Extracto
Los estudios recientes han demostrado que la señalización Notch está implicada en muchos tipos de cáncer, incluyendo los carcinomas de células escamosas orales ( OSCCs). Sin embargo, el papel de la señalización de Notch en el microambiente tumoral no se entiende todavía completamente. En este estudio, se investigó el papel de los NOTCH3 señalización en cáncer asociado fibroblastos (CAF) en OSCCs. El estudio inmunohistoquímico de 93 casos CCCA lengua humana indicó que aproximadamente un tercio de OSCCs mostró expresión NOTCH3 en los CAF, y que esta expresión se correlacionó significativamente con tumores de tamaño. En el estudio in vitro mostraron que las líneas celulares CCCA, especialmente células HO1-N-1 estimularon la expresión NOTCH3 en los fibroblastos normales humanos dérmicos (NHDFs) a través de contacto directo célula a célula. El análisis inmunohistoquímico y morfométrico utilizando muestras CCCA humanos demostró que la expresión NOTCH3 en los CAF correlacionó significativamente con la densidad de micro-recipiente en el estroma del cáncer. En ensayos de angiogénesis in vitro que implican co-cultivo de NHDFs con HO1-N-1 y las células endoteliales umbilicales humanas (HUVECs) y desmontables NOTCH3 en NHDFs utilizando siRNA, demostraron que las células HO1-N-1 promueven significativamente la formación de tubo depende de NOTCH3-expresión en NHDFs. Por otra parte, la expresión NOTCH3 en los CAF se relaciona con mal pronóstico de los pacientes con COCE. Este trabajo proporciona una nueva visión sobre el papel de la señalización Notch en los CAF asociados con la angiogénesis tumoral y la posibilidad de terapia molecular NOTCH3 enfocadas, a OSCCs
Visto:. Kayamori K, Katsube Ki, Sakamoto K, Ohyama Y, Hirai H, Yukimori A, et al. (2016) NOTCH3 es inducida en fibroblastos asociados con el cáncer y promueve la angiogénesis en el carcinoma de células escamosas oral. PLoS ONE 11 (4): e0154112. doi: 10.1371 /journal.pone.0154112
Editor: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital de & amp; Centro de Informes, ARABIA SAUDITA
Recibido: 28 Diciembre, 2015; Aceptado: 9 Abril de 2016; Publicado: 28 de abril 2016
Derechos de Autor © 2016 Kayamori et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel y su archivo de información de apoyo
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia: subvención-en-ayudas para jóvenes científicos (B) (26861543 KAKENHI a Kou Kayamori ) e Investigación Científica (C) (20233760 a Ken-ichi Katsube). Este trabajo también fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia: subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (A) (25253098 KAKENHI de Akira Yamaguchi)
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no compiten existen intereses.
Introducción
Cabeza y cuello deriva del tracto aerodigestivo superior que incluye la cavidad nasal, senos paranasales, cavidad oral, faringe y la laringe. Punto de vista histopatológico, el tumor maligno predominante en cáncer de cabeza y cuello es el carcinoma de células escamosas (SCC).
oral SCC (CCCA) es el tipo más común de cáncer de cabeza y cuello. De acuerdo con las últimas estimaciones de GLOBOCAN, aproximadamente 300.000 casos nuevos de cáncer de labio /cavidad bucal se diagnosticaron en 2012 en todo el mundo [1]. La tasa de supervivencia a 5 años de los pacientes con COCE todavía oscila entre el 40 y el 60% [2, 3]. Investigación sobre el mecanismo molecular que regula serán necesarios comportamientos malignos del CCCA para el desarrollo de enfoques terapéuticos y mejora del mal pronóstico
.
estroma del cáncer se compone de varios tipos de células, incluyendo fibroblastos, células inmunes, pericitos y endotelial Células. Estudios recientes han demostrado que estas células y sus productos establecen microambientes adecuadas para la proliferación del cáncer, la invasión, la angiogénesis, metástasis, y la quimiorresistencia [4, 5]. En particular, los fibroblastos, asociados con el cáncer (CAF), que son los principales componentes del estroma cáncer, desempeñar un papel crucial en la progresión tumoral en diversos tipos de cáncer [6]. Se cree que su origen sea cualquiera de los fibroblastos del tejido residente, células madre mesenquimales reclutados desde la médula ósea o células cancerosas que se sometieron a la transición epitelio-mesenquimal [7]. Varios estudios han informado de que los CAF estimulan la invasión de células de cáncer [8-10] o la proliferación [11] y se correlacionan con un mal pronóstico en OSCCs [12, 13].
