Extracto
El cáncer gástrico es una de las neoplasias más comunes y tiene una alta tasa de metástasis. Se postula que el
NMe2
(nucleósido difosfato quinasa 2), que previamente se ha considerado como un gen de anti-metastásico, juega un papel en la invasividad de células de cáncer gástrico. Usando una tecnología de chips de tejidos e inmunohistoquímica, hemos demostrado que la expresión NMe2 se asoció con niveles de diferenciación de células de cáncer gástrico y sus metástasis en los ganglios linfáticos. Cuando el
NMe2
producto del gen se expresa sobre-by;
in vitro
transfección estable, las células de BGC823 y líneas celulares de cáncer gástrico MKN45 habían reducido las tasas de proliferación, la migración y la invasión a través de colágeno matriz, lo que sugiere una actividad inhibidora de NMe2 en la propagación y la invasión del cáncer gástrico. NMe2 podría, por lo tanto, severa como marcador de riesgo para la invasividad del cáncer gástrico y un nuevo objetivo potencial para la terapia génica para mejorar o inducir la expresión NMe2
Visto:. Liu Yf, Yang A, Liu W, Wang C, Wang M, Zhang L, et al. (2015) NMe2 reduce la proliferación, migración y la invasión de células de cáncer gástrico para limitar la metástasis. PLoS ONE 10 (2): e0115968. doi: 10.1371 /journal.pone.0115968
Editor Académico: Jian Cao, de la Universidad de Stony Brook, Estados Unidos |
Recibido: 18 de abril de 2014; Aceptado: 3 de diciembre de 2014; Publicado: 20 Febrero 2015
Derechos de Autor © 2015 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Este estudio fue apoyado por el programa de apoyos para Chang-Jiang Académicos y el equipo de investigación innovadora en la Universidad (PCSIRT: IRT1137) y los Fondos de Investigación Básica de las Universidades central (lzujbky-2013-CT06). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación de este manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer sigue siendo una causa principal de muerte, lo que representa 14,1 millones de casos nuevos y 8,2 millones de muertes en 2012 [1]. Se espera que el número de nuevos casos de aumentar un 70% en todo el mundo a 22 millones en los próximos dos decenios [2]. Los cánceres en los pulmones, estómago, hígado, colon y mamas tienen la mayor mortalidad [3]. células de cáncer gástrico directamente pueden extenderse a órganos adyacentes (invasión local), tales como el páncreas, el colon transverso, el hígado y el bazo, así como a los ganglios linfáticos distantes, los pulmones y el tejido óseo. A pesar de ser dos procesos patológicos diferentes, invasión local y metástasis a distancia están interconectados donde el ex menudo promueve y propaga la segunda. Las mutaciones genéticas y sus productos aberrantes son las características clave y facilitadores de las células cancerosas para la proliferación, resistencia a la apoptosis, invasión local, metástasis, la evasión inmune, la angiogénesis y la respuesta al daño del ADN.
NME
(nucleósido difosfato quinasa 2 o células no metastásicas) representa un grupo de genes del cáncer de regulación asociados con el cáncer y /o.
NME
consta de una familia de 10 genes que también son conocidos como el
nM23
genes [4] y se ha asociado con la supresión de la metástasis del cáncer y la invasión de los tejidos locales [5]. Entre los miembros de esta familia de genes,
NME1
y
NMe2
se han estudiado ampliamente por sus actividades supresoras del cáncer.
NMe2
, que es mapeado en el cromosoma 17q21 [6,7], codifica la subunidad B de la nucleósido difosfato quinasa (NDP) [4]. Su producto se ha informado de inhibir la metástasis de cáncer de mama y células de melanoma; y una disminución de su expresión se correlaciona con un mayor potencial metastásico de estos tipos de cáncer [8,9]. Sin embargo,
NMe2
sobreexpresión también se asoció con un mal pronóstico para el neuroblastoma y el osteosarcoma [10,11]. Por otra parte, el
NMe2
gen no se correlaciona con la metástasis de hepatocelular endometrial y carcinoma de tiroides [12-14]. Estos datos aparentemente contradictorios sugieren que NMe2 puede tener efectos diferenciales en diferentes tipos de células cancerosas y su capacidad para invadir localmente los tejidos circundantes o metástasis en órganos remotos.
