Extracto
El cáncer de ovario es la causa más común de muerte por neoplasia ginecológica. La desregulación de p53 y /o las vías de apoptosis p73 asociada a contribuir a la resistencia a base de platino en el cáncer de ovario. NOXA, un BH3 de sólo proteína pro-apoptótica, se identifica como un objetivo de la transcripción de p53 y /o p73. En este estudio, se encontró que existen variantes genéticas de proteínas Bcl-2 entre las células de cáncer de ovario cisplatino-sensibles y resistentes, y las respuestas de NOXA y Bax a cisplatino están regulados principalmente por p53. Se evaluó adicionalmente el efecto de NOXA en cisplatino. NOXA induce la apoptosis y sensibiliza las células A2780s y SKOV3 al cisplatino
in vitro
y
in vivo
. Los efectos fueron mediados por la expresión de Bax elevada, una mayor activación de las caspasas, la liberación de Cit C y Smac en el citosol. Además, el silenciamiento de genes de Bax o Smac significativamente atenuada NOXA y /o la apoptosis inducida por cisplatino en células A2780s chemosensitive, mientras que la sobreexpresión de Bax o la adición de péptido Smac-N7 aumentó significativamente NOXA y /o la apoptosis inducida por cisplatino en células SKOV3 quimiorresistentes. A nuestro entender, estos datos sugieren un nuevo mecanismo por el cual NOXA chemosensitized células de cáncer de ovario a cisplatino mediante la inducción de alteraciones en el eje de Bax /Smac. Tomados en conjunto, nuestros resultados muestran que NOXA es potencialmente útil como quimiosensibilizador en el tratamiento del cáncer de ovario
Visto:. Lin C, Zhao X-Y, Li L, Liu H-y, Cao K, Wan Y, et al. (2012) NOXA Inducido por alteraciones en el eje Bax /Smac aumentar la sensibilidad de las células del cáncer de ovario a cisplatino. PLoS ONE 7 (5): e36722. doi: 10.1371 /journal.pone.0036722
Editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, los Estados Unidos de América
Recibido: 28 Marzo, 2012; Aceptado: April 10, 2012; Publicado: 9 Mayo 2012
Derechos de Autor © 2012 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación básica clave de China (2010CB529900) y la Fundación de Ciencias Naturales de China (30900744; 81071817 /H1609; 81001010). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la causa más común de muerte por neoplasia ginecológica [1]. Aunque hay algunas mejoras, la supervivencia a largo plazo sigue siendo pobre debido a la toxicidad dependiente de la dosis, la recurrencia del tumor y la eventual aparición de la enfermedad resistente a los medicamentos. Para superar estos obstáculos, las investigaciones se han centrado cada vez más en nuevas estrategias terapéuticas: modulación de la quimiosensibilidad celular, revertir la resistencia del tumor, y el aumento de los efectos terapéuticos de quimioterapia [2]. nuevas evidencias sugieren que la vía de la apoptosis desregulada es un importante contribuyente a la iniciación del tumor, progresión y el desarrollo de la resistencia adquirida a las terapias contra el cáncer [3], [4].
Como un evento genético común en el carcinoma de ovario, la mutación de p53 está asociada con la resistencia a la quimioterapia basada en platino [5]. Los informes recientes han demostrado que la p73, un miembro de la familia de proteínas p53, es un regulador clave de la susceptibilidad a la apoptosis a cisplatino (cis) en células de cáncer de ovario A2780 [6], [7], y que el programa transcripcional de p73-dependiente es un importante contribuyente a la vía de la quimiosensibilidad en células de carcinoma de ovario BRCA1 deficiente en [8], lo que indica algunos de los mecanismos que afectan a expresiones y funciones p73 puede contribuir al desarrollo de resistencia a la apoptosis inducida por cisplatino en células de cáncer de ovario [7]. Todas estas observaciones sugieren que la desregulación de las vías de apoptosis dependiente de p53 y /o p73 asociada puede contribuir a la resistencia basada en platino en el cáncer de ovario. Por lo tanto, la restauración de la p53 y /o vía de p73 mediante la activación de ellos mismos o sus objetivos de abajo puede ser una vía atractiva para mejorar la eficacia de las terapias contra el cáncer.
NOXA se identificó primero como una diana transcripcional de p53 [9], y, recientemente, también se demostró ser regulado transcripcionalmente por p73 [8]. Al igual que muchas proteínas de la familia Bcl-2 que translocate a la mitocondria y modulan la función mitocondrial, NOXA transloca a la mitocondria y luego conduce al citocromo C (Cit C) la activación de la liberación y la caspasa-9, y, en última instancia, conduce a la muerte celular [10], [ ,,,0],11]. funciones Noxa a través de Bax y /o Bak para inducir la apoptosis en algunas células cancerosas tales como Hela humanas epiteliales células cervicales cáncer [9], las células de melanoma [11], células MCF-7 de cáncer de mama humanos [12], etc. Además, un reciente informe mostró un potencial terapéutico de NOXA en el tratamiento de cáncer de mama humano [12]. Sin embargo, el papel de NOXA en las respuestas terapéuticas de las células de cáncer de ovario a medicamentos contra el cáncer basados en platino sigue siendo poco clara.