señalización Notch es una vía conservadas evolutivamente que regula la proliferación celular , la apoptosis y la diferenciación [14]. la señalización de Notch se inicia por la unión de Notch-ligando a su receptor, que está mediada por el contacto de célula a célula. En los seres humanos, hay cuatro receptores (NOTCH1-4), y cinco ligandos (Jagged1, 2 y Dll1, 3 y 4). La unión del ligando a su receptor conduce a la escisión y liberación del dominio intracelular del receptor Notch (NICD). NICD se transloca desde la membrana plasmática al núcleo, que inicia la transcripción de los genes diana NOTCH [15]. Estudios recientes han demostrado que la desregulación de la señalización de Notch está implicada en diversas enfermedades, incluyendo varios tipos de cáncer [16, 17]. Las alteraciones de la señalización de Notch en las células cancerosas incluyen ganancia o pérdida de función de las mutaciones, y el receptor /ligando sobreexpresión [18]. Hemos demostrado anteriormente regulación a la baja NOTCH1 en células de cáncer en COCE por microarrays estudios inmunohistoquímicos y utilizando muestras CCCA humanos [19], y estudios recientes han indicado que NOTCH1 actúa como un supresor tumoral en el COCE patogénesis [20-22].
Aunque ambos CAF y el juego de señalización Notch un papel importante en la progresión del cáncer, la señalización Notch en los CAF, a diferencia de las células cancerosas, y su contribución al comportamiento maligno no ha sido completamente aclarada. NOTCH3 se expresa fisiológicamente en las células musculares lisas de las arterias pequeñas y regula la diferenciación y maduración de estas células. La pérdida de función de la mutación de NOTCH3 se ha demostrado que causa la arteriopatía cerebral autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADSIL) que se caracteriza por la degeneración o pérdida de células musculares lisas vasculares de los medios de comunicación, el engrosamiento de la pared del vaso y depósitos de materiales granulares osmiófilo (GOM) cerca de la superficie celular de las células musculares lisas o pericitos [23]. Estudios recientes mostraron que NOTCH3 es inducido en fibroblastos por contacto directo de célula a célula con HUVECs y promueve la formación de vasos [24, 25]. Estos hallazgos sugieren que NOTCH3 tiene un papel esencial en la regulación de la angiogénesis.
En este estudio, nos centramos en el análisis de NOTCH3 en CAF para investigar su contribución a la progresión de la CCCA. Hemos demostrado la expresión NOTCH3 en los CAF por el estudio inmunohistoquímico de muestras de 93 casos de COCE lengua humana y se encontró que los CAF NOTCH3-positivas promueven la angiogénesis tumoral en presencia de varias líneas celulares de cáncer de
in vitro
. Por otra parte, esta inducción NOTCH3 en los CAF correlacionada con una baja supervivencia de los pacientes con COCE. Estos resultados sugieren la utilidad de la terapia molecular NOTCH3 enfocadas, a OSCCs.
Material y Métodos
muestras clínicas
lengua primaria muestras de carcinoma de células escamosas se obtuvieron de 93 pacientes que tenían sido tratados en el hospital Dental de Tokio Universidad de Medicina y Odontología. También se recogieron nueve SCC gingivales primarias, 10 y 9 bucal CCE CCE de suelo de la boca. Todos los tejidos se fijaron con formalina al 10% tamponada neutra e incluidos en parafina de acuerdo con los protocolos de laboratorio de rutina. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de conformidad con la Declaración de Helsinki, modificado y aprobado por el comité de ética de la Universidad de Tokio Médica y Dental (Registro No. 1063). Se utilizó resecado quirúrgicamente, fijado en formol e tejidos CCCA humanos incluidos en parafina para el estudio inmunohistoquímico y. A pesar de que el consentimiento informado por escrito, no se obtuvo de los pacientes, el comité de ética aprobó dispensa del consentimiento informado específico de conformidad con las normas éticas modificadas para los estudios clínicos proporcionados por el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón (31 de julio, 2008). Este plan de investigación se dio a conocer en un formato de póster en la consulta externa del departamento de cirugía oral para asegurar que los pacientes tuvieron la oportunidad de rechazar el uso de la investigación de sus muestras patológicas, que sustituyeron para el consentimiento informado por escrito, y el comité de ética aprobó este procedimiento de consentimiento.
