Extracto
La infección por micoplasma en humanos y su contaminación en cultivos celulares son problemas en todo el mundo. Los fármacos actualmente disponibles para prevenir o tratar la infección por micoplasma sufren de baja sensibilidad, resistencia fuerte y alta toxicidad. Nuestro trabajo previo mostró que
Mycoplasma hyorhinis gratis (
M
.
hyorhinis
) la infección fue mediado por la interacción entre p37 de
M
.
hyorhinis Opiniones y Anexina A2 (ANXA2) de las células huésped, sin embargo el valor de traslación de este mecanismo era desconocido. En esto, se sintetizó la N-terminal de polipéptido ANXA2 (A2PP) y se encontró que A2PP podría disminuir la infección de
M
.
hyorhinis
de células de cáncer gástrico y el bloque
M
.
hyorhinis
la infección inducida por la migración celular. Por otra parte, se encontró que A2PP podría reducir
M
.
hyorhinis
contaminación de las células de paso. Además, en comparación con los antibióticos comerciales utilizados comúnmente en el cultivo celular para evitar
M
.
infección hyorhinis
, A2PP han demostrado una mayor eficacia, pero una baja toxicidad sobre el crecimiento celular. Por lo tanto, nuestro estudio por primera vez reveló el potencial de A2PP para el tratamiento y la prevención de
M
.
hyorhinis
infección
Visto:. Yuan S, P. L, Shou C (2016) N-terminal del polipéptido de la anexina A2 Disminuciones La infección de
Mycoplasma hyorhinis
de células de cáncer gástrico . PLoS ONE 11 (1): e0147776. doi: 10.1371 /journal.pone.0147776
Editor: Gernot Zissel, UNIVERSITÄTSKLINIKUM Freiburg, Alemania |
Recibido: 16 de octubre de 2015; Aceptó 7 de enero de 2016; Publicado: 26 Enero 2016
Derechos de Autor © 2016 Yuan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel. los datos de microarrays se ha depositado en el NCBI la Expresión Génica Omnibus (GEO) (no.GSE73777 adhesión)
Financiación:. Financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81572532). http://www.nsfc.gov.cn/publish/portal1/. SCC recibió la financiación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
micoplasmas patógenos, como Mycoplasma pneumoniae (
M
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pneumoniae
), Mycoplasma hyorhinis (
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hyorhinis
), oral micoplasma (
M
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orale
) y Mycoplasma genitalium (
M
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genitalium
), pertenecen a la clase mollicutes, que es el más pequeño microorganismo vivo en la naturaleza y puede duplicar independientemente [1-2]. Muchos estudios demostraron que la infección con estos micoplasmas se asoció con el desarrollo de tumores [3-8].
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orale ¿Qué causa anomalía cromosómica en células diploides humanas e induce la transformación celular [6]. La infección por
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hyorhinis
o
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genitalium
podría aumentar la migración y la invasión de las células epiteliales de la próstata [3].
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hyorhinis
infección se ha relacionado con la artritis, serositis, infertilidad y cáncer de humano [9-12].
Además, la contaminación por micoplasmas en el cultivo celular es un problema grave y la tasa de células de paso infectado por micoplasma es alta. Cultivo de células es ampliamente utilizado en ciencias de la vida, como en la investigación básica, la investigación de ensayos clínicos, desarrollo y producción de productos biológicos, así como en el campo de la producción biofarmacéutica y la vacuna. La prevención de las células de la contaminación microbiana es crítico para asegurar la calidad de la investigación. La contaminación por micoplasma es el problema más común en el cultivo celular con una incidencia de 30% -60% [1]. Se demostró que cuatro especies de micoplasmas representan más del 95% de infección en cultivo de células, incluyendo
M
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orale
, micoplasma arginina (
M
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arginini
),
M
.
hyorhinis
, y Levin de ninguna Acholeplasma (
Un
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laidlawii
) [13,14,15,16]. A causa de pequeño tamaño, micoplasma es apenas que se encuentran bajo el microscopio óptico y es fácilmente ignorada por los investigadores. En los últimos años, numerosos antibióticos utilizados para el tratamiento micoplasma resultaron en varias ocasiones en la aparición de resistencia micoplasma. Por estas razones, es imperativo desarrollar nuevos agentes para prevenir o disminuir la infección por micoplasma.