Debido a estas diversas actividades NMe2 en diferentes tipos de cáncer, se analizaron tejidos extraídos quirúrgicamente de pacientes con cáncer gástrico y asocian la expresión NMe2 en estos tejidos con sus características patológicas. Este estudio anatomopatológico se complementó con
in vitro
experimentos, en la que se examinaron las tasas de proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico que han sido transfectadas establemente con un ser humano
NMe2
ADNc que sobreexpresan su producto . Estos
in vitro
experimentos están diseñados para entender la capacidad de invasión de las células cancerosas que expresan diferentes niveles de NMe2.
Materiales y Métodos
Este estudio fue aprobado por el comité de ética en la realización de la investigación humana de la Universidad de Lanzhou, Escuela de Medicina. Los pacientes o sus tutores siempre que su consentimiento informado por escrito antes de ser reclutados en el estudio.
Tejido inmunohistoquímica
Se analizó la expresión NMe2 en tejidos normales y cancerosas adyacentes gástricos extraídos quirúrgicamente de 139 pacientes ingresados en el Ejército hospital regional de la ciudad de Lanzhou a partir de 2011 a 2012. Ningún paciente recibió quimioterapia o la radioterapia antes de la cirugía. Estos tejidos de cáncer quirúrgicamente retirados fueron procesadas para hematoxilina y eosina (HE) de tinción. En pocas palabras, un módulo de cera fue perforado 42 agujeros apertura (6 × 7 agujeros /chips) de 2 mm cada uno. bloques de tejido fueron incorporados en estos agujeros (una muestra /agujero). A continuación, este módulo de cera fue seccionado de manera que los tejidos de 40 pacientes podían ser examinados de forma simultánea en una sola diapositiva para asegurar la uniformidad de manchas. Para el control, los agujeros primero y el último se incrustaron con el tejido del hígado no canceroso y el riñón, respectivamente. expresión NMe2 se detectó usando un kit de inmunohistoquímica comercial (Beijing ZSGB Biotecnología Co, Ltd.) con un anticuerpo anti-NMe2 humana de conejo (1: 300 dilución, Beijing Biosíntesis Biotecnología Co, Ltd.) según las instrucciones del fabricante. Los niveles de expresión se anotó NMe2 numéricamente como se muestra en la Tabla 1 por un patólogo que desconocía la información clínica de estos pacientes.
Cultivo de células y transfección de ADNc
Las células de la BGC823 y las líneas celulares de cáncer gástrico MKN45 fueron adquiridos de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). Las células de la línea BGC823 eran originalmente de un hombre de 62 años de edad con adenocarcinoma pobremente diferenciado del estómago y los que están en la línea MKN45 derivado de una masa metastásico del hígado de un 62 años de edad, mujer japonesa, con un adenocarcinoma indiferenciado de el estómago. Las células de ambas líneas tenían niveles residuales de expresión NMe2 y son, por lo tanto, ideal para estudiar el impacto de la sobreexpresión de este producto del gen en células de cáncer gástrico
in vitro
.
Las células se cultivaron en una medio DMEM (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) que contiene 10% de suero fetal bovino (Hangzhou Sijiqing Biological Engineering Materials Co., Ltd., Hangzhou, china) a 37 ° C con 5% de CO
2 y 95 % de aire. En el 70-80% de confluencia, estas células fueron transfectadas con un ADNc para el gen
NMe2
humano que se clonó en un vector pcDNA3.1 (Shanghai GenePharma Co., Ltd. Shanghai, China) usando lipofectamina 2000 como el portador de ADN (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.). Las células que expresan establemente NMe2 (designado como NMe2) se seleccionaron por el crecimiento de las células transfectadas en el medio DMEM que contiene 1 mg /ml de G418. Las células de control se transfectaron con el vector pcDNA sin el
NMe2
inserto de ADNc (designado como mock) y se sometieron a la misma selección. También se examinaron las células parentales transfectadas-un como controles de referencia. Una sobreexpresión de NMe2 se determinó por RT-PCR para cuantificar el nivel de
NMe2
ARNm y por inmunotransferencias de lisados de células transfectadas utilizando un anticuerpo policlonal NMe2 (1:. Dilución 100, Beijing Biosíntesis Biotecnología Co, Ltd)
el aislamiento de ARN y RT-PCR
el ARN total se aisló a partir de células transfectadas y no transfectadas utilizando un kit de aislamiento de ARN comercial (Takara Biotecnología, Dalian, Liaoning, china) según las instrucciones del fabricante. RNA (2 g) de cada muestra fue inverso-transcrito utilizando un Kit PrimeScript RT siguiendo el protocolo del fabricante. El ADN complementario inversamente transcrito a partir del ARN extraído de estas células fue amplificado por una Taq polimerasa usando los siguientes cebadores para la
NMe2
cDNA: 5'-AAGCAGCACTACATTGACCTGAAA-3 '(hacia delante) y 5'-GGTCTCCCCAAGCATCACTC-3 ' (marcha atrás). Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se amplificó también como control usando los siguientes cebadores: 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '(hacia delante) y 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3' (inverso). La reacción de amplificación se inició por el ADN de desnaturalización a 95 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a plantilla 94 ° C durante 1 minuto, hibridación del cebador a 60 ° C durante 1 minuto, y extensión del cebador a 72 ° C durante 1 minuto. La sobreexpresión NMe2 fue cuantitativamente define como un aumento en
NMe2
mRNA por dos veces o más a partir de la línea base establecido por las células transfectadas simuladas.