Inmunoticción
Para la tinción inmunohistoquímica, se utilizaron secciones de tejido fijado en formol e incluidos en parafina humanos CCCA. Los anticuerpos primarios utilizados fueron los siguientes: anti-NOTCH3, policlonal de conejo, 1: 200 (ab23426, Abcam, CA, EE.UU.); anti-SMA, monoclonal de ratón, 1: 100 (M0851, Dako, Glostrup, Suecia). La recuperación del antígeno se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante. EnVision + Dual Link (Dako) se utilizó para el anticuerpo secundario, y la coloración se llevó a cabo con sustrato diamino-bencidina. Por inmunofluorescencia doble tinción, anti-NOTCH3, 1: 200 (Abcam), SMA, 1: 100 (monoclonal de ratón, M0851, Dako o monoclonales de conejo, clonación SP-171, Primavera Bioscinece, CA, EE.UU.), CD34, 1: 100 ( monoclonal de ratón, NCL-L-FIN, Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania) y citoqueratina, 1: 100 (monoclonal de ratón, clon AE1 /AE3, M3515, Dako) se utilizó como anticuerpo primario. Para la recuperación de antígenos, las secciones se trataron con tampón Tris (pH = 7,4) que contiene 0,1 mg /ml de tripsina durante 30 min a 37 ° C para el anticuerpo CD34. Alexa Fluor 488 de IgG de cabra anti-conejo (A11008, Invitrogen, CA, EE.UU.) y Alexa Fluor 594 de cabra anti-IgG de ratón (A11005, Invitrogen) se utilizó como anticuerpo secundario. DAPI se utilizó para la tinción nuclear. Las imágenes immunofluoroscent fueron capturados y analizados mediante Axioskop2 además microscopio (Carl Zeiss, Jena, Alemania).
Evaluación del análisis inmunohistoquímicos
Los resultados de inmunohistoquímica para NOTCH3 y α-SMA se evalúa en función de la intensidad de la tinción y la proporción de células fibroblásticas positivos en el estroma del cáncer por dos patólogos sin conocimiento previo de clinicopathological datos del paciente. intensidad de la tinción se dividió en cuatro grupos: negativos, débiles, moderadas y fuertes. Los casos con intensidad moderada o fuerte en más del 30% de los fibroblastos en el estroma del cáncer se consideran positivos para la expresión de cada proteína.
Cell Cultura y
Los siguientes ocho escamosas de cabeza y cuello se utilizaron las líneas celulares de carcinoma de células, HO1-N-1, SAS, BHY, Ca9-22, HSC3, HSC4, HSC5 y SKN3. Estas líneas se derivaron de la cavidad oral a excepción de HSC5 que se deriva de seno maxilar. Seis líneas celulares de cáncer se derivaron de las lesiones no orales, HeLa de SCC de cuello uterino, A549 de adenocarcinoma de pulmón, MCF-7 de adenocarcinoma de mama, MKN74 de adenocarcinoma gástrico, HCT-15 de adenocarcinoma de colon y Panc-1 de adenocarcinoma de páncreas, eran También usado. Todas las líneas celulares de cáncer se cultivaron como se describe antes [26]. HO1-N-1, SAS, Ca9-22, HSC3 y HSC5, y SKN3 se adquirieron de Japanese Collection de Recursos Biológicos de investigación (Osaka, Japón). BHY fue proporcionada por el Dr. Masato Okamoto (TELLA Inc, Tokio, Japón). HSC4 fue establecido por el Dr. Momose en el departamento de cirugía oral y maxilofacial en Tokio Médico y Dental de la Universidad como se describe en el informe anterior [27]. Panc-1 se adquirió de American Type Culture Collection (ATCC). HeLa, A549, MKN74 y HCT-15 se adquirieron de RIKEN de bio Center (Tsukuba, Japón). MCF-7 fue proporcionada por el Centro de Recursos de la célula para la Investigación Biomédica (Universidad de Tohoku, Miyagi, Japón). fibroblastos humanos normales primarios dérmicos (NHDFs) de un donante adulto se adquirieron de PromoCell (C-12302, Heidelberg, Alemania) y células primarias humanas endoteliales de vena umbilical (HUVEC) fueron adquiridos de Lonza (CC-2517, Tokio, Japón).
