Extracto
Antecedentes
deleción genómica en loci supresor tumoral es un campo común aberración genética en los cánceres humanos. El estudio tuvo como objetivo explorar los genes supresores de tumores en el cromosoma 4q25 candidato-q28.2 y delinear nuevos biomarcadores pronósticos asociados con el cáncer colorrectal (CCR).
Métodos
mapeo de deleción del cromosoma 4q25-q28 .2 se llevó a cabo en 114 CCR esporádico por la pérdida de heterocigosidad estudio con 11 marcadores microsatélites. Un nuevo gen supresor tumoral candidato, es decir,
NDST4
, fue identificado en 4q26. La expresión génica de
NDST4
se investigó en 52 pares de tejidos primarios CRC por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa. la pérdida alélica del
NDST4
gen se determinó aún más en 174 carcinomas colorrectales por la pérdida de heterozigosidad análisis, y luego se evaluó la relevancia clínica.
Resultados
Una región mínima fue borrado delineado entre D4S2297 y D4S2303 loci en 4q26, donde
NDST4
era el único gen que había sido marcadamente regulado por disminución en los tumores de CRC. Por microdisección de captura por láser,
NDST4
expresión de ARN se demostró en las células epiteliales del colon, pero era indetectable en las células tumorales. En total, 30 (57,7%) de 52 carcinomas colorrectales mostraron una reducción dramática en
NDST4
la expresión génica en comparación con la mucosa normal correspondiente. La pérdida genética de
NDST4
se asoció significativamente con el estadio patológico avanzado (
P = 0,039
) y peor supervivencia global de los pacientes (
P = 0,036
).
Conclusiones
NDST4
gen es un nuevo gen supresor tumoral candidato en el cáncer humano, y la pérdida de su función podrían estar involucrados en la progresión del CRC. Además, la pérdida de heterocigosidad de ensayo, que se estableció para determinar la pérdida alélica del gen
NDST4
, podría ser una herramienta rentable para proporcionar un biomarcador útil de pronóstico adverso en el CCR.
Visto: Tzeng ST, Tsai MH, Chen CL, Lee JX, Jao TM, Yu SL, et al. (2013)
NDST4
es un candidato gen supresor tumoral en el cromosoma 4q26 Novel y su pérdida genética predice mal pronóstico en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (6): e67040. doi: 10.1371 /journal.pone.0067040
Editor: Ludmila Prokunina-Olsson, Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Enero, 2013; Aceptado: 13-may de 2013; Publicado: 25 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Tzeng y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por becas del Consejo Nacional de Ciencia, Yuan Ejecutivo (NSC99-2320-B-002-020-MY3), el hospital Tien cardenal (CTH-93-1-2A01), y el Instituto Nacional de Investigación en Salud (INDH-EX101 -10136BI), Taiwán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una de las causas más comunes de muerte por cáncer en todo el mundo, y la mayoría de los tumores surgen esporádicamente por una combinación de mutaciones discretas y alteraciones cromosómicas [1] - [3]. A pesar de las operaciones agresivas complementado con diversas terapias adyuvantes y una mayor comprensión de los mecanismos genéticos que subyacen a este trastorno, ha habido pocas mejoras en la supervivencia de los pacientes con CCR invasivo [4], [5]. Aunque las características histopatológicas y puesta en escena en el momento de presentación se mantienen los indicadores pronósticos más importantes, muchos pacientes con características patológicas similares muestran considerablemente diferentes resultados clínicos [6]. Por lo tanto, la aplicación del análisis genético sensible podría ser útil para la identificación de pacientes de alto riesgo y luego para estratificar el diseño de la terapia adyuvante. Además, una mejor comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la tumorigénesis colorrectal puede proporcionar nuevos biomarcadores de los posibles objetivos de intervención terapéutica y los indicadores de pronóstico para la intervención quirúrgica [7].