Inmunofluorescencia tinción del producto
NMe2
las células transfectadas de manera estable con el
NMe2
cDNA y un vector vehículo se sembraron en cubreobjetos de vidrio y se dejaron crecer hasta confluencia. Se enjuagaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo (PBS), se fijaron en 4% de paraformaldehído en PBS durante 15 min, se permeabilizaron con 0,5% de Triton X-100, y se incubaron con 1% de albúmina de suero bovino (BSA) para 30 min para bloquear la unión no específica. Las células fueron incubadas con un anticuerpo de conejo contra NMe2 humana (1: 100, Beijing Biosíntesis Biotechnology) durante 24 horas a 4 ° C, seguido de incubación con un anticuerpo secundario conjugado con FITC (1: 100, Beijing Biosíntesis Biotechnology) durante 1 hr . Todos los anticuerpos se diluyeron en PBS que contenía 1% de BSA. Los núcleos se contratiñeron con DAPI (1: 100 en PBS, 10 min a temperatura ambiente).
ciclo celular análisis
Las células que expresan de forma estable células NMe2 y de control en el cultivo se recogieron y se fijaron con 70% de etanol enfriado en hielo a 4 ° C durante 24 horas, se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo, y luego se trató con RNasa a (20 mg /ml) durante 30 min a 37 ° C. Ellos se incubaron con yoduro de propidio (10 g /ml de concentración final) en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente antes del análisis por citometría de flujo para la ploidía del ADN.
Colonia-formación ensayo
transfectadas y control de las células se cultivaron a una densidad inicial de 1.000 células por placa de cultivo de 100 mm en un medio DMEM completo durante un máximo de 4 semanas. a continuación, se tiñeron con violeta de metilo. Todas las colonias de células que eran de más de 2 mm de diámetro (≥50 contenían células) fueron contados en tres platos separados y expresaron como media ± SEM. A los efectos de la validación de datos, también contaron las células viables que habían sido cultivadas durante un máximo de 96 horas. En pocas palabras, células parentales BCG823 y MKN45 y las células que fueron transfectadas establemente con ya sea un ser humano
NMe2
ADNc o el vector de vehículo (pc-DNA 3.1) se sembraron a una densidad de 2 x 10
4 células /ml. Ellos se separaron 48-96 horas después de la siembra inicial con 1% de tripsina y se centrifuga a 1600 x g. Los sedimentos celulares se resuspendieron en PBS y se incubaron con 0,04% de azul de tripano para 3 min. Las células supervivientes se contaron en un hemocitómetro.