Los análisis de co-cultivo de células cancerosas y NHDFs
NHDFs (5 × 10
4 células /pocillo) se sembraron en placas de 24 pocillos, se incubaron en medio de crecimiento de fibroblastos 2 Kit (C-23120 , PromoCell) durante 48 h, y luego cocultivadas con varias líneas celulares de cáncer (5 × 10
3 células /pocillo) por incubación en α-MEM durante 72 h. Posteriormente, los NHDFs se aislaron utilizando el método siguiente y se evaluaron usando el análisis de PCR en tiempo real. Para el análisis de transferencia Western, NHDFs (20 × 10
5 células /pocillo) y líneas celulares de cáncer (2 × 10
4 células /pocillo) se cocultured utilizando placas de 6 pocillos.
Aislamiento NHDF de cocultivos
NHDFs fueron aisladas de cocultivos mediante el uso de un sistema de separación de células activadas magnética (MACS) con microperlas anti-fibroblastos (130-050-601, Miltenyi Biotec, Auburn, CA, EE.UU.) y una columna de MS ( 130-042-201, Miltenyi Biotec) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
siRNA transfección
Antes de cocultivo, NHDFs fueron transfectadas con siRNA para NOTCH3 humano usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Stealth siRNA para NOTCH3 humana se adquirió de Invitrogen. La secuencia de la cadena positiva del ARN de doble cadena fue 5'-UCAAUGCUGUGGAUGAGCUUGGGAA-3 '.
Evaluación de microvasos
La densidad microvascular (MVD) de las muestras CCCA humanos se calculó para dos grupos, el SMA (+) NOTCH3 (-) CAF grupo y el NOTCH3 SMA (+) (+) CAF grupo. Mediante el uso de la tinción de doble inmunofluorescencia para la AME o NOTCH3 y CD34, el número de buques pequeños CD34-positivas en la SMA (+) se evaluó estroma del cáncer de fibroblastos en el primer grupo, y el número de vasos pequeños CD34-positivas en NOTCH3 (+) estroma cáncer fibroblástica se contó en el último grupo. Antes de contar el número de microvasos, lo primero que examinó cada sección a bajo aumento de potencia para identificar el área con mayor densidad de microvasos, y se seleccionaron tres campos en cada caso. Se tomaron tres micrografías a gran aumento (x200). El número de buques pequeños CD34-positivo se contaron y el SMA (+) /NOTCH3 (+) Sup fibroblástica se analizó cuantitativamente usando un microscopio y además Axioskop2 AxioVsion rel 4,8 software (Zeiss). recuento total de microvasos CD34-positivas por su cuantificación total de SMA (+) /NOTCH3 (+) Sup fibroblástica de tres imágenes se calculó y se define como el Ministerio del Interior de cada caso.
in vitro Ensayo de angiogénesis
Un
in vitro
ensayo de co-cultivo organotípicos del endotelio en fibroblastos se modificó como se informó anteriormente [28]. En primer lugar (Día 0), NHDFs se sembraron en placas de 24 pocillos (5,0 x 10
4 células /pocillo) y se cultivaron en Medio de Crecimiento de Fibroblastos durante 48 h. Entonces, siRNA para NOTCH3 humano se transfectó en las NHDFs de acuerdo con el método anteriormente descrito. El día siguiente (día 3) células cancerosas A549 (6,0 × 10
3 células /pocillo), HO1-N-1 o y HUVECs (3,0 × 10
4 células /pocillo) se cocultivaron con las NHDFs siRNA tratados en medio de crecimiento de células endoteliales. El medio de cultivo fue reemplazado cada dos días. En el día 9, las células se fijaron y inmunohistoquímicamente tratados con el anticuerpo anti-CD31 (monoclonal de ratón, 1: 100, NCL-CD31-1A10, Leica Biosystems, Newcastle, Reino Unido) y alcalina anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa (WP20006, Invitrogen) y la señal se visualizó utilizando el sustrato BCIP /NBT (11-681-45-001, Roche). Cinco imágenes fotográficas con la red capilar CD31-positivo más alto en cada pocillo fueron capturados mediante el uso de un microscopio invertido (ECLIPSE TS100, Nikon, Tokio, Japón). El área de la red capilar de CD31-positivo se analizó cuantitativamente utilizando el software NIH imagen J.
Efecto de NOTCH3 de Proliferación Celular
Para examinar el efecto de NOTCH3 sobre la proliferación de la línea celular COCE, HO1-N- se sembraron 1 (2,0 × 10
3 células /pocillo) en una placa de 96 pocillos recubierta con un humano NOTCH3 Fc quimera recombinante (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.). La proliferación celular se midió usando el Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japón) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Western Blotting
Western blot se llevó a cabo utilizando el método estándar como se describe antes [ ,,,0],19]. Anti-Notch3 (D11B8, Señalización Celular, MA, EE.UU.), alfa actina de músculo liso (ab32575, Abcam) y GAPDH (D16H11, Señalización Celular) se utilizaron como anticuerpo primario.