inestabilidad cromosómica es la aberración genética más común en CCR esporádico [8], [9]. estudios sustanciales han puesto de manifiesto que las pérdidas alélicas en múltiples regiones del cromosoma 4 están asociados con la progresión de la etapa, la metástasis del tumor, y la supervivencia más corta en muchos cánceres humanos, lo que indica la presencia de uno o más gen supresor de tumores (TSG) loci [10] - [15 ]. Sin embargo, se han identificado algunos ETG en el cromosoma 4 involucrado en la patogénesis de CRC. Recientemente se realizó una cartografía deleción del cromosoma 4 por la pérdida de heterocigosidad estudio (LOH), e identificamos el locus D4S402 en 4q27 que exhibe la frecuencia de pérdida alélica más alta de 32,5% en el año 106 CRC esporádica (nuestros datos no publicados). En el presente estudio, que tuvo como objetivo explorar las ETG-CRC asociados en la región adyacente de D4S402. Se realizaron dos enfoques: (1) supresión de cartografía fina en el cromosoma 4q25-q28.2 para delinear la región que alberga ETG, y (2) el análisis de alteraciones (expresión génica y de deleción alélica) de los ETG candidatos en CRC tumores primarios. Además, la pérdida genética del candidato ETG se evaluó la relevancia clínica.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras de tejido
Un total de 174 pacientes con CCR esporádico, quien se sometió a una cirugía en el hospital Tien cardenal, Taiwán, fueron reclutados entre agosto de 1997 y diciembre de 2008 (Tabla 1). Los seguimientos se realizaron hasta abril de 2010. Los 174 pacientes fueron operados por histológicamente verificado adenocarcinoma colorrectal sin quimioterapia y /o radioterapia preoperatoria. Tanto tumoral emparejados y las muestras de mucosa normal se obtuvieron de cada paciente durante la cirugía. Además, los tejidos de pólipos adenomatosos se obtuvieron de 57 pacientes que se sometieron a la polipectomía endoscópica. Todas las muestras de tejido se congelaron inmediatamente después de la resección y se almacenan en nitrógeno líquido hasta la extracción de ácido nucleico. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito, y el estudio se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki y aprobados por el Consejo del Hospital Tien cardenal, Taiwán.
Análisis de LOH
Revisión Institucional se extrajo el ADN a partir de tejidos congelados utilizando el Kit QIAamp DNA Mini (Qiagen). Para el mapeo fino eliminación del cromosoma 4q25-q28.2 (12,9 cm), estudio LOH con un panel de 11 microsatélites se llevó a cabo en 114 pares de ADN de tejido CRC (Figura 1A y en la Tabla 2). Para determinar aún más la pérdida alélica de
NDST4
gen, estudio LOH con dos marcadores de microsatélites, MS5850 (UniSTS: 536617) y D4S1580, se llevó a cabo en 174 casos de CCR (Figura 1A y Tabla 2). En cada par de cebadores, el cebador directo fue sintetizado con 6-FAM, VIC o NED marcador fluorescente en función del tamaño de amplificación. La amplificación por PCR se realizó en un volumen final de 6 l usando 20 ng de ADN, 500 nM de cada uno de los cebadores respectivos, 200 mM de cada dNTP, y 0,3 unidades de AmpliTaq Gold ADN polimerasa (Applied Biosystems). PCR se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones de ciclación: una etapa de incubación pre-PCR a 95 ° C durante 15 min; seguido por 35 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 45 s, y 72 ° C durante 30 s; y una extensión final de 72 ° C durante 10 min. Los fragmentos amplificados se separaron en 6% de desnaturalización geles de poliacrilamida en un ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), como se describe en las instrucciones del fabricante. pares de ADN normal y el tumor se compararon los cambios en el número de picos de alelos y la altura del pico de cada marcador mediante el uso de software de análisis GeneScan (Applied Biosystems). El índice de LOH de cada par normal y el ADN del tumor se calculó como se describe anteriormente [16]. En pocas palabras, la relación de las alturas de los picos de los alelos calculados para cada muestra de tumor se dividió por la relación de la altura del pico alelo del control normal coincidente. Un índice de LOH ≤0.67 o ≥1.5, lo que representa una disminución de al menos el 33% de un alelo del tumor, era indicativo de la pérdida alélica.
A. Los marcadores microsatélites utilizados para la pérdida de heterocigosidad estudio. Tres genes se encuentran en la región de eliminación mínimo delineado por D4S2297 y D4S2303. Las barras negras indican
UGT8 Opiniones y
NDST4
genes.
miR-577 gratis (
MIR577
) se sitúa en el intrón de
UGT8
. B. Análisis de
UGT8
y
NDST4
mRNAs en los tumores (T) y mucosas emparejado normal (N) de tejidos de CRC por RT-PCR.