Los ensayos para la migración celular
Se realizaron dos ensayos complementarios para medir el impacto de la sobreexpresión de NMe2 sobre la tasa de migración de las células. Primero fue un ensayo de cicatrización de heridas, donde se sembraron las células en placas de 6 pocillos y se dejaron crecer a ≥ 95% de confluencia. Después de lavar las células dos veces con PBS, una punta de pipeta estéril se utiliza para rayar la monocapa de células (4-5 rayas paralelas /placa). Las células se lavaron de nuevo con PBS, se fotografiaron para marcar pistas rayados, y se incubaron con 2,5 ml de medio DMEM libre de suero. A una velocidad de línea de base de la migración celular, un área rayada fue parcialmente cubierto por células migraron a la zona lesionada 24-48 horas después de la lesión, lo que resulta en una zona libre de células más pequeñas. Debido a que este ensayo de cicatrización de heridas es semi-cuantitativo, los resultados fueron validados mediante un ensayo de migración de células Transwell. Brevemente, 6 × 10
5 células en suspensión en 500 l de medio libre de suero que contiene 0,1% de BSA se sembraron en un Transwell (BD Biosciences) que se colocó en una placa de 24 pocillos. La cámara inferior contenía 500 l de medio DMEM completo. Las células se dejaron crecer en la cámara superior durante 24 horas para facilitar la migración de células de la cámara superior a la cámara inferior. Al final de este período de incubación, la membrana en la cámara superior se fijó con paraformaldehído 4% de de 30 min, se lavó con agua destila y se secó al aire. Las células en el lado opuesto de la cámara (transmigrado) se tiñeron con 0,1% de violeta de metilo (Dade-Behring, Newark, DE) durante 30 min, se lavaron y se observan bajo un microscopio de arriba-derecha (x 400, Nikon). La migración celular se define como el número de células en la membrana en 5 campos de revisión aleatoria.
Ensayo para la invasión de células
cámaras
Transwell fueron recubiertas con cola de rata tipo I colágeno fibrilar [15] durante 30 min a 37 ° C. El exceso de líquido se retiró y las cámaras revestidas se secaron al aire durante 1 hora en un ambiente estéril. Las células se suspendieron en 500 l de medio DMEM libre de suero que contiene 0,1% de BSA a una densidad final de 6 × 10
5 y se colocaron en la matriz de colágeno en un transwell que se colocó en una placa de 24 pocillos. La cámara inferior contenía 500 l de medio DMEM completo. Las células se mantuvieron en la superficie de la membrana se retiraron suavemente 24 hr después las células se sembraron y la membrana se fijaron y se tiñeron para las células que habían transmigrado a través de la matriz de colágeno en el lado opuesto de la membrana Transwell.
análisis estadísticos
Todos los datos fueron analizados utilizando el programa estadístico SPSS 20.0. Las variables cuantitativas se expresaron como media y SEM. Los siguientes análisis estadísticos se utilizaron en el estudio: el test exacto o la prueba de chi-cuadrado para la definición de la relación entre la expresión NMe2 y las características patológicas de tejido de cáncer de Fisher; ANOVA de una vía para comparar los grupos entre las células parentales y células transfectadas ya sea con un vector vehículo o un
NMe2
ADNc humano; Pearson y el análisis de correlación entre la expresión NMe2 y la diferenciación y la metástasis de las células cancerosas.
Resultados
Asociación de expresión NMe2 con características histológicas del cáncer gástrico
Se recogieron muestras quirúrgicas de 139 pacientes con adenocarcinoma gástrico. La Tabla 2 enumera la información demográfica de estos pacientes y las características histológicas de tejido de cáncer de estos pacientes. expresión NMe2 era débil o no se detecta en el tejido pobremente diferenciado, pero fue intensa en el tejido bien diferenciado a un nivel comparable con el tejido normal adyacente (Fig. 1). Un alto nivel de expresión NMe2 se asoció con una tasa significativamente menor de metástasis a los ganglios linfáticos (
p
= 0,038), pero no con el tamaño del tumor primario y la profundidad de la invasión del cáncer. Un análisis de correlación de Pearson mostró que la expresión NMe2 se asoció independientemente con tasas de diferenciación celular (r = 0,436,
p = 0,000
) y se propagó a los ganglios linfáticos locales (r = -0,281,
p
= 0,001, Tabla 1).
Una detección inmunohistoquímica de la expresión en los tejidos de NMe2 mal (a), moderadamente (C), también (e) cáncer gástrico diferenciadas y el tejido normal adyacente (G). La intensidad de la expresión en el tejido NMe2 bien diferenciado es similar a la del tejido normal. El panel B, D, F, H son Tinción de tejidos a partir de los mismos bloques de muestras (Barra = 100 micras). Estas imágenes son representativas de diapositivas de tejidos de 139 pacientes incluidos en este estudio.