Los análisis en tiempo real PCR cuantitativa
ARN fue extraído de NHDFs, y transcrito de forma inversa en ADNc tal como se describe antes [26]. Real-Time PCR se realizó con un sistema Light Cycler (Roche Diagnostics). expresión relativa se calculó por el comparativo C
método T usando GAPDH como control interno. Las secuencias de los cebadores de PCR fueron descritas en estudios anteriores (
NOTCH1
y
NOTCH3
[29],
NOTCH2
,
Notch4
y
HEY1
[19],
α-SMA
[25], y
GAPDH
[30]).
análisis estadísticos
Correlación entre NOTCH3 expresión en los CAF y parámetros clínico se analizó utilizando el chi-cuadrado o la prueba exacta de Fischer. En
in vitro
ensayos, las diferencias en los valores medios entre los dos grupos se compararon mediante la prueba t de Student, mientras que, las diferencias en los valores medios entre varios grupos se analizaron mediante un ANOVA de una vía seguido de -múltiple comparación con los métodos de Tukey. tasa de supervivencia global se estimó de acuerdo con el método de Kaplan-Meier y la significación estadística se analizó mediante la prueba de log-rank. tiempos de supervivencia global se calcularon a partir de la fecha de diagnóstico patológico inicial a la fecha de la muerte.
P
-valores inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Ekuseru-Toukei 2015 (Información para la Investigación Social Survey, Tokio, Japón).
Resultados
Expresión NOTCH3 en los CAF en el microambiente tumoral del COCE
Para investigar la distribución de NOTCH3 que expresan las células en el microambiente del tumor, se analizó la expresión inmunohistoquímica NOTCH3 en muestras quirúrgicas de 93 casos de COCE lengua. Los fibroblastos en estroma cáncer, especialmente las adyacentes a la periferia del tumor, mostraron tinción positiva para NOTCH3 (31 de 93 casos, 33,3%, Fig 1A y 1B). Alrededor del 90% (82 de 93 casos, 88,2%) de los casos mostró débil expresión NOTCH3 negativo o de vez en cuando en las células cancerosas. Este último resultado fue compatible con nuestro anterior estudio cDNA microarray utilizando muestras CCCA humanos [19]. Para caracterizar adicionalmente los fibroblastos NOTCH3 positivos, se realizó la tinción inmunohistoquímica para la α-SMA, que es un marcador de cáncer asociado fibroblastos (CAF). Las secciones seriadas de los tumores mostraron que los fibroblastos NOTCH3-positivas expresaron α-SMA (Fig 1C). Doble stainig immunofluorecent demostró la co-localización de NOTCH3 y α-SMA en fibroblastos (Fig 1D-1F). Como se resume en la Tabla 1, se observaron α-SMA fibroblastos positivos, lo que podría considerarse como CAF, en el estroma cáncer en 64 de 93 muestras (68,8%). Los 29 casos restantes no mostraron reacción fibroblástica alrededor de los nidos de cáncer invasor y fueron negativos para α-SMA, aunque se observó una reacción inflamatoria prominente. fibroblastos NOTCH3-positivas que fueron negativos para la α-SMA no se observaron en todo caso
A:. Histología de frente invasivo del tumor. H & amp; E tinción. Barra de escala, 100μm. B: Distribución de células de fibroblasto NOTCH3-positivo. C: Distribución de células de fibroblasto alfa-SMA-positivas. Las células teñidas de color marrón en B y C representan las células positivas para cada anticuerpo. Las flechas en A, B y C indican capa de vasos sanguíneos, que es un control interno positivo de cada anticuerpo. D, E, F: el análisis inmunohistoquímico dual para α-SMA (rojo) y NOTCH3 (verde). se observó co-localización de α-SMA y NOTCH3 en los fibroblastos en el estroma cáncer. Barra de escala, 50 micras. Ca, las células cancerosas. Las líneas de puntos en A-F indican la interfaz de nidos de cáncer y estroma. G: Curva de Kaplan-Meier para la supervivencia global en relación con la expresión NOTCH3 en los CAF utilizando CCCA 93 casos humanos. Se utilizó la prueba de log-rank para calcular la significación.