En este trabajo, en primer lugar seleccionamos cisplatino-sensibles (A2780s, IGROV1 y OAW42) y resistentes a ( A2780cp, líneas celulares de cáncer de ovario humano OVCAR-3 y SKOV3) para poner a prueba las variaciones de expresión de prosupervivencia y proteínas de la familia Bcl-2 pro-apoptóticos. A continuación, se examinaron inducida por cisplatino niveles de expresión de p53, p73, p21
WAF1 /CIP1, NOXA y Bax en varias líneas celulares de cáncer de ovario humano con diferente estado de p53 incluyendo A2780s (p53 de tipo salvaje, p53 WT), SKOV3 ( p53 doble mutante de deleción, p53 - /-), OVCAR-3 (que alberga p53 mutante R248Q) y A2780cp (que contiene p53 secuencia del gen de tipo salvaje, pero que muestra la pérdida de la función p53) [13], [14]. Se encontró que p53, p73, p21
WAF1 /CIP1, NOXA y Bax se indujeron de manera significativa por el cisplatino en la línea celular A2780s p53 de tipo salvaje, pero en otras líneas celulares de cáncer de ovario tres p53 mutantes, las expresiones de p73, p21
WAF1 /CIP1, NOXA y Bax se mantuvo sin cambios. Además, las respuestas de NOXA y Bax a cisplatino están regulados principalmente por p53 distinta de p73 en líneas celulares de cáncer de ovario. Teniendo en cuenta la función reguladora importante de p53 en NOXA y Bax, dos genes p53 y /o de destino de aguas abajo p73, se seleccionaron adicionalmente la línea celular SKOV3 p53 doble mutante de deleción como modelo de resistencia intrínseca [15] - [17], y la p53 línea de tipo -wild A2780s celular, que se derivó de un paciente no tratado con carcinoma de ovario primario [17], [18], como un modelo de quimiosensibilidad intrínseco, para evaluar el efecto de NOXA sobre la eficacia quimioterapéutica de cisplatino en A2780s y SKOV3 de ovario modelos de cáncer de
in vitro Opiniones y
in vivo
. Se encontró que NOXA induce la apoptosis independiente de p53 en ambos A2780s y células SKOV3, y que la expresión elevada de NOXA puede mejorar la sensibilidad de las células de cáncer de ovario a cisplatino a través de las alteraciones en el eje de Bax /Smac. A nuestro entender, proporcionamos nuevas pruebas para la posible aplicación de NOXA como quimiosensibilizador en el tratamiento del cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los estudios con ratones eran aprobado por el Comité de Atención y Tratamiento de Animales institucional del Laboratorio Estatal de bioterapia, Universidad de Sichuan.
Materiales
el péptido Smac-N7 (AVPIAQKPRQIKIWFQNRRMKWKK) se adquirieron de Calbiochem, Inc. (San Diego , CA). Fue modificada para ser permeable a las células mediante la unión de la lisina COOH-terminal de la arginina de un péptido 16-mer Antennapedia homeodominio través de un enlazador prolina. Los anticuerpos primarios para el Western Blot son los siguientes: Anti-Bcl-2 (sc-130 307), anti-Bcl-x
L (sc-8392), anti-MCL-1 (sc-69839), anti-NOXA (sc-30209), anti-p53 (DO-1), anti-p73 (H-79), anti-p21
Waf1 /Cip1 y anti-β-actina (Santa Cruz, CA); anti-Bax N-20 (sc-493); anti-caspasa-3, anti-exfoliados caspasa-3, anti-caspasa-9 y su forma escindida (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA); anti-Smac (clon FKE02, R & amp; D Systems, Minneapolis, MN); anti-Cyt C (sc-13156), citocromo oxidasa subunidad IV (Molecular Probes).
plásmidos
Tanto pcDNA3.1 (pc3.1) y el plásmido pcDNA3.1 gen que codifica NOXA humana (pcDNA3.1-hNOXA, pc3.1-hNoxa) se purificaron mediante dos rondas de paso sobre columnas Endofree (Qiagen, Chatsworth, CA), como se informó anteriormente [19]. construcciones pc3.1-Bax se generaron de acuerdo con nuestros métodos anteriores [20].
silenciamiento de genes con pequeños RNAs de interferencia
pequeños ARN de interferencia (siRNA) oligonucleótidos fueron adquiridos de Dharmacon (Lafayette, CO ) con secuencias de direccionamiento Bax (5'-AACUGAUCAGA ACCAUCAUGG-3 ') y Smac (5'-AACCCUGUGUGCGGUUCCUAU-3'). Para la construcción Bax y Smac shRNA, la Bax y Smac siRNA se clonaron en el plásmido pSilencer hygro 2.1-U6.
Cultivo de células y transfección
A2780s, IGROV1, OAW42, A2780cp, OVCAR-3 y líneas celulares de cáncer de ovario humano SKOV3 se adquirieron de ATCC (Manassas, VA