Efecto de NMe2 sobre la proliferación de células de cáncer gástrico en la cultura
Para examinar aún más la asociación de expresión NMe2 con características patológicas de células de cáncer gástrico, estudiamos células de la BGC823 y MKN45 líneas de cáncer gástrico, que expresa NMe2 débilmente a un nivel en comparación con el tejido de cáncer poco diferenciado (Fig. 1). Estas células fueron transfectadas con un
NMe2
ADNc humano para sobreexpresar NMe2 medido cuantitativamente por un aumento en el producto de proteína
NMe2
ARNm (RT-PCR cuantitativa) y NMe2 (inmunofluorescencia, Fig. 2 )
A & amp.; B: perfiles de RT-PCR de
NMe2
mRNA en maqueta y
NMe2
transfectadas BGC823 y las células de cáncer gástrico MKN45 (BGC823 los padres y las células MKN45 como líneas de base [BL]). Los niveles de la
NMe2
mRNA a partir de 3 conjuntos separados de las transfecciones se cuantificó por densitometría (ANOVA, n = 3, *
p
& lt; 0,05, en comparación con la línea de base). La tinción de inmunofluorescencia de NMe2 en no transfectadas (C & amp; M), maqueta (D & amp; G) y NMe2 (E & amp; H) transfectadas BGC823 y MKN45 células (Barra = 200 micras). Una mayoría de las células transfectadas con NMe2 se tiñen positivo para la quinasa, que se tiñeron intensamente como dispersivo y /o fluorescencia verde granular principalmente en el citoplasma, pero también detectable en el núcleo. Los patrones y los niveles de expresión NMe2 difieren ligeramente en que NMe2 en BGC823 células se distribuyó de manera más uniforme en el citoplasma con la tinción de núcleo más intensivo (E inserto), mientras que NMe2 en células MKN45 era más granular en la distribución, con tinción relativamente menos núcleo (H insertar, n:. núcleo)
a continuación, se investigó el modo que sobreexpresan el crecimiento celular regulada NMe2 midiendo la ploidía del ADN y la formación de colonias de estas células. No se detectaron diferencias en la ploidía del ADN entre las células que sobreexpresan NMe2 y esas células no transfectadas y transfectadas simuladas de ambas líneas (Tabla 3 y Fig S1.), Lo que sugiere que un aumento en la expresión NMe2 no tuvo ningún efecto sobre los ciclos celulares. Sin embargo, las células que sobreexpresan NMe2-tenían una capacidad significativamente reducida para formar colonias en cultivo en comparación con el tratamiento simulado transfectadas y las células no transfectadas (Fig. 3). Esta observación fue validada por los resultados de un método de conteo de células (Fig. 3C)
MKN45 (A) y BGC823 (B) las células transfectadas con un ser humano
NMe2
cDNA o un vector de vehículo ( simulacros), y no transfectadas las células (BL) se cultivaron durante 14 días y después se analizaron cuantitativamente para los números de colonias formadas (ANOVA, n = 3, *
p
& lt; 0,05 en comparación con células parentales [BL]). (C) El número de células viables en BCG823 cultura de estos tres tipos de células de hasta 96 horas (ANOVA, n = 3 /tipo de células en cada punto de tiempo, *
p
& lt; 0,05 en comparación con células parentales ).
Efecto de NMe2 sobre la migración celular y la invasión
Seguidamente, evaluó la capacidad de las células que sobreexpresan NMe2 a migrar debido a una migración direccional es un requisito previo importante para la invasión de las células cancerosas a los tejidos circundantes. Esta migración direccional se examinó usando un ensayo de cicatrización de heridas, que mide la tasa de migración de células en el área de la lesión creada por un objeto afilado. Como se muestra en la Fig. 4A y 4B, la anchura de un área lesionada después de 48 horas en cultivos fue mayor para los
NMe2
células transfectadas que para las células no transfectadas y transfectadas simuladas. La migración lenta se encuentra en las células de ambas líneas celulares, lo que sugiere que las células que sobreexpresan NMe2 migran mucho más lento. Debido a que este ensayo de curación de la herida es semi-cuantitativo, también medir cuantitativamente la tasa de migración de las células utilizando un ensayo Transwell. De acuerdo con el ensayo de curación de la herida, las células que sobreexpresan NMe2 migraron en ~ 50% de las células no transfectadas o transfectadas simuladas (Fig. 4).
BGC823 Parental (A) y las células MKN45 (B) y las células que fueron transfectadas de forma estable, ya sea con un vector vehículo (mock) o un ser humano
NMe2
ADNc migran hacia las zonas de rascar de 48 horas (definida por líneas de puntos) después de la lesión (paneles son imágenes representativas de los 3 grupos separados de experimentos). C & amp; D, la migración de estas células también se midieron cuantitativamente en un ensayo transwell (ANOVA, n = 3 /grupo, *
p
& lt; 0,05 en comparación con células parentales [BL]).