β-actina
se utilizó como control interno de ARN. C. Análisis de
miR-577
expresión en tejidos de CRC de QRT-PCR. Los niveles de expresión de los tumores se normalizaron a los de la mucosa normal correspondiente. Los datos representan la media ± SD.
La extracción de RNA
ARN total fue extraído de los tejidos congelados y 10 líneas celulares de CRC (COLO205, HCC2998, HCT116, HCT15, HT29 , KM12 y SW620 del Instituto Nacional del cáncer de Estados Unidos; LoVo, SW48, y SW480 de la colección Bioresource y Centro de Investigación, Taiwan) usando reactivo TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La concentración y pureza del ARN se determinaron con un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific), y la integridad del ARN se confirmó por electroforesis en gel de agarosa.
transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
Diez casos de CCR seleccionados al azar se utilizaron en un estudio piloto para la expresión génica. ADN complementario (ADNc) fue inverso-transcrito a partir de ARN total (2 mg /l 20 de reacción) mediante el uso de la alta capacidad de cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). La transcripción inversa se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: 25 ° C durante 10 min, 37 ° C durante 2 h, y 85 ° C durante 5 min. El ADNc resultante se diluyó 5 veces con pirocarbonato de dietilo (DEPC) tratados con H
2O. Genes específicos de conjuntos de cebadores diseñados exones que abarcan fueron los siguientes:
NDST4
adelante 5'-TCTGGGAGTTACACCTCG-3 'y 5'-reverse TCTTGAGAGGCTTAGTTCTTG-3';
UGT8
adelante 5'-TTATATTATTCGTCACAATGG-3 'y 5'-reverse AAAACTAAGGTCTGACACAGT-3';
β-actina
adelante 5'-ACAGAGCCTCGCCTTTGC-3 'y revertir 5'-TCATCTTCTCGCGGTTGG -3'. La amplificación por PCR se realizó en un volumen final de 25 l utilizando 2,5 l de cDNA diluido, 1 mM de cada uno de los cebadores respectivos, 250 mM de cada dNTP, y 1 unidad de Super-Therm oro ADN polimerasa (Bertec empresa). PCR se realizó bajo las siguientes condiciones de ciclación: una etapa de incubación pre-PCR a 95 ° C durante 10 min; 36 (
NDST4
y
UGT8
) o 28 (
β-actina
) ciclos de 95 ° C durante 15 s, 55ºC durante 45 s, y 72 ° C durante 45 s; seguido de una extensión final de 72 ° C durante 3 min. Los fragmentos amplificados se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa.
RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR)
Para la cuantificación de
NDST4
expresión de ARN en 52 pares de CRC primaria tejidos y 57 pólipos, una expresión TaqMan Ensayo del gen (Hs00224024_m1, Applied Biosystems) se utilizó con un gen de referencia
TBP
(proteína de unión a TATA box-, Hs00920497_m1) como control para la calidad y la cantidad de ARN. El cDNA fue sintetizado como se menciona en la sección de RT-PCR. PCR datos cuantitativos fueron capturados por un ABI PRISM 7000 Sequence Detection System y se analizaron por ABI PRISM 7000 SDS Software (Applied Biosystems). La mezcla de reacción incluyó 5 l de la cDNA diluido, 1 l de una mezcla de sondas de hidrólisis, 10 l de TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems), con la adición de H tratada con DEPC
2O a un volumen final de 20 l . Las reacciones se llevaron a cabo por duplicado bajo las siguientes condiciones de ciclación: una etapa de incubación a 50 ° C durante 2 min; y una etapa de activación enzimática a 95 ° C durante 10 min, seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min. Los niveles de expresión de
NDST4 Hoteles en tumores, mucosas y pólipos normales se normalizaron al gen de referencia individual,
TBP
. La relación de tumor a la normalidad-mucosa coincidente de
NDST4
expresión de ARN se calculó utilizando el método comparativo Ct, 2
-ΔΔCt [17]. Los niveles de expresión relativa de
NDST4
en las líneas celulares de CRC se compararon con una expresión media de 52 mucosas normales, que se ajustó a 1.
