algunas células se mantuvieron en grupos de células esféricas. Nosotros sospechamos que las células PC3 no migratorias pueden estar expresando E-cadherina. Para evaluar con precisión el papel de ambos cadherinas en la migración celular 3D, se subclonaron células PC3 para aislar E-cadherina expresión de células PC3. De veintiún subclones generados PC3, la mayoría de los subclones tuvieron mayor o comparable nivel de N-cadherina a las células de los padres (véase la figura S1). Dos sub-clones se eligieron (PC3E y PC3n) para su expresión característica cadherina. PC3E tenía un nivel de expresión de E-cadherina más alto que tanto el PC3 de los padres y PC3n, mientras PC3n tenía un mayor nivel de expresión de N-cadherina (Figura 2B, C, S1). proteínas E y N de cadherina localizadas a los contactos célula-célula de PC3E y PC3n clones, respectivamente (Figura 2C). Además, el análisis de la expresión de cadherina reveló que el clon parental y PC3n también expresa un alto nivel de cadherina 11, mientras que PC3E expresa principalmente E y P-cadherina (Figura 2E). En 3D Matrigel, las células PC3E no migraron y se mantuvieron como agrupaciones esféricas (Figura 2D, la película S4). Por el contrario, PC3n tenía una morfología alargada y migra en una dirección persistente de manera similar a las células PC3 parentales (Figura 2D, Película S5). Estos datos sugieren que los niveles de expresión de E /P y N /11-cadherinas corresponden con el fenotipo esférica y alargada en la matriz en 3D, respectivamente.
Inmunotinción
(A) de N-cadherina con faloidina (panel superior) y e-cadherina con faloidina (panel inferior) de las células PC3 parentales chapada en cubreobjetos. (B) Dos subclones representativos de células PC3 parentales, PC3E y PC3n, se immunoblotted para E-cadherina y N-cadherina. Tubulina se muestra como control de carga. Las transferencias originales se muestran en la Figura complementario S1. (C) Inmuno-tinción de subclones PC3 para E-cadherina y N-cadherina (clon 32). (D) morfologías celulares, velocidad de células y la persistencia direccional de PC3E (N = 19) y PC3n (N = 20) clones en 3D Matrigel (**, P & lt; 0,01, n = 11 a 42). Todas las barras de escala son de 20 micras. (E) Mapa de calor del análisis de microarrays para todos los niveles de expresión de cadherina en PC3 los padres, las células PC3E y PC3n.
La expresión del dominio citoplásmico N-cadherina suprime la migración celular colectiva
Para analizar el papel de la N-cadherina en la migración celular colectiva, transfectadas N-cadherina dominio citoplásmico (N-cito), y se subclonaron los transfectantes estables con niveles crecientes de N-cito (Figura 3A). En presencia de N-cito, la expresión de N-cadherina endógena se había reducido regulado, mientras endógeno E-cadherina fue hasta reguladas (Figura 3B). el análisis de microarrays confirmó la disminución de la N-cadherina y aumentó perfil de expresión de E-cadherina en las células N-cito (Figura 3C), y más detallado reveló la sobre regulación de la P-cadherina (Figura 3C). Tanto E y P-cadherina también fueron hasta reguladas en el clon PC3E no migratorias (Figura 2E). Tomados en conjunto, estos datos demuestran que la regulación a la baja de los resultados de N-cadherina en la sobre regulación de ambos E y P-cadherinas en células PC3. Curiosamente, la cadherina 11 se había reducido regulado en una de las células que expresan cito-N (# 1), pero no en otros (# 4, la figura 3C).
(A) Representación esquemática de los de larga duración N -cadherin y la citoplasmática N-cadherina (N-cito) construye. N-cadherina dominio citoplásmico se fusiona con la membrana de dominio de dirección de Lyn quinasa (negro) en el extremo N-terminal y de dímero en tándem-tomate (rojo) en el extremo C-terminal. (B) Las inmunotransferencias de N-cadherina dominio extracelular (clon 8C11), N-cadherina dominio citoplásmico (clon 32), y E-cadherina (clon 36) en N-cito que expresan subclones de células PC3.#1,#2,#3,#4 son cuatro poblaciones de células N-cito con mayores niveles gradualmente N-cito. (C) Mapa de calor del análisis de microarrays para todos los niveles de cadherina en PC3, N-cito#1 y N-cito#4 células. (D) Immuno-tinción de dominio extracelular de N-cadherina (8C11 clon), con faloidina en células PC3 parentales (panel superior) y N-cito#4 células (panel inferior). localización de N-cito fue detectado por la señal tándem de tomate (panel inferior). La barra de escala 10 micras. (E) El análisis estadístico de N-cito expresar la migración celular PC3 3D. se muestran la velocidad media y la distancia de extremo a extremo (**, P & lt; 0,01; N = 42 para las células parentales y N = 11 para las células N-cito). Las barras de error son error estándar de la media. Barra de escala, 40 micras.