Una disminución en la migración celular podría reducir la capacidad de estas células para invadir el tejido circundante. Para investigar esta posibilidad, medimos la invasión de las células cancerosas a la matriz de colágeno en un ensayo de cámara transwell bien establecida. BGC823 células que sobreexpresan NMe2 redujeron significativamente su capacidad de invadir una matriz de colágeno de 60% de las células no transfectadas y transfectadas simuladas (Fig. 5). La tasa de invasión se redujo de manera similar en MKN45 células transfectadas con el
NMe2
cDNA en comparación con las células parentales y las transfectadas con un vector de vehículo (Fig. 5).
Parental, maqueta y
NMe2
ADNc transfectados BCG823 (a) y se midieron las células MKN45 (B) para la invasión local a través de la matriz de colágeno en un ensayo transwell. Los paneles A (BCM823) y C (MKN45) son imágenes de resorte de las células que invadieron a través de la matriz de colágeno a la otra cara de la membrana en transwell cámaras. Los paneles B (BGC823) y D (MKN45) son resúmenes cuantitativos de múltiples experimentos (ANOVA, n = 3, *
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con las células parentales [BL]) guía empresas
Discusión
Hemos investigado la relación entre la expresión y las características de cáncer gástrico en los tejidos extraídos quirúrgicamente de pacientes NMe2 y en células cultivadas a partir de dos conocidas líneas de cáncer gástrico. El estudio es necesario porque
NMe2
se identificó inicialmente como el primer gen supresor de la metástasis, pero su capacidad de bloquear el cáncer de la invasión local y la metástasis a distancia parece ser tipo específico de célula entre los cánceres que hasta ahora se han estudiado [8- 14]. Por ejemplo, un análisis de 35 pacientes con carcinoma papilar de tiroides y 11 de los ganglios linfáticos metastásicos mostró un nivel significativamente menor de la
NME1
ARNm en los ganglios linfáticos metastásicos, mientras que
NMe2
ARNm no fue cambiado en los nodos originales tumorales y los ganglios [14], lo que sugiere funciones diferenciales de NME1 y NMe2 en la invasión del cáncer y la metástasis. Un meta-análisis de 278 pacientes con cáncer de colon, 177 con cáncer de mama, cáncer de ovario con 137 y 77 con cáncer de pulmón también encontró un nivel reducido de expresión NMe2 en el cáncer metastásico en comparación con el cáncer no metastásico [17]. Sin embargo, a pesar de una asociación negativa entre la expresión NME1 /NMe2 y la invasión del cáncer a los ganglios linfáticos y la infiltración endometrial local, expresión NME no se asoció con puntuaciones de TNM y la diferenciación de carcinoma membrana intrauterino y el cáncer cervical [16]. A continuación, ofrecemos varias líneas de evidencia que NMe2 limita la proliferación, la migración y la invasión de la matriz extracelular de células de cáncer gástrico.
En primer lugar, un mayor nivel de expresión NMe2 se encuentra tejido en bien diferenciado y menos invasivo de cáncer gástrico quirúrgicamente eliminado antes de la quimioterapia y la radioterapia en una gran cohorte de pacientes (Tabla 1 & amp; Fig. 1). La metástasis del cáncer a los ganglios linfáticos locales se encuentra con mayor frecuencia en el tejido de cáncer que tenía un bajo nivel de expresión NMe2 y esta correlación entre la expresión NMe2 y diferenciación /metástasis en estos tejidos paciente permanece después de que los datos fueron estratificados por edad, género, la tamaño del tumor primario y la profundidad de la invasión (Tabla 1 & amp; 2). Estos resultados son consistentes con un informe reciente que NMe2 se une el factor 2 de unión en el núcleo para reducir la actividad de la telomerasa [37], lo que sugiere una relación mecánica entre la expresión NMe2 y la supervivencia de las células cancerosas de repetición del telómero.