Nuestro trabajo previo mostró que
M
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infección hyorhinis
depende de la interacción de p37 (proteína principal de la membrana de
M
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hyorhinis
) y ANXA2 host a través de sus dominios N-terminal. También encontramos anticuerpo policlonal de p37 podrían bloquear la infección de
M
.
hyorhinis Opiniones y descenso
M
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hyorhinis
-promoted migración de células de cáncer gástrico [17]. Sobre la base de estos descubrimientos, hemos planteado la hipótesis de que el péptido, sintetizó de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la ANXA2 N-terminal de la región (de 1
er al 30
º aa, aquí hemos llamado a este péptido como A2PP), podría bloquear
M
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hyorhinis
la infección a través de su competencia con ANXA2 y, posiblemente, ser utilizado como un medicamento para la prevención de
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hyorhinis
infección en cultivo celular. En este estudio, hemos probado esta hipótesis y también compararon los efectos de A2PP con otros fármacos en la prevención de
M
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hyorhinis
infección.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
AGS línea celular de cáncer gástrico era de la American Type Culture Collection (ATCC). BGC823 línea celular de cáncer gástrico fue establecido por el Hospital Popular de la Universidad de Pekín de y se adquirió de la célula Centro de Cultura de la Academia China de Ciencias Médicas (Pekín, China). AGS y BGC823 células se cultivaron en suero RPMI-1640 suplementado 10% de ternera fetal obtenido de Invitrogen (Carlssbab, CA, EE.UU.). Mycoplasma prueba se llevó a cabo antes de cada nuevo experimento mediante amplificación por PCR de
M
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hyorhinis p37
.
Mycoplasma Propagación y Co-Cultura y
propagación Micoplasma y co-cultivo se llevó a cabo como se informó anteriormente [17,18,19].
Los anticuerpos y reactivos
El anticuerpo monoclonal anti-p37 PD4 se generó y caracterizó anteriormente [5,20,21]. anticuerpo anti-p37 policlonal se obtuvo de la inmunización de conejo con proteína de fusión GST-p37 siguiendo el protocolo estándar. Anti-EGFR y anti-fosfo-EGFR fue adquirido de Señalización Celular Tecnología (CCT, EE.UU.). Anti-ANXA2 era de Novus Biotecnología (Novus Biotecnología, EE.UU.). Anti-fosfo-ANXA2 era de Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE.UU.). A2PP (1
er al 30
º aa) y diversos péptidos A2PP truncadas, incluyendo A2PP-Cd4 (5
al 30
º bis), A2PP-ND8 (9
ª a 30
º bis), A2PP-ND12 (13
er al 30
º bis), A2PP-ND16 (17
al 30
º bis), A2PP-CD4 (1
er al 26
º bis), A2PP-CD8 (1
er al 22
nd aa), A2PP-Cd12 (1
er al 18
º bis), A2PP- CD16 (1
er al 14
º bis), junto con el control de péptidos aleatorios (CONP) fueron sintetizados por Sbsbio (Pekín, china). Los antimicrobianos micoplasma I (MYCO I) y II micoplasma (MYCO II) fueron adquiridos de M & amp; C sobre tecnología genética (Pekín, China). Ciprofloxacina (CIP) fue de Double-Crane Pharm (Pekín, China).
Detección de
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hyorhinis fotos: por PCR cuantitativa (qPCR)
Se extrajo ADN de AGS o BGC823 células después de
M
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hyorhinis
infección por tampón de lisis de ADN (50 mM Tris pH 8,5, EDTA 1 mM, 0,5% de Tween-20, y 200 mg /L de proteinasa K) de acuerdo con el protocolo estándar. qPCR se realizó con 30 ng de ADN y SYBR Green PCR en tiempo real 2 × kit de premezcla (Takara, Otsu, Japón) usando la Etapa Uno de los sistemas de ABI (Foster City, CA, EE.UU.). Los programas de reacción y
p37
cebadores específicos de (adelante: 5'-TATCTCATTGACCTTGACTAAC-3 ': 5'-3-ATTTTCGCCAATAGCATTTG inversa') se informó anteriormente [22]. Para comparar los
M
.
hyorhinis
niveles de ADN en las células,
GAPDH gratis (hacia adelante: 5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 ', inversa: 5'-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3') se amplificó como control y se analizaron los datos utilizando el 2
-ΔΔCt método. Los cebadores fueron sintetizados por Sangon (Shanghai, China).