En lugar de una morfología poco organizado y elongatged sobre una superficie 2D, las células que expresan N-cito tenían más apretado contacto célula-célula que las células parentales. La inmunotinción para el dominio extracelular de N-cadherina detectado niveles bajos de endógeno N-cadherina que no se localiza en contactos célula-célula (Figura 3D). En 3D Matrigel, tanto N-cito#1 y#4 células formadas agrupaciones esféricas y no eran invasiva (Figura 3E, Película S6). Aunque estos dos clones que expresan N-cito compartían el mismo fenotipo no invasiva en 3D Matrigel, que tienen distintos niveles de cadherina 11, lo que sugiere que la expresión de cadherina 11 es independiente del fenotipo migración de células PC3 y el comportamiento en 3D Matrigel.
el silenciamiento N-cadherina suprime la migración de células en 3D Matrigel
a fin de determinar si la N-cadherina es el principal regulador de la migración celular 3D, que de forma estable silenciados N-cadherina en células PC3. De las tres secuencias de N-cadherina específicos shRNA probados y 44 clones transfectados analizados, se muestran dos clones con 50% (KD1) y la reducción de 99% (KD2) endógena de N-cadherina. El grupo de control con las correspondientes secuencias revueltos (SCR1, SCR2) mostró niveles de N-cadherina similares a las células PC3 parentales (Figura 4A, B). se observó residual endógena N-cadherina en células KD1, pero no en células KD2 (Figura 4B). Por otra parte, el silenciamiento de N-cadherina no cambió E-cadherina y cadherina 11 niveles en las células KD1 y KD2 (Figura 4A).
(A) inmunotransferencias de N-cadherina, E-cadherina y cadherina N 11 en -cadherin células y desmontables células transfectadas con secuencias revueltos. Tubulina se muestra como control de carga. KD1, KD2 son dos clones desmontables. SCR1, SCR2 son dos clones transfectados con secuencias revueltos correspondiente. (B) La inmunotinción de N-cadherina en células de control (panel superior) y desmontables células (panel inferior). (C) Cell la formación de agregados de desmontables células y células de control de más de 3 horas en suspensión. En horas 0, 1, 2, 3 en suspensión, el número de agregados celulares analizadas fueron 144, 101, 133, 62 para células PC3 parentales, 147, 117, 107, 81 para células de KD1, 142, 121, 107, 73 para células KD2, 146, 115, 87, 88 para las células SCR1, 131, 147, 107, 68 para las células SCR2, respectivamente. análisis de la migración (D) de células 3D de los padres (N = 17), scramble shRNA (N = 17 para SCR1, N = 20 para SCR2) y desmontables células (N = 37 para KD1, N = 33 para KD2). se muestra el análisis estadístico de velocidad media (**, P & lt; 0,01). Todas las barras de error son error estándar de la media. Todas las barras de escala son 20 micras.
A pesar de la disminución del nivel de N-cadherina, la célula desmontables células todavía formado agregados similares en tamaño que las células PC3 parentales en suspensión (Figura 4C), lo que sugiere que la presencia de otras cadherinas, por ejemplo, cadherina 11, puede ser suficiente para la formación de contactos de célula-célula. Sin embargo, en 3D Matrigel, la parte desmontables células (KD1) alargadas de manera similar a las células de los padres, pero se formaron grupos de células mucho más flexible (Figura 4D). Las células completa desmontables (KD2) se mantuvo redonda con extensiones de membrana mínimos en 3D Matrigel (Figura 4D). A diferencia de las células parentales shRNA transfectadas o revueltos, estas células no se desarrollaron grandes grupos de células alargadas (Figura 4D).
En 3D Matrigel, las dos líneas celulares de derribo no migran más rápido que el de sus padres o revueltos transfectaron shRNA Células. Mientras que las células migran KD1 con una reducción del 50% en la velocidad, las células KD2 eran casi inmóvil (Figura 4D, Película S7). Estos datos sugieren que, en 3D Matrigel, N-cadherina regula tanto la morfología y el desarrollo de grupos de células alargada, además de la migración celular.