A pesar de que el sitio más frecuente para la participación CCCA es la lengua, que además inmunohistoquímica determinó la expresión NOTCH3 en los CAF utilizando casos CCCA se produjo en la encía humana, mucosa bucal , y el piso de la boca. Estos resultados mostraron que los CAF NOTCH3 positivos aparecieron en los CE gingivales (4 de 9 casos, 44,4%), SCC bucales (3 sobre 10cases, 30%), y los CE del piso de la boca (3 de 9 casos, 33,3 %) (figura S1). No había mucha diferencia en la frecuencia de los CAF NOTCH3-positivas en estroma tumoral entre la lengua y otra SCC SCC.
Estos resultados sugieren que hay OSCCs con CAF NOTCH3-positivas y OSCCs con CAF NOTCH3 negativo en su estroma tumoral.
significado clínico-patológico de expresión NOTCH3 en los CAF en OSCCs
Para caracterizar la importancia de la presencia de CAF NOTCH3-positivas en COCE, se investigó la correlación entre la expresión NOTCH3 en los CAF y clínico características -pathological en los casos lengua CCCA ha descrito anteriormente. Como se muestra en la Tabla 2, OSCCs con CAF NOTCH3-positivos están asociados con el tamaño significativamente mayor del tumor (p = 0,0292) y la metástasis de los ganglios linfáticos (P = 0,0023) en comparación con OSCCs sin CAF NOTCH3-positivo. No hubo correlación entre la expresión NOTCH3 en los CAF y la edad, el sexo o la diferenciación histológica de SCC. También se evaluó la correlación entre la expresión NOTCH3 en los CAF y el pronóstico de los pacientes con COCE 93 de lengüeta. Kaplan-Meier de supervivencia demostrado que los pacientes con CAF NOTCH3-positivos tenían un peor pronóstico que los que no los CAF NOTCH3-positivo (figura 1G).
OSCCs Humanos estimular la expresión en fibroblastos NOTCH3
Para confirmar estos resultados inmunohistoquímicos, se realizó un
in vitro
experimentos utilizando líneas celulares cocultivadas CCCA y los fibroblastos dérmicos humanos primarios normales (NHDFs). Después de co-cultivo, los NHDFs se separaron usando microperlas anti-fibroblastos como se describe en un informe anterior [31]. El análisis de transferencia Western de estas NHDFs indicó que su cocultivo con OSCCs, especialmente con células HO1-N-1, estimula la expresión NOTCH3 en los NHDFs comparación con la expresión basal cuando los NHDFs se cultivaron solo (Fig 2A). Por otra parte, los niveles de proteína α-SMA también fueron más altos en NHDFs cocultured con OSCCs comparación con NHDFs de control (Figura 2A). A continuación, analizó más NHDF /COCE co-cultivo utilizando células Ho1-N-1 y NHDFs. tinción de inmunofluorescencia doble de NOTCH3 y queratina en este modelo de co-cultivo mostró que los haces de NHDFs NOTCH3 positivos rodeados nidos HO1-N-1 de cáncer de queratina-positivo (Figura 2B), que se parecía a la distribución de los fibroblastos NOTCH3 positivo alrededor de los nidos de cáncer en el CCCA muestras humanas. Por otra parte, la tinción de inmunofluorescencia doble para NOTCH3 y α-SMA mostró que estos NHDFs NOTCH3-positivas también co-expresan α-SMA (Figura 2C). Western Blot y análisis en tiempo real PCR cuantitativa de los NHDFs separados de esta co-cultivo mostraron que la expresión NOTCH3 se upregulated significativamente tanto en la proteína y el nivel de ARNm en el NHDFs cocultivaron con HO1-N-1, en comparación con los NHDFs cultivadas solas (Fig 2D y 2E; siCtrl). La expresión de mRNA HEY1, un objetivo corriente abajo de la muesca, también fue significativamente mayor en NHDFs co-cultivadas con HO1-N-1 en comparación con su expresión en ausencia de HO1-N-1 (Fig 2F; siCtrl). Además, la expresión de α-SMA en NHDFs cocultivaron con HO1-N-1 también se incrementó tanto en la proteína y los niveles de mRNA comparación con el cultivo en ausencia de HO1-N-1 (Fig 2D-2F; siCtrl). La inducción de HEY1 y α-SMA por cocultivo se inhibió significativamente en NHDFs transfectadas con