Análisis microARN 577 Expresión
para la cuantificación de
microARN 577 gratis (
miR-577
) expresión en 10 pares de tejidos CRC primarias seleccionadas al azar, los pequeños ARN se extrajo utilizando el kit de aislamiento mirVana ™ miARN (Ambion) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las plantillas de cDNA se preparan a partir de RNA total utilizando el TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), que utiliza cebadores inversos de tallo-bucle. En resumen, 10 ng de ARN total se mezcló con 0,8 l de los cebadores de tallo-bucle RT, 0,15 l de mM dNTP 100, 1,5 l de 10 x tampón de RT, 0,2 l de inhibidor de RNasa (20 U /l), y 1,0 l de la transcriptasa inversa MultiScribe (50 U /l). La mezcla (volumen final, 15 l) se incubó a 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 30 min, 85 ° C durante 5 min, y después se mantuvo a 4 ° C. Después de RT, los productos de ADNc, además de los cebadores TaqMan y sondas, se mezclaron con los otros reactivos de la PCR en el kit de mezcla de PCR Universal Master (Applied Biosystems), y qPCR se llevó a cabo por triplicado en el ABI PRISM 7000 Sequence Detection System. Las condiciones de PCR incluían una incubación inicial a 50 ° C durante 2 min y desnaturalización a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min. Los cebadores utilizados para
miR-577 gratis (pieza número 4408995) y
RNU6B gratis (ARN, U6 nuclear pequeño 2, 4373381) fueron adquiridos de Applied Biosystems. Como control endógeno,
RNU6B
se amplificó en paralelo, y el valor Ct de
miR-577
se normalizó a la de
RNU6B
. Los niveles de expresión de los tumores se compararon con la mucosa normal correspondiente, que se ajusta a 1.
Laser Capture microdisección
Para confirmar
NDST4
la expresión del ARN en tipos de células específicas de tejidos primarios CRC, carcinoma colorrectal y células epiteliales de la mucosa normal correspondiente se recogieron a partir de dos casos de CCR, así como se recogieron las células linfoides asociados a la mucosa de la tercera sección de tejido normal. Las secciones congeladas se fijaron y tiñeron utilizando el HistoGene LCM Frozen Sección Staining Kit (Arcturus Engineering). Las células fueron aisladas mediante la realización de láser de microdisección de captura con el sistema de captura de microdisección láser AutoPix Automatizado (Arcturus Ingeniería). Después de la microdisección, las células capturadas en la tapa se incubaron inmediatamente con un tampón de extracción, y el ARN total fue aislado utilizando el kit de aislamiento de ARN PicoPure (Arcturus Engineering), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis estadístico
la asociación entre la pérdida alélica de
NDST4
las variables clinicopatológicas de genes y se analizó mediante de Student
t-test
(por edad), lineal por lineal asociación de prueba de chi-cuadrado ( para la prueba de chi-cuadrado de Dukes etapas) o Pearson (para otras variables categóricas). Un
valor de p
dos caras de & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. El tiempo de supervivencia se consideró el intervalo entre la cirugía y la fecha de la última visita de seguimiento o la muerte de la enfermedad (supervivencia global, OS), o la fecha de la última visita de seguimiento o la repetición (supervivencia libre de enfermedad, DFS). Las curvas de supervivencia, que se calcula con el método de Kaplan-Meier, se compararon mediante la prueba de log-rank. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software de IBM SPSS, versión 17.0.
Resultados
NDST4 gen es un gen supresor tumoral candidato en el cromosoma 4q26
Un total de 114 pares de se utilizaron tejidos de CRC primarias para determinar la región eliminación mínima en el cromosoma 4q25-q28.2 mediante el uso de análisis de LOH. Cincuenta (43,9%) de los 114 tumores exhibieron LOH en uno o más marcadores de microsatélites. Frequent LOH, definida como ocurren en más del 30% de los tumores informativos, se observó en cuatro loci, incluyendo D4S2297, D4S2303, D4S402, D4S2394 y. En consecuencia, se delineó entonces una región eliminación mínimo con una longitud genética de 1,4 Mb entre D4S2297 y D4S2303, que participó en 80,0% (40/50) de los tumores con LOH. Los resultados demuestran una alta frecuencia de la pérdida del cromosoma 4q26 en los carcinomas colorrectales, y dan a conocer un locus putativo TSG involucrado en el desarrollo de CCR.