Western Blotting
Las células se recogieron a partir de placa de cultivo con 2 x tampón de carga de SDS. electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y transferencia Western se realizaron como se describe anteriormente [23].
Cell ELISA
96 pocillos se sembraron con células (1 × 10
4 /también), seguido por tratamiento de los péptidos indicados y la infección de
M
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hyorhinis
durante 24 horas. Las células se inmovilizaron con un 0,05% de glutaraldehído durante 10 minutos, después se ELISA de células se realizó como se ha descrito anteriormente [24].
fase sólida Ensayo de unión y desplegables Ensayo
recombinante GST-p37 y proteínas GST se generaron y purificado como se describe anteriormente [17]. GST-p37 y GST se diluyeron en tampón (0,1 M Na
2CO
3, 0,1 M NaHCO
3, PH 9,6) y se recubrió en placas de 96 pocillos a 4 ° C durante la noche. Las placas se lavaron por PBS tres veces y se bloquearon por 5% de leche desnatada /PBS a temperatura ambiente (RT) durante 2 hr. Después de lavar con PBS, se añadió indicaron concentraciones de A2PP conjugado con biotina (sintetizado por Sbsbio) y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 hr. Después de lavar con PBST 3 veces, HRP conjugada con estreptavidina (Baltimore Pike, West Grove, PA, EE.UU.) y se incubó a TA durante 30 min. Después del desarrollo de color con Ortho-fenilendiamina (Sigma), la densidad óptica a 490 nm (OD490) se registró con un lector de microplacas (Bio-rad 550). Para desplegable ensayo, GST-p37 o GST proteína de 100 ng fue co-incubadas con 20 mu M biotina-A2PP y estreptavidina perlas (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EE.UU.) en tampón de unión (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, 150 NaCl mM, 0,5% NP-40, DTT 0,5 mM, PMSF 1 mM, y 1 x inhibidores de la proteasa completos) a 4 ° C durante la noche. Los precipitados se lavaron con tampón de unión de cuatro tiempos y se analizaron por Western Blot.
Co-inmunoprecipitación
M
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hyorhinis
células infectadas (BGC823 o AGS) se homogeneizaron en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, DTT 0,5 mM, PMSF 1 mM, y 1 × inhibidores de la proteasa completos) a 4 ° C durante 10 min. Después de 12, 000 g de la centrifugación durante 10 min a 4 ° C, se recuperaron los sobrenadantes. Proteína lisados (500 mg) se incubaron con 20 mM A2PP o CONP, 1 g anti-ANXA2 más proteína G sefarosa perlas (GE Healthcare) a 4 ° C durante la noche. IgG preinmune (1 g) se utilizó como control. perlas de precipitados se lavaron con tampón de lisis cuatro veces, se eluyó en 2 x tampón de carga, hervidas, y se analizaron por transferencia Western.
ensayo de inmunofluorescencia
Las células se sembraron en cubreobjetos y cultivadas durante la noche. El día siguiente, las células se trataron con péptidos indicados y se infectaron con
M
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hyorhinis
durante 24 horas. Luego, las células se lavaron con PBS enfriado en hielo para tres veces, fijadas en paraformaldehído al 4% durante 15 min a RT. Después de bloquear durante 1 hora en 5% de BSA /PBS, las células se incubaron con anticuerpos indicados a temperatura ambiente durante 1 hr. A continuación, las células se lavaron 3 veces de nuevo con PBST y se incubaron con anticuerpos secundarios FITC o TRITC marcado durante 30 minutos a RT. Después del lavado con PBS y la contratinción con DAPI, las células se montaron en glicerol al 50% /PBS. Se utilizó un microscopio confocal Zeiss LSM780 (Zeiss, Oberkochen Microsystems, Alemania) para observar la localización de las proteínas indicadas.
cámara de Migración Celular Ensayo
Transwell de 8.0 micras de poro membranas (Corning, Nueva York, EE.UU.) se utilizó en el ensayo de migración celular. La cámara inferior se llenó con 800 l de medio que contenía FBS al 10% como quimioatrayente. Las células se volvieron a suspender en medio libre de suero que contiene
M
.
hyorhinis
más A2PP o CONP, a continuación, se transfirieron cuidadosamente en la cámara superior de cada aparato Transwell a una densidad de 2 × 10
5 células /ml (120 l /cámara). Las células fueron autorizados a emigrar durante 24 horas a 37 ° C. La superficie superior de cada membrana se limpió de células con un hisopo de algodón. Las células penetrado en el lado inferior de la membrana se fijaron en metanol frío, se tiñeron con 0,1% de cristal violeta, y se contaron en nueve campos microscópicos seleccionados al azar por pocillo. Cada muestra se preparó en cámaras triplicado y cada experimento se repitió durante al menos 3 veces.