siRNA para NOTCH3 (Sin3) en comparación con las células transfectadas con ARNsi de control (siCtrl) (Fig 2D, 2F y 2G). Este Sin3 suprimió significativamente la expresión NOTCH3 comparación con siCtrl (Fig 2D y 2E). En conjunto, estos datos indican que OSCCs tienen el potencial de inducir la actividad de Notch mediante la estimulación de la expresión de NOTCH3 en NHDFs, y que la expresión NOTCH3 regula la expresión α-SMA. Se observó la inducción de arriba NOTCH3 en NHDFs cuando HO1-N-1 y NHDFs se cocultivaron en un sistema de contacto directo. La separación de co-cultivo utilizando un transwell porosa no indujo la regulación positiva de
NOTCH3
expresión en NHDFs (Figura 2H). Este resultado implica que la señalización a través del contacto célula a célula entre las células cancerosas y fibroblastos juxtacrine es esencial para la inducción de la expresión NOTCH3 en fibroblastos. Por otra parte, el nivel de expresión de ARNm de NOTCH1 o NOTCH2 en NHDFs cocultured en un sistema de contacto directo con las células HO1-N-1 no mostraron cambios significativos en comparación con los NHDFs cultivadas solas. expresión Notch4 no se detectó en este sistema (Fig 2I). Estos resultados sugieren que OSCCs estimular específicamente la expresión en fibroblastos NOTCH3
A: NHDFs se cultivaron solo (ctl; control) o cocultivaron con líneas de células SCC oral y maxilares representados.. 3 días después de cocultivo, NHDFs se aislaron de esta co-cultivo mediante el uso de microperlas anti-fibroblastos para análisis de transferencia Western. B y C: Immunofluorostainig mediante cocultivo con HO1-N-1 y NHDFs. Cultura de NHDFs solo se utilizó como control. Se observaron los haces de NHDFs NOTCH3-positivo (verde) alrededor de los nidos AE1 /AE3-influjo positivo HO1-N-1 de cáncer (rojo) (B). NOTCH3 doble y NHDFs α-SMA-positivas fueron intervenidos entre nidos HO1-N-1 de cáncer. Ca, nidos HO1-N-1 de cáncer. Las líneas de puntos muestran la interfaz de HO1-N-1 nidos de cáncer y NHDFs. (DO). Barra de escala, 100μm. Los núcleos se contratiñeron por DAPI. D-G: NHDFs transfectadas con ARNsi de control negativo (siCtrl) o siRNA para NOTCH3 (Sin3) se cultivó solo o cocultivaron con células HO1-N-1. 3 días después de cocultivo, NHDFs se aislaron de esta co-cultivo y se sometieron a transferencia de Western (D) y qPCR análisis para medir NOTCH3 (E), HEY1 (F), α-SMA (G). H: NHDFs se cultivaron solo (control), o directamente cocultivaron con células HO1-N-1, o cocultivaron con células HO1-N-1 transwell separados. 3 días después del cultivo, NHDFs se aislaron y se sometió a análisis de qPCR. I: qPCR para medir cada expresión del ARNm de Notch en NHDFs aisladas de co-cultivo con células HO1-N-1. ND, no detectado. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0.01.
La angiogénesis NOTCH3 Expresado en CAF Regula
El estudio inmunohistoquímico utilizando muestras CCCA humanos indicaron que la expresión NOTCH3 en los CAF se correlacionaron significativamente con la T-etapa (tamaño del tumor). Este resultado sugiere que los CAF NOTCH3-positivo promueven el crecimiento del tumor mediante la estimulación de la proliferación de células tumorales y /o mediante la mejora de la angiogénesis. Para investigar estas posibilidades, se realizó primero un
ensayo in vitro en
la proliferación celular utilizando células HO1-N-1, que expresa el ligando JAG1 NOTCH como se determina por transferencia Western (Fig 3A). El tratamiento con un NOTCH3-Fc /quimera humana recombinante, que puede unirse a su ligando, JAG1, no afectó HO1-N-1 proliferación (Fig 3B)
A:. JAGGED1 expresión en varias líneas celulares de cáncer orales se analizó por transferencia Western. B: El efecto de NOTCH3 sobre la proliferación celular. La proliferación de las células Ho1-N-1 con o sin tratamiento quimera NOTCH3-Fc humana recombinante se controló durante 72hr.