Mediante la búsqueda en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) de base de datos, sólo dos de codificación de proteínas genes,
UGT8
y
NDST4
, así como uno de microARN,
miR-577
, se demostró que se encuentra en la región de su eliminación mínima definida. La expresión de
UGT8
,
NDST4
, y
miR-577
se proyectó en 10 pares de tejidos CRC primarias seleccionadas al azar por RT-PCR o QRT-PCR (Figura 1B y 1C). Los niveles de expresión de
UGT8
y
miR-577
en los tumores analizados eran compatibles con la mucosa normal adyacente. Los resultados mostraron que
NDST4
la expresión génica se disminuyó evidentemente en seis de 10 tumores. Los resultados sugieren que
NDST4
podría ser una novela TSG ubicado en la región 4q26, que se elimina con frecuencia en el CCR.
NDST4 gen se expresa en las mucosas normal del colon y pólipos, pero está regulado por disminución en Colorrectal carcinomas
el carcinoma colorrectal se origina en la mucosa del colon a través de la acumulación de alteraciones genéticas. Como candidato de TSG-CRC asociado,
NDST4 qué debería ser expresada en el epitelio del colon. Por lo tanto, la microdisección de captura por láser se llevó a cabo para aislar diferentes tipos de células en las secciones de tejido, incluyendo el epitelio y las células linfoides de la mucosa normal, así como las células tumorales de CRC, y luego
NDST4
expresión se determinó por QRT -PCR (Figura 2). Los resultados mostraron que
NDST4
mRNA fue detectable en las células epiteliales de los dos casos de mucosa normal, pero ni en sus células tumorales emparejados ni en las células linfoides, incluso después de 45 ciclos de amplificación por PCR. Para determinar la regulación a la baja de
NDST4
expresión en CRC, que analiza más de 52 pares de tejidos primarios. De acuerdo con la hipótesis de Knudson dos afectada, una copia funcional de un TSG puede contribuir a la expresión de genes parcial [18]. Por lo tanto, una disminución de 0,25 veces se define como el umbral de la regulación a la baja significativa. Un total de 30 tumores (57,7%) mostraron una disminución evidente en
NDST4
expresión, en comparación con la mucosa normal correspondiente (Figura 3A). Además,
NDST4
La expresión génica se determinó también en 57 pólipos adenomatosos. A diferencia de los tumores CRC, en el que
NDST4
expresión se redujo sustancialmente, los adenomas mostraron un nivel similar de expresión como la mucosa normal (Figura 3B). Además, todas las 10 líneas celulares de CRC estudiados expresaron niveles muy bajos o indetectables de
NDST4
ARNm (Figura 3C). Una reducción dramática de
NDST4
expresión en CRC sostiene que
NDST4
es un nuevo candidato ETG, y que la pérdida de su función podría desempeñar un papel en la tumorigénesis colorrectal.
A. Láser de microdisección de captura de diferentes tipos de células de tumor de CRC y las secciones de la mucosa normal correspondiente. se muestran imágenes representativas de portaobjetos teñidos-HistoGene antes y después de la captura de microdisección por láser. B. y C. QRT-PCR análisis de
NDST4
y
TBP
expresión en las células capturadas.
TBP
se utilizó como control interno de ARN. Rn, la señal del informador normalizado.
A. Comparación de los
NDST4
expresión entre el tumor y la mucosa normal correspondiente en 52 pares de tejidos CRC de QRT-PCR. La expresión relativa (Tumor /Normal) en cada caso se indica mediante una columna. B. Regulación a la baja de
NDST4
expresión en tumores de CRC, pero no en los pólipos adenomatosos. El
NDST4
expresión en relación con un control interno,
TBP
, se ilustra a través de análisis de diagrama de caja. Los bigotes denotan el intervalo entre el 5
º y 95
º percentiles. Una diferencia significativa entre los grupos fue probada por Estudiante de
t-test
(emparejados, tumor
vs
mucosa;. Unpaired, mucosa
vs
pólipo.). N. S., no significativo. C. regulación a la baja de
NDST4
expresión en todas las 10 líneas celulares de CRC humanos probado. Los niveles relativos de expresión de células de CRC se compararon con la expresión media de 52 mucosas del colon normal. Los datos representan la media ± SD.