En segundo lugar, efectos examinados de sobre-expresión de NMe2 sobre las tasas de proliferación, la migración y la invasión de la matriz extracelular
in vitro Red de células de las dos líneas celulares de cáncer gástrico bien estudiados BGC823 y MKN45 [18-21]. La transfección con un humano
NMe2
cDNA resultó en un nivel de dos veces o mayor de expresión NMe2 en estas células en comparación con burlarse de células transfectadas (Fig. 2). Esta sobreexpresión NMe2 no alteró la ploidía del ADN (Tabla 3), pero se redujo significativamente la formación de colonias de estas células (Fig. 3), lo que sugiere que la sobreexpresión de NMe2 retrasa una transición de la replicación del ADN a la mitosis. Este resultado es consistente con informes anteriores que NMe2 no afecta al crecimiento de las células cancerosas cultivadas y no está asociada con el tamaño del cáncer primario implantado en animales [22-27]. Sin embargo, es incompatible con los informes de que NMe2 promueve [28,29] o reduce [30] la proliferación de otros tipos de células cancerosas. razones exactas de la discrepancia que queda por investigar más, pero estos datos sugieren efectos de células específicas del tipo de la
NMe2
gen en la patogénesis de los cánceres.
En tercer lugar, en contraste con un efecto mínimo sobre la proliferación de células de cáncer gástrico, la sobreexpresión de NMe2 da como resultado una reducción significativa en la migración celular y la invasión a través de la matriz de colágeno como se demostró en tres ensayos distintos, pero complementarios (Figs 4 y amp;. 5). Nuestros datos apoyan los resultados anteriores de los efectos inhibitorios similares sobre el cáncer de mama [8], cáncer oral de células escamosas [28] y las células de melanoma [9], aunque excepciones se observaron de nuevo en hepatocelular [13,29] y las células carcinomas colorrectales [31]. Queda por determinar si como la migración y la invasión de las células que sobreexpresan NMe2-reducidos son el resultado de una disminución de la capacidad de estas células a la proliferación.
Nuestros resultados identifican células de cáncer gástrico tan sensibles a la sobre-expresado NMe2, pero una pregunta crítica sigue siendo como lo regula estas diversas actividades NMe2 entre los diferentes tipos de células cancerosas. Un mecanismo potencial es que una actividad NMe2 depende de las moléculas arriba y aguas abajo que interactúan con NMe2 en un tipo celular dado. moléculas múltiples han sido previamente identificado para interactuar o regular NMe2, tales como EGFR,
c-erbB-2
,
c-erbB-3
y receptor de esteroides sexuales en los carcinomas de ovario [32]. Plakoglobin se informó de interactuar con NMe2 para promover su expresión en células de lengua humana carcinoma de células escamosas [33]. NMe2 también se encontró para interactuar con MDM2 (Mouse doble minuto 2 homólogo) para reducir la motilidad de células de carcinoma renal [34]. MDM2 es un ubiquitina-proteína ligasa E3 y sirve como un regulador negativo del supresor de tumor p53. La relación entre el
NMe2
de genes y los genes de
myc
familia parece ser más complicado. Productos de la
NME1
y
NMe2
genes se han sugerido para ser el de aguas abajo de la
myc
vía de reglamentación c- [7] y que participan en la regulación a la baja de función cdc42 en neuroblastoma [35]. NMe2 También se ha informado de interactuar con el ADN G-quadruplex en el elemento hipersensible nucleasa de la
c-myc
promotor para inducir c-myc expresión [36]. Un enfoque de biología de sistemas para examinar estas vías específicas en lugar de moléculas individuales que sean necesarios para diseccionar las funciones de la
NMe2
gen y su producto en diferentes tipos de cánceres.
En resumen, hemos demostrado que una sobreexpresión de NMe2 reduce la migración y la invasión de células de cáncer gástrico a la matriz celular
in vitro
. Como resultado, la expresión NMe2 se asocia con la histología bien diferenciado y menos invasitve de cáncer gástrico. Estos resultados sugieren que el
NMe2
gen y su producto puede servir como un marcador potencial para predecir la invasividad del cáncer gástrico y también como una diana terapéutica que puede ser de hasta reguladas a través de la terapia génica.
Apoyo a la Información
S1 Fig. Efecto de la sobreexpresión NMe2 en el ciclo celular de células de cáncer gástrico. México La ploidía del ADN de las células transfectadas con
NMe2
cDNA se analizó por citometría de flujo utilizando un kit comercial según las instrucciones del fabricante. Los paneles A-C fueron para las células BCG823 parentales y las transfectadas con el
NMe2
ADNc o vector. Los paneles D-F fueron para MKN45 células con los mismos tratamientos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0115968.s001 gratis (DOC)