A continuación, se realizó la tinción de inmunofluorescencia doble de NOTCH3 y CD34 (un marcador de las células endoteliales ) para determinar si la expresión NOTCH3 en CAF se asocia con la densidad de los vasos sanguíneos en las muestras de CCCA lengua humana. densidad Micro-buque en el área invasivo tumor fue significativamente mayor en el grupo CAF NOTCH3 (+) en comparación con el NOTCH3 (-) grupo CAF (Fig 4A y 4B). Este resultado sugiere que NOTCH3 (+) CAF promover la angiogénesis. Para investigar más a fondo el mecanismo de la angiogénesis tales, se realizó un ensayo de angiogénesis organotípicos por co-cultivo de células HO1-N-1, HUVEC y NHDFs para determinar si NOTCH3 inducida por el CCCA en NHDFs facilita la formación de vasos. tinción de inmunofluorescencia de esta co-cultivo mostró una malla CD31-positivo formado por HUVEC y NHDFs NOTCH3 positivo alrededor de los nidos de células cancerosas (Figura 4C). El análisis de transferencia Western indicó que NHDFs cocultivaron con HUVECs solo, en la ausencia de células HO1-N-1 mostró inducción NOTCH3 en comparación con los NHDFs de control. Se observaron niveles mucho más altos de expresión en NOTCH3 NHDFs que fueron cocultivadas con HUVECs junto con HO1-N-1 en las células (figura 4D). Para evaluar la formación de tubos en este ensayo, visualizamos células CD31-positivas por inmunotinción. En comparación con el grupo de control, la formación de tubos CD31-positivos por HUVECs en presencia de NHDFs y controlar siRNA se incrementó significativamente por co-cultivo con HO1-N-1. Esta formación de tubos se suprimió significativamente cuando los NHDFs se transfectaron con Sin3 (Fig 4E y 4F). Estos resultados sugieren que OSCCs promover la angiogénesis mediante la inducción de la expresión NOTCH3 en CAF
A y B: Comparación de la densidad de los microvasos (MVD) entre NOTCH3 (-) CAF CAF y casos NOTCH3 (+).. Immunofluorostaining de α-SMA (verde), NOTCH3 (verde) y CD34 (rojo) usando muestras CCCA lengua humana. Ca, nidos de cáncer. Las líneas de puntos muestran la interfaz de los nidos de cáncer y estroma. Las flechas demostraron la microvasos CD34-positivo. Barra de escala, 50 micras. Los núcleos se contratiñeron por DAPI (A). Evaluación cuantitativa de MVD entre estos dos grupos (B). C-F:
in vitro
angiogénesis ensayo con células cocultured HO1-N-1, HUVEC y siRNA NHDFs transfectadas. Immunofluorostaining para NOTCH3 (verde) y CD31 (rojo). Ca, nidos HO1-N-1 de cáncer. Las líneas de puntos indican el margen de los nidos de cáncer HO1-N-1. Barra de escala, 100μm. Los núcleos se contratiñeron por DAPI (C). NHDFs aisladas de esta co-cultivo se sometieron a transferencia de Western (D). imagen representativa de la formación del tubo por HUVECs en cada condición. Barra de escala, 100μm (E). La evaluación cuantitativa de la zona de formación del tubo (zona de CD31-positivo) en cada condición (F). siCtrl, ARNsi de control negativo. SiN3, siRNA para NOTCH3. **
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Para investigar si la inducción NOTCH3 en fibroblastos es una propiedad única de OSCCs, que cocultured NHDFs con líneas celulares derivadas de cáncer de varios órganos incluyendo cuello uterino, pulmón, mama, estómago, colon y páncreas. análisis de transferencia de Western indicó que las células A549, que son una línea celular de adenocarcinoma de pulmón, estimularon la expresión de NOTCH3 en NHDFs a un nivel que fue similar a la inducida por HO1-N-1 (Fig 5A). Un
in vitro
angiogénesis ensayo mostró que las células A549 inducidas de manera significativa la formación de tubos en HUVECs cuando se co-cultivaron con NHDFs y que esta malla se redujo significativamente por caída NOTCH3 en NHDFs (Fig 5B y 5C). El análisis de transferencia Western de NHDFs aislado del ensayo de angiogénesis reveló resultados similares a los obtenidos cuando NHDFs cocultivaron con HUVECs y-1-HO1 N fueron analizados (Fig 5D). Estos resultados indican que las células cancerosas que no sean OSCC pueden inducir NOTCH3 en CAF y promover la angiogénesis
A:. NHDFs se cocultivaron con varias líneas celulares de cáncer derivadas de lesiones no orales. 3 días después de cocultivo, NHDFS fueron aisladas de esta co-cultivo y se sometió a análisis de transferencia Western para detectar NOTCH3 y α-SMA. B-D: ensayo de angiogénesis in vitro cocultured con A549, NHDFs HUVEC y siRNA transfectadas. Imágenes representativas de la formación del tubo (B) y su evaluación cuantitativa (C) en cada condición. Barra de escala, 100μm. **
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