Ensayo de proliferación celular
células de cáncer gástrico se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 5 × 10
3/100 l /pocillo por triplicado, y fueron tratados con reactivos indicados. La proliferación de células fueron cuantificados por la confluencia de células con un CloneSelect Imager (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.).
análisis de microarrays y en tiempo real RT-PCR
AGS y células (BGC823 1 × 10
6 por 10 cm
2 placa) fueron tratados con A2PP, CIP, MYCO I y II MYCO durante 24 horas, se lavaron con PBS, y se cosecha en el reactivo Trizol. Las muestras de ARN se examinaron en OE Biotecnología (Shanghai, China) mediante el uso de Affymetrix GeneChip
® PrimeView
™ matriz de expresión de genes humanos. los datos de microarrays se ha depositado en el NCBI la Expresión Génica Omnibus (GEO) (no.GSE73777 adhesión). Los datos en bruto se registró mediante el uso de Affymetrix GeneChip consola de comandos (versión 4.0, Affymetrix). A continuación, el software Genespring (versión 12.5, Agilent Technologies) fue empleado para terminar el análisis básico con los datos en bruto. Para empezar, los datos en bruto se normalizó con el algoritmo de RMA. los genes expresados diferencialmente fueron identificados a través cambio veces. El umbral establecido para los genes regulados hacia arriba y hacia abajo, era un factor de cambio ≥ 2,0. Posteriormente, GO y se aplicaron KEGG análisis para seleccionar a cabo los genes que se relacionan con el ciclo celular y la apoptosis celular. Real-time RT-PCR se utilizó para validar los resultados de microarrays y lleva a cabo según las instrucciones de los fabricantes (SYBR, TOYOBO). Los niveles de expresión de genes relacionados se normalizaron a través de
GAPDH
y el 2
-ΔΔCT se utilizó para calcular la expresión génica relativa. Los cebadores para tiempo real RT-PCR (
ATF
, adelante, 5'-GAGTGGCGACAGGATAGAGC-3 ', inversa, 5'-TTTAGCCTCCCTCCCTTAGC-3';
DDIT3
, hacia adelante, 5 ' -GCGCATGAAGGAGAAAGAAC-3 ', inversa, 5'-ACCATTCGGTCAATCAGAGC-3';
CEBPB
, adelante, 5'-AGCGACGAGTACAAGATCCG-3 ', inversa, 5'-AGCTGCTCCACCTTCTTCTG-3') fueron sintetizados por Sangon
Análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Las diferencias fueron analizados por ANOVA utilizando el software SPSS 11.0 y P & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Microarray Número de Acceso
Los datos de microarrays se ha depositado en el NCBI la Expresión Génica Omnibus (GEO) (no la adhesión. GSE73777).
A2PP no tiene ningún efecto sobre la viabilidad o la migración de las células de cáncer gástrico
con el fin de evaluar el papel del dominio N-terminal de la ANXA2 en
M
.
hyorhinis
infección, que en primer lugar sintetizado péptido A2PP correspondiente al N-terminal de ANXA2 (Fig 1A). Marcado con biotina A2PP ha demostrado interactuar específicamente con GST-p37 en el ensayo de unión en fase sólida (Figura 1B) y desplegable de ensayo (Figura 1C). Nos dimos cuenta de que A2PP no afectó la morfología de AGS y BGC823 células (Figura 1D). Además, en concentraciones de menos de 20 mM, A2PP no inhibió la proliferación celular (Fig 1E), lo que sugiere que A2PP tiene una toxicidad mínima para las células. EGFR se ha implicado en la regulación de la fosforilación ANXA2 [17,25,26], mientras que A2PP no tuvo efectos sobre las fosforilaciones o niveles de proteína de EGFR y ANXA2 [Fig 2A]. Por otra parte, A2PP no tuvo efectos sobre la migración de AGS y BGC823 células (Figura 2B y 2C). localización celular de la ANXA2 está regulada por su fosforilación, lo cual es crítico para su función [17,27,28]. Encontramos A2PP no cambió la localización subcelular de ANXA2 endógeno (Fig 2D). Estos resultados indican que A2PP sola no tiene efectos sobre los fenotipos malignos o la señalización de EGFR-ANXA2 de células de cáncer gástrico.