Expresión de α-catenina vuelve células PC3 a la normalidad epitelial fenotipo
las cadherinas juegan un papel crítico en la formación y el mantenimiento de fuertes adherencias célula-célula y requieren el apoyo del citoesqueleto de actina subyacente para mantener contactos célula-célula. Un miembro clave del complejo cadherina, α-catenina, contiene un dominio de unión en el extremo C-terminal de la actina. Curiosamente, a diferencia 22Rv1 o LNCaP células, las células PC3 no expresan α-catenina (Figura 1A, 5A). Para entender cómo la expresión α-catenina afecta a la migración de células dependiente colectiva N-cadherina, que transfectadas establemente GFP-etiquetados α-catenina en células PC3 (Figura 5A, B). Las células GFP-α-catenina que expresan tuvieron un ligero aumento en el nivel de N-cadherina y un ligero descenso en el nivel de E-cadherina en comparación con las células parentales (figura 5A). Curiosamente, la α-catenina células que expresan formado contactos célula-célula más estrictos en grupos de células más compactas en comparación con las células parentales, alargados poco organizadas en la superficie 2D (Figura 5B). Además, la GFP etiquetada α-catenina localizada a los contactos célula-célula (Figura 5B), y co-localizada con N-cadherina (Figura 5C).
(A) inmunotransferencias para α-catenina, N-cadherina y e-cadherina en α-catenina que expresan las células. Tubulina se muestra como control de carga. LNCaP se utilizó como control positivo para la α-catenina y E-cadherina. (B) La localización de α-catenina en las células PC3 parentales y células que expresan GFP-etiquetados α-catenina en los paneles inferiores. (C) La colocalización de GFP-etiquetados α-catenina con N-cadherina. análisis (D) la agregación celular de las células parentales y α-catenina expresar en suspensión. Recuadro: puntos de vista de los grupos de células agrandado. GFP señal se superpone la imagen de campo brillante en de α-catenina GFP-etiquetados células que expresan. El tamaño promedio de agregación en cada tiempos se muestran en el gráfico de barras. análisis (E) La migración de células en 3D Matrigel. GFP canal de GFP-etiquetados α-catenina en las células de la caja blanca (panel inferior izquierdo) que expresa se muestra en el panel inferior derecho. se muestra el análisis estadístico de la velocidad de migración de células (**, P & lt; 0,01; N = 35 para las células parentales, N = 31 para las células que expresan GFP-α-catenina). Todas las barras de escala son de 20 micras.
En la suspensión, α-catenina agregados celulares que expresan eran comparables en tamaño a las células PC3 parentales (Figura 5D). Sin embargo, los contactos célula-célula de α-catenina células que expresan eran mucho más apretado sin límites célula-célula obvias que los agregados de células PC3 parentales más flexibles (Figura 5D). La compactación de los agregados de células en α-catenina células que expresan sugiere que la N-cadherina adhesión célula-célula mediada probablemente está reforzada por la presencia de α-catenina.
A pesar de la capacidad de formar adhesión célula-célula en suspensión ( Figura 5D), las células que expresan PC3 α-catenina no alargado para formar grandes grupos de células en 3D Matrigel al igual que las células PC3 parentales. Estas células se mantuvieron como células individuales o pequeños grupos con una ronda más morfología (Figura 5E). En 3D Matrigel, α-catenina localiza en los contactos célula-célula de pequeños grupos de células (Figura 5E). En consonancia con esta morfología, las células α-catenina no eran móviles en 3D Matrigel (Figura 5E, Película S8). Estos resultados sugieren que la expresión α-catenina fortaleció N-cadherina adhesión célula-célula mediada e impidió la migración de células en 3D Matrigel, y que la baja regulación de α-catenina puede ser un paso importante en la metástasis del cáncer de próstata.
la construcción de la mitad N-terminal de α-catenina es suficiente para suprimir el fenotipo invasivo
para probar las funciones de α-catenina en la regulación de la adhesión célula-célula, truncamos progresivamente α-catenina (Figura 6A) y transfectadas establemente células PC3. El C-terminal de α-catenina se compone de unión vinculina dominio inhibitorio (AA 509 a 633), y dominio de unión a actina (AA 697 a 906), que requiere el extremo corto C-terminal (AA 848 a 906) para la unión de actina [ ,,,0],19]. La larga duración α-catenina y los mutantes truncados fueron comparables en sus niveles de expresión (Figura 6B, S2), y la expresión de los mutantes truncados no cambió el perfil de expresión de cadherina (Figura 6B). Mientras que todos los mutantes truncados localizados en los sitios de adhesión célula-célula (Figura 6C), el mutante truncado células que expresan formó más flexibles grupos de células que la de longitud completa α-catenina células sobre una superficie 2D (Figura 6C) que expresa. Curiosamente, los mutantes de truncamiento α-catenina 1-509 y 1-848 α-catenina que expresan las células formaron agrupaciones relativamente compactos de alfa-catenina 1-670 células que expresan sobre una superficie 2D (Figura 6C).