alélica Pérdida de NDST4 génica se asoció significativamente con la avanzada etapa patológica y escasa supervivencia en el CCR
Para determinar con precisión la eliminación genética de
NDST4 Hoteles en CRC, el WebSat, software web para el desarrollo de marcadores de microsatélites, se utilizó para identificar repeticiones cortas en tándem dentro de
NDST4
de genes [19]. Un nuevo marcador, MS5850, que fue diseñado en este estudio, y D4S1580 fueron utilizados para el análisis de LOH en 174 pares de tejidos CRC primarias (Figura 1A). Las correlaciones entre la alteración genética y las características clinicopatológicas se enumeran en la Tabla 1. En total, 53 (30,5%) de los 174 tumores fueron positivos para la pérdida alélica del gen
NDST4
. La aberración genética se incrementó considerablemente en los tumores con estadios patológicos más altas (T3 y T4) (
P = 0,039
). Además, aunque no estadísticamente significativa, se observó una tendencia creciente en la progresión de la metástasis a distancia y el estadio de Dukes (
P = 0,075 y 0,083
, respectivamente). Sin embargo, la pérdida genética no estuvo asociada con otras características clinicopatológicas.
La correlación de la pérdida alélica del
NDST4
gen con la supervivencia del paciente fue evaluada. El análisis del sistema operativo se realizó en 174 pacientes, de los cuales la tasa de SG fue de 67,8% (n = 118) con una supervivencia media de 94 meses. Mediante la aplicación de análisis de la curva de supervivencia de Kaplan-Meier, la pérdida alélica de
NDST4
gen predice una peor OS (
P = 0,036
) (Figura 4). Cincuenta y tres pacientes con esta aberración genética tenido un sistema operativo de 60,4% y una supervivencia media de 74 meses, mientras que las otras 121 pacientes tenían un sistema operativo de 71,1% y una supervivencia de 100 meses significan. Además, el análisis DFS se realizó en 118 pacientes con Dukes 'etapas B y C, de los cuales la tasa de DFS era 73,7% (n = 87) con un DFS media de 104 meses. Sin embargo, la característica genética no fue identificado como un predictor significativo de DFS para el grupo de pacientes con Dukes fases B y C. Se llevó a cabo
El análisis de Kaplan-Meier para comparar los pacientes con pérdida alélica del
NDST4
génica para los otros (no hay pérdida alélica). la pérdida genética de
NDST4
muestra una asociación significativa con una peor supervivencia (log-rank test).
Discusión
En el presente estudio, se identificó
NDST4
gen como una novela TSG candidato en el cromosoma 4q26, que es una región de deleción común en CRC. En contraste con la mucosa colónica normal con
NDST4
expresión, una mayoría de los tumores de CRC y líneas celulares mostraron una reducción dramática en la expresión génica. Además, hemos desarrollado un ensayo LOH con dos marcadores de microsatélites, y reveló que la pérdida genética de
NDST4
se asoció significativamente con el estadio patológico avanzado y supervivencia de los pobres, el apoyo a la función supresora de tumores de NDST4 en el CCR.
a pesar de ciertas vías moleculares que subyacen a la tumorigénesis colorrectal dilucidado, diferentes alteraciones genéticas pueden dar lugar a un fenotipo específico que se correlaciona con diversos comportamientos tumorales y resultados de los pacientes [20]. Por lo tanto, la identificación de nuevos marcadores moleculares es necesario mejorar las estrategias de terapias dirigidas y manejo del paciente a medida. En el estudio, hemos dilucidado una región eliminación mínima de 1,4 Mb en el cromosoma 4q26 en CCR esporádico, en consonancia con el informe anterior que la frecuencia de deleción alélica en 4q26 se incrementó en los carcinomas colorrectales en comparación con adenomas [11]. Aunque numerosos estudios previos han sugerido candidato ETG loci en el cromosoma 4 [14], [15], aquí hemos identificado, por primera vez,
NDST4
gen como una novela TSG candidato en 4q26. Además, debido a LOH en loci polimórficos permite la expresividad de eliminación de pérdida de función en ETG, este estudio genético tiene relevancia potencial de diagnóstico y pronóstico [21]. El ensayo LOH establecida en el estudio podría ser una herramienta rentable para proporcionar un biomarcador útil de pronóstico adverso en el CCR.