(A) Diagrama esquemático de la secuencia de aminoácidos de N-terminal de polipéptido ANXA2 (A2PP). (B) ensayo de unión en fase sólida. OD490 de 15 nM de biotina-A2PP a GST se estableció como 1 y se caculated enlaces relativos. La media ± desviación estándar de tres ensayos independientes con muestras por triplicado. ***, P & lt; 0.001. (C) pull-down ensayos estreptavidina identificaron biotina-A2PP como un polipéptido de unión a GST-p37. (D) La morfología celular de AGS y BGC823 siguientes concentraciones indicadas de tratamiento A2PP durante 24 horas y 48 horas. (E) la proliferación de líneas celulares de cáncer gástrico (AGS y BGC823) tratados con el aumento de concentración de A2PP de 72 hr. Media ± SD de tres experimentos con muestras por triplicado.
(A) Western Blot de fosfo-EGFR, fosfo-ANXA2, EGFR, y ANXA2 de AGS y BGC823 células tratadas con A2PP durante 24 horas. GAPDH se utilizó como control de carga. (B) Imágenes representativas de la migración de las células AGS y BGC823 tratados con A2PP durante 24 horas. Barras de escala, 200 m. (C) Resumen estadístico de ensayo de migración. Media ± SD de tres experimentos con muestras por triplicado. ns, ninguna importancia. (D) La inmunofluorescencia de la localización ANXA2 (rojo) en AGS y BGC823 células tratadas con A2PP durante 24 horas. Las barras de escala, 5 m.
A2PP Disminuciones
M
.
hyorhinis
infección
Nuestro trabajo previo ha demostrado que el N-terminal de media la ANXA2
M
.
hyorhinis
la infección [17]. Como se muestra por el resultado del ensayo de ELISA de células, se encontró que
M
.
hyorhinis
infección fue bloqueada por A2PP en una forma dependiente de la dosis en células BGC823 y AGS, pero las células tratadas con CONP todavía estaban altamente infectados por
M
.
hyorhinis gratis (Figura 3A). Estos resultados fueron apoyados por ensayos de qPCR (Figura 3B). Consistentemente, A2PP también disminuyó los niveles de proteína de la proteína p37 en el análisis de transferencia Western (Fig 3C y 3D). Mientras tanto, los niveles de phophos-AXNA2 y phophos-EGFR en las células infectadas se redujeron reguladas por tratamiento con A2PP (Fig 3C y 3E), mientras que los niveles totales de AXNA2 y EGFR fueron relativamente estables (figura 3C). En el análisis de inmunofluorescencia, A2PP se encontró que inhibe
M
.
hyorhinis
la infección inducida por la acumulación de p37 y co-localización entre p37 y ANXA2 (figura 4A). En el ensayo de co-inmunoprecipitación con proteína lisados de
M
. células
hyorhinis
ha infectado, A2PP disminuyeron la interacción entre p37 y ANXA2 (figura 4B). En conjunto, estas evidencias apoyan la idea de que podría disminuir A2PP
M
.
hyorhinis
infección y confirmado nuestro descubrimiento anterior de que se requiere que el N-terminal de ANXA2 para mediar
M
.
hyorhinis
la infección [17].
Cell análisis ELISA de p37 (OD 490 nm) de la proteína p37 en AGS y BGC823 células infectadas con 10
5 CCU (unidades que cambian de color) /ml de
M
.
hyorhinis
y se trata con A2PP o CONP durante 24 horas.
M
.
hy
,
M
.
hyorhinis
. Media ± DE de 3 experimentos con triplicado para cada muestra. (B) La PCR cuantitativa (qPCR) análisis de
p37 Hoteles en AGS y BGC823 células infectadas y tratadas como en (A). Media ± DE de 3 experimentos con triplicado para cada muestra. (C) la transferencia Western de p37, p-EGFR, EGFR, p-ANXA2 y ANXA2 de AGS y BGC823 células trató como en (A). (D) La cuantificación de los niveles de proteína p37 de en (C). Los niveles de p37 se normalizaron a los de GAPDH. La media ± DE de 3 experimentos independientes. (E) Cuantificación de p-EGFR y los niveles de p-ANXA2 en (C). Los niveles de p-EGFR o p-ANXA2 se normalizaron a los de EGFR o ANXA2. La media ± DE de 3 experimentos independientes. **, P & lt; 0,01; **, P & lt; 0.001; ns, no tiene importancia.