(A ) Esquema de larga duración α-catenina y sus mutantes truncados C-terminal. etiqueta GFP, unión Vinculina (Vin), su inhibitoria (Inhibición), se muestran F-actina (actina) dominios. (B) Las inmunotransferencias de α-catenina, N-cadherina y E-cadherina en diversas células que expresan α-catenina. Tubulina se muestra como control de carga. 22Rv1 se utilizó como control positivo para la α-catenina y E-cadherina. Las transferencias originales se muestran en la Figura suplementaria S2. (C) La morfología celular (panel superior) y la localización de la α-catenina (panel inferior) en diversas células PC3 que expresan α-catenina. análisis (D), la agregación de células de varias células que expresan α-catenina de los padres, y 10 M citocalasina D (CD) células tratadas. Recuadro: puntos de vista de los grupos de células agrandado. GFP señal se superpone la imagen de campo brillante en las células que expresan GFP-etiquetados α-catenina /truncamiento mutantes. tamaño de la agregación de las células en cada punto de tiempo se muestran en la media ± error estándar de la media; se utilizó el análisis de ANOVA combinado con la prueba post hoc de Tukey HSD entre los grupos en hora punto de tiempo 3 (**, P & lt; 0,01). (E) analiza la migración celular en 3D Matrigel para los padres (N = 35), los de larga duración α-catenina (N = 31), α-catenina 1-509 (N = 73), α-catenina 1-670 (N = 39), y α-catenina 1-848 (N = 52) las células que expresan. La velocidad media y la distancia de punto final de la migración se muestran en la media ± error estándar de la media; Se han usado ANOVA y prueba post hoc de Tukey HSD (***, P & lt; 0,001). Todas las barras de escala son 20 micras.
Los fenotipos morfológicos en una superficie 2D fueron consistentes con los resultados del análisis de la agregación de células en suspensión. Mientras que las células que expresan mutantes truncadas forman agregados celulares comparable en tamaño con el de las células de cuerpo entero de los padres y α-catenina que expresan, los agregados celulares mostraron diferentes fenotipos (Figura 6D). Similares a los de larga duración α-catenina, las células que expresan α-catenina 1-509 células que expresan formaron contacto célula-célula apretado sin límites de las celdas evidente (Figura 6D), lo que sugiere que el N-terminal de α-catenina es esencial para este apretado adhesión célula-célula. Esto es consistente con el mutante α-catenina que carecen del extremo C-terminal esencial para la unión (1-848) también eran capaces de inducir grupos de células cerradas, aunque racimos más flojas que las células de longitud completa α-catenina que expresan actina (Figura 6D ). Tenga en cuenta que la organización de actina es todavía esencial para la formación de adhesión célula-célula como la formación de agregación de células tratamiento citocalasina eliminado (Figura 6D). Sorprendentemente, célula suelta sin embargo, α-catenina 1-670 células que expresan forman agregados similares a la de las células parentales (Figura 6D).
Desde el mutante α-catenina que carecen del extremo C-terminal esencial para la actina de unión (1-848) forma grupos de células relativamente estrechos (Figura 6D), la actina vinculante directa por α-catenina tiene un papel menor en la regulación de la adhesión célula-célula. Además, nuestros datos sugieren que, en ausencia de dominio de unión a actina (AA 697 a 906), el dominio de unión inhibidora vinculina-suprime la capacidad de formar uniones célula-célula ajustados, lo que es consistente con la noción de que se requiere vinculina para el fortalecimiento de la adhesión célula-célula [20], [21]. En apoyo de este modelo, se observó la contratación mínima vinculina a lo largo de los contactos célula-célula de α-catenina 1-670 células que expresan (Figura S3).