NDST4 es un miembro de la N-desacetilasa /N-sulfotransferasa (glucosaminil heparán) (NDST ) de la familia, que se encarga de heparán sulfato () SA biosíntesis de proteínas en un núcleo para formar proteoglicanos heparán sulfato (HSPG) [22], [23]. HSPGs ubicua residen en la superficie celular, dentro de la célula, y en la matriz extracelular [24]. Las cadenas de HS de HSPGs interactúan con una amplia gama de ligandos de proteínas, como las familias de factores de crecimiento, y por lo tanto, contribuyen a la estructura de los tejidos y la función durante el desarrollo y la homeostasis de adultos [25], [26]. Es importante destacar que, el contenido y la distribución de HSPG se alteran durante la tumorigénesis, que han estado implicados en los aspectos positivos o negativos de la progresión tumoral. Por ejemplo, la función HSPGs como co-receptores para factores de crecimiento y sus receptores tirosina quinasas para estabilizar los complejos de señalización durante la proliferación tumoral y la invasión [27]. Por el contrario, promueven HSPGs célula-célula y las interacciones célula-matriz extracelular y construir barreras inhibidoras de la invasión tumoral. Por lo tanto, los niveles disminuidos de HSPG se correlacionan con la progresión de tumor [28], [29]. En el presente estudio, la pérdida genética de
NDST4
se asoció significativamente con el estadio patológico avanzado, que se refiere a la profundidad de la invasión tumoral local en el CCR, lo que sugiere que la pérdida de la función de
NDST4
gen podría poner en peligro la modificación de cadenas de HS de HSPGs específicos, lo que lleva a las células tumorales más invasivas a través de remodelación de la interacción de receptores de adhesión celular y ligandos.
cuatro isoformas diferentes de NDSTs se identifican en los vertebrados. A diferencia de la expresión génica universal de
NDST1
y
NDST2
,
NDST3
y
NDST4
transcripciones se expresan predominantemente durante el desarrollo embrionario [30], [31 ]. Sin embargo, los patrones de expresión de
NDSTs
nunca han sido ilustrados en el colon humano. El uso de RT-PCR, se encontró que las transcripciones de cuatro
NDSTs
eran fácilmente detectables en la mucosa colónica normal, mientras que sólo el
NDST4
expresión se downregulated en la mayoría de los tumores analizados CRC (datos no mostrados ). De acuerdo con la estructura predicha del dominio de sulfotransferasa NDSTs, las cuatro isoformas diferentes pueden presentar diferentes especificidades de sustrato [30]. Sheng
et al.
Demostrado recientemente que NDST1 realiza la modificación de una manera altamente ordenada para controlar los dominios N-sulfatación en el SA, lo que sugiere que inició y siguió N-sulfatación podría llevarse a cabo utilizando diferentes NDSTs [32]. Con la relativamente pobre actividad de desacetilación de NDST4 en cadenas de HS no modificados, NDST4 podría preferir los que tienen una modificación inicial por otras isoformas [30]. Además, NDSTs desempeñan un papel fundamental en la biosíntesis del SA porque NDSTs son los primeros participantes en el proceso de modificación secuencial [33]. Curiosamente, porque NDST4 es la única isoforma que habían sido regulados a la baja notablemente en los CRC tumores analizados (nuestros datos no publicados), no parecen los otros tres isoformas NDST para compensar la deficiencia de NDST4 en un estado específico de colon. Las cadenas de HS de HSPG en la mucosa colónica pueden tener patrones de modificación únicas mediadas, al menos en parte, por la actividad NDST4. HSPGs alterados que resultan de la pérdida de la función de NDST4 pueden variar disposición de células y tejidos, y luego promover CRC patogénesis. Sin embargo, las alteraciones en la expresión de enzimas biosintéticas del SA pueden ser relativamente diferente de una forma de cáncer de tipo específico [34]. Fernández-Vega
et al.
Informó hace relativamente poco tiempo que
NDST4
transcripción aumentó en el 50% de los 23 que infiltran los adenocarcinomas ductales estudiado, cuando estaba ausente en tejidos normales de mama [35]. Tomados en conjunto, tienen una garantía de más estudios para obtener ideas sobre el papel de NDST4 en el desarrollo tumoral y la progresión de los cánceres humanos.
En conclusión, delineando una región mínima deleción en el cromosoma 4q26, este estudio es el primero en identificar
NDST4
gen como un nuevo candidato ETG en el CCR. Además, la pérdida genética de
NDST4
podría servir como un biomarcador de pronóstico adverso en los pacientes con CCR. El ensayo LOH diseñado para determinar la pérdida alélica del
NDST4
gen en el estudio podría ser utilizado como una herramienta de diagnóstico molecular para la estratificación del riesgo en las intervenciones terapéuticas individuales.