(A) Localizaciones de ANXA2 (rojo) y p37 (verde) en BGC823 y células infectadas con AGS 10
5 CCU /ml de
M
.
hyorhinis
y se trata con A2PP o CONP durante 24 horas. Colocalización se demostró por medio de señales combinadas (amarillo). Las barras de escala, 5 m. (B) ensayo de co-inmunoprecipitación para validar la interacción ANXA2-p37 en células AGS y BGC823 infectados con
M
.
hyorhinis
y se trata con A2PP o CONP durante 24 horas.
A2PP Suprime
M
.
hyorhinis
inducida por la migración
Nuestros estudios previos sugirieron que
M
.
hyorhinis
infección podría promover la migración de células de cáncer gástrico [17, 23]. En este estudio, nos dimos cuenta de que
M
.
hyorhinis
-promoted migración de células de cáncer gástrico no se vio afectada por CONP, pero fue inhibida dependiente de la dosis por A2PP (Fig 5A y 5B). Estos resultados sugieren que inhibe A2PP
M
.
hyorhinis
inducida por la migración, que se asoció con su capacidad para disminuir la infección fosforilaciones promovido de EGFR y ANXA2 (figura 3C y 3E).
(A) La migración de 10
5 CCU /ml de
M
.
hyorhinis
infectados AGS y BGC823 células tratadas con péptidos indicados durante 24 horas. (B) Resumen de los ensayos de migración (n = 3). La media ± DE de 3 experimentos independientes con muestras por triplicado. ***, P & lt;. 0.001
¿Ha A2PP Motif esencial para disminuir
M
.
hyorhinis
infección
Para caracterizar el motivo crítico de A2PP, hemos tratado de determinar si los diversos péptidos truncados de A2PP (figura 6A) podía reduce
M
.
hyorhinis
infección. En el análisis qPCR, A2PP y péptidos truncados A2PP-ND4, ND8, ND12, CD4, CD8, CD12 y reducen
M
.
hyorhinis
infección en células de cáncer gástrico, pero A2PP-ND16 y A2PP-CD16 no se había reducido
M
.
hyorhinis
infección (Figura 6B). patrón similar de inhibición se obtuvo de ensayo de inmunotransferencia de tipo Western (figura 6C). Estos resultados sugieren la existencia de un motivo específico de A2PP es esencial por su capacidad para reducir
M
.
hyorhinis
infección. Para asignar aún más las secuencias básicas de este potencial motivo, hemos sintetizado los dos péptidos correspondientes a 11
º -20
º bis (denominado como A2PP-10aa) y 13
al 18
º aa (denominado como A2PP-6AA) (figura 7A). En ensayo qPCR, ambos péptidos podrían disminuir
M
.
hyorhinis
infección (Figura 7B), que fue apoyada por el ensayo de Western Blot (Figura 7C). En particular, los efectos inhibidores de A2PP-10aa eran mejores que las de A2PP-6AA, pero los efectos de ambos péptidos fueron menos robusto como los de A2PP (figura 7B y 7C). Thesefore, las secuencias centrales (11
º -20
º) de A2PP podría ser el motivo esencial para inhibir
M
.
hyorhinis
infección.
(A) Diagrama esquemático de péptidos truncados de A2PP. (B) Análisis de qPCR de
p37 Hoteles en AGS y BGC823 células infectadas con 10
5 CCU /ml de
M
.
hyorhinis
y se trata con 20 mM péptidos indicados durante 24 horas. Media ± DE de 3 experimentos con triplicado para cada muestra. (C) de Western Blot de p37 de AGS y BGC823 células infectadas y tratadas como en (B). La media ± DE de 3 experimentos independientes.
Diagrama esquemático de dos formas truncadas de A2PP. (B) Análisis de qPCR de
p37 Hoteles en AGS y BGC823 células infectadas con 10
5 CCU /ml de
M
.
hyorhinis
y se trata con 20 mM péptidos indicados durante 24 horas. Media ± DE de 3 experimentos con triplicado para cada muestra. (C) de Western Blot de p37 de AGS y BGC823 células infectadas y tratadas como en (B). La media ± DE de 3 experimentos independientes. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0.001.