A pesar de los diferentes fenotipos en suspensión, todo mutante truncado células que expresan obtuvo similares la morfología del epitelio a la de plena longitud α-catenina en las células 3D Matrigel (Figura 6E) que expresa. Las células mutantes que expresan α-catenina se mantuvieron como células individuales o agrupaciones formadas con pequeñas extensiones de membrana mínimos, y no eran móviles en 3D Matrigel (Figura 6E). Aunque estas células mutantes que expresan-catenina alpha tienen diferentes niveles de adherencias célula-célula (Figura 6D), la expresión de N-terminal un medio de α-catenina fue suficiente para minimizar la invasión de células en 3D Matrigel, sugiriendo que invasividad de las células se determina por las interacciones de proteínas en la mitad N-terminal de α-catenina (por ejemplo, ß-catenina).
Discusión
estudios anteriores demostraron que la N-cadherina induce la señalización pro-migratoria mediante la interacción directa con FGF receptores en el dominio extracelular [5], se activa la vía de señalización MAPK /ERK [5], [6], y suprime Akt3 señalización [7]. Sin embargo, el papel de la adhesión célula-célula mediada por N-cadherina en la invasión de células de cáncer de próstata no ha sido explorado. Nuestros datos sugieren que la presencia de adhesión célula-célula mediada por N-cadherina promueve la migración celular eficiente mediante el aumento de la velocidad de células en una ruta migratoria persistente en 3D Matrigel.
Esta migración celular colectiva de células PC3 es una migración único fenotipo solamente se muestra en una matriz 3D. Mientras que la N-cadherina localiza en contacto célula-célula de células PC3 sembradas en placas sobre una superficie 2D (Figura 2A, 3D y 4B), estas células no mantienen contactos célula-célula estables y migran como células individuales (Figura 1B). Dado que la expresión de moléculas de señalización clave son diferentes en 2D vs entorno 3D [22], tales factores pueden alterar la adhesión célula-célula y el fenotipo de la migración. Alternativamente, la diferencia en 2D adhesión célula-célula 3D vs puede ser el resultado de la elasticidad de la matriz. Por ejemplo, a diferencia de en la matriz en 3D, dos en contacto las células que se mueven en una dirección opuesta a menudo pueden perturbar mecánicamente adherencias célula-célula en una superficie 2D. Esto es porque el sustrato rígido 2D proporciona una mejor tracción que la matriz 3D suave. El fenotipo de migración diferente en la matriz 3D sugiere que las uniones N-cadherina pueden desempeñar un papel importante en la invasión de células de cáncer de próstata
in vivo
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A diferencia de las adherencias célula-célula E-cadherina mediada que impiden la migración de células (inhibición de contacto, ver 22Rv1, LNCaP y RWPE en la Figura 1A), las adherencias célula-célula mediada por N-cadherina promover la migración celular colectiva. Una característica única de la adhesión N-cadherina es suprimir protuberancias de la membrana al azar de células de seguidor de modo que sólo las células líder pueden extender los bordes de ataque. Esta inhibición por contacto local mantiene la polaridad celular con un borde de ataque distinto para la migración celular; por lo tanto, asegurar la persistencia de la migración celular colectiva. adhesión célula-célula mediada por cadherina se ha demostrado para generar la morfología celular polarizada en en las células de Xenopus mesendoderm [23] y las células epiteliales transformadas en una matriz 3D [24]. uniones N-cadherina en las células cancerosas epiteliales derivadas proporcionan una señal de polarización esencial para la migración celular direccional en una matriz 3D.
Curiosamente, la cadherina 11, una cadherina tipo II, es también hasta reguladas en el clon altamente invasivo de células PC3 (PC3n, la figura 2E), y puede ser responsable de la formación de adherencias célula-célula en las células deficientes en N-cadherina (Figura 4C). Este cadherina 11 se piensa sobre regulación para promover las interacciones celulares entre las células cancerosas y la cadherina 11 osteoblastos expresan que es típico de la metástasis ósea [25] - [27]. Estudios previos han informado de que la expresión de cadherina 11 shRNA disminuye la migración celular de las células PC3 [26]. Sin embargo, la presencia de cadherina 11 por sí sola no es suficiente para la migración celular en 3D. Por ejemplo, N-cadherina deficiente pero cadherina 11 células que expresan no son migratorias en una matriz 3D (véase la Figura 4). Por lo tanto, la expresión de ambos N-cadherina y cadherina 11 o las interacciones potenciales entre estas dos distintas cadherinas puede ser esencial para la migración de células de cáncer de próstata.
El interruptor de cadherina E-a-N observada en las células PC3 es comúnmente observado en varios tipos de cáncer [2]. A menudo, las células cancerosas regulan por disminución cadherinas expresadas normalmente (E-cadherina en el caso de la próstata), y hasta de regular cadherinas mesenquimales (por ejemplo, N-cadherina, cadherina 11 etc).