Comparación de A2PP con otros fármacos en la prevención de
M
.
hyorhinis
infección
M
.
hyorhinis
fue una de las principales fuentes de contaminación del cultivo celular [13,14,15]. La mejor manera de eliminar
M
.
infección hyorhinis
es para descartar las células y rápidamente esterilizar todos los vasos en contacto, pero algunas células infectadas no podrían ser reemplazados en varios casos. En consecuencia, es imperativo el uso de antimicrobianos enfoques específicos para prevenir o eliminar
M
.
hyorhinis
infección. Ha habido diferentes agentes antimicrobianos para la prevención de
M
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hyorhinis
infecten. Por ejemplo, ciprofloxacina (CIP) podría erradicar
M
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hyorhinis
en una concentración adecuada [29]. Dos componentes antimicrobianos nombradas como micoplasma I (MYCO I) y II micoplasma (MYCO II) podría reducir
M
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hyorhinis
la infección mediante el bloqueo de su proteína y la síntesis de ácidos nucleicos. Sin embargo, algunas de las preocupaciones tales como una baja sensibilidad, resistencia fuerte y alta toxicidad pueden limitar sus aplicaciones en cultivo celular. Sobre la base de estas consideraciones, creemos que es necesario comparar las eficiencias de A2PP, CIP, MYCO I y II en la prevención de MYCO
M
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hyorhinis
infección. Por Western Blot y qPCR, se encontró que el efecto inhibidor de A2PP en
M
.
hyorhinis
infección fue similar a la de MYCO I, pero era mejor que los de la CIP y MYCO II (Fig 8A y 8B). Curiosamente, encontramos que A2PP también podría eliminar eficazmente el
M
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hyorhinis
infección en células muy infectadas en el proceso de pasajes de P
1 a P
3 (Fig 8C y 8D). Además, en comparación con MYCO I y II MYCO, A2PP tenía efecto menos inhibitorio sobre la proliferación de células (Fig 9A). Para explorar los mecanismos de A2PP, CIP, MYCO I y efectos de MYCO II sobre la proliferación de las células, se realizó un análisis de microarrays y exhibió un subconjunto de genes expresados diferencialmente en A2PP, CIP, MYCO I y II MYCO células tratadas. Análisis cuantitativo de RT-PCR mostró una mayor expresión de genes relacionados con la apoptosis (
ATF5
,
DDIT3
,
CEBPB
) por MYCO I y II MYCO tratamiento, pero eran pequeños cambios observado en A2PP y grupos CIP (Fig 9B). Estos resultados indican que A2PP tiene menos toxicidad y mayor potencial preventivo en el bloqueo de
M
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hyorhinis
infección en células cultivadas.
(A) Western Blot de p37 de AGS y BGC823 células infectadas con 10
5 CCU /ml de
M
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hyorhinis
y se trató con A2PP (20 mM), CIP (4 mg /ml), MYCO I (5 mg /ml), o MYCO II (10 mg /ml) durante 24 hr. La media ± DE de 3 experimentos independientes. (B) Análisis de qPCR
p37 Hoteles en AGS y BGC823 células tratadas como en (A). Media ± DE de 3 experimentos con triplicado para cada muestra. (C) de Western Blot de p37 a partir de células infectadas con AGS 10
5 CCU /ml de
M
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hyorhinis
y se trató con A2PP en el proceso de pases de células de P
1 a P
3. La media ± DE de 3 experimentos independientes. (D) qPCR análisis de
p37 en células AGS
infectadas y tratadas como en (C). Media ± DE de 3 experimentos con muestras por triplicado. **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0.001; ns, ninguna importancia.
(A) Proliferación de AGS y BGC823 tratados con A2PP (20 mM), CIP (4 mg /ml), MYCO I (5 mg /ml), o MYCO II (10 mg /ml) durante 72 hr. La media ± desviación estándar de 4 experimentos independientes con muestras por triplicado. (B) Análisis de RT-PCR de
ATF5
,
DDIT3
,
CEBPB Hoteles en AGS y BGC823 células tratadas con A2PP (10 mM), CIP (4 mg /ml ), MYCO I (5 mg /ml), MYCO II (10 mg /ml) durante 24 hr. Media ± DE de 3 experimentos con muestras por triplicado.
Discusión
La infección por micoplasma y la contaminación son todavía muy extendido hoy y trae riesgos considerables para los pacientes y la calidad de la investigación. En los últimos años, varios estudios sugieren que la infección por micoplasma también se asoció con la tumorigénesis [3-8]. infección por Mycoplasma podría provocar que el daño en el ADN, afectar a la expresión de genes, y alterar el punto de control del ciclo celular y respuesta de apoptosis [30].
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se encontró en el 56% de los cánceres gástricos, el 55,1% de los cánceres de colon y el 39,7% cánceres de mama tejidos [20]. Además, las pruebas serológicas mostró que el 36% hiperplasia prostática benigna (HPB) y el 52% tejidos de cáncer de próstata fueron
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positivo [4]. Estos estudios sugieren una posible asociación entre el
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la infección y la aparición de tumores [4,20]. Lo que es más, en el proceso de cultivo celular, las fuentes de contaminación más comunes son de micoplasma, bacterias y moho, pero la tasa de contaminación de micoplasma es relativamente más alta [13]. Los resultados de varios grupos han demostrado que la tasa de contaminación por micoplasma varió de 15 a 80%, algunos incluso llegó a 100% [15,31]. Un análisis de secuencias de ADN a partir de 1000 genomas proyecto implicaba que 7% de las muestras estaban contaminadas por micoplasmas [32]. Sin embargo, la prevención de la infección por micoplasma y contaminación es difícil. En primer lugar, debido a pleomórfico, plasticidad, filtrabilidad y fácil solubilidad, micoplasmas podrían pasar a través de membrana de microfiltración con facilidad, lo que hace de ellos existen en la superficie de la célula huésped o que se endocitosis por las células [1,13,33]. En segundo lugar, micoplasma carece de paredes celulares, haciéndolos insensibles a los antibióticos que inhiben la síntesis de la pared celular, tales como la penicilina. antimicrobianos eficaces existen, pero sus aplicaciones continuas en cultivo celular no se recomienda debido a la toxicidad para las células. Por último, micoplasma es una bacteria atípica, causando difficulities en el diagnóstico correcto [34].
Numerosos fármacos contra el micoplasma se han desarrollado, como la eritromicina, leucomicina, roxitromicina, ofloxacina y ciprofloxacina. Sin embargo, los efectos adversos, la toxicidad y la resistencia todavía traer problemas para la reducción de la contaminación [10,11,35-38]. Además, la administración continua de estos antibióticos no podía eliminar completamente micoplasma para una o incluso semanas más [39,40]. Por lo tanto, es fundamental para encontrar nuevas formas que pueden eliminar la infección por micoplasma o contaminación de manera eficaz y oportuna. La solución a este objetivo, probablemente, se puede encontrar a través de la caracterización de los mecanismos moleculares que subyacen a la infección por micoplasma.
Nuestro estudio anterior encontró que la interacción de la proteína P37 con AXNA2 mediada por
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la infección [17]. En este estudio, se sintetizaron en primer lugar, el polipéptido N-terminal de la ANXA2 (A2PP) y validado su interacción específica con la proteína GST-p37 en la unión de la fase sólida y los ensayos de estreptavidina desplegables. Inspirado por dicha interacción, nos preguntamos si A2PP podría antagonizar infección de
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. Se encontró que A2PP, en una concentración apropiada (20 mM), disminución de la
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infección hyorhinis
, la migración inhibe la infección-promovido, y la reducción de la infección provocada las fosforilaciones de EGFR y ANXA2 en células de cáncer gástrico. Estos efectos se asociaron con la interacción entre p37 y la disminución de la ANXA2. Cabe señalar que A2PP solo exhibió efectos mínimos sobre la proliferación de células y fosforilaciones de EGFR y ANXA2, lo que sugiere que A2PP es probable que sea un reactivo útil para reducir
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infección. Esta idea fue apoyada por la comparación de A2PP de antibióticos y los efectos comerciales 'en la proliferación celular y
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infección, lo que demostró que A2PP de hecho tuvo menos toxicidad para las células, pero fuerte capacidad de contrarrestar la infección.
A pesar de que A2PP, un polipéptido de 30 aa, podría disminuir
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infección hyorhinis
efectivamente, todavía tienen que entender si las formas truncadas de A2PP podrían alcanzar anti similares
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hyorhinis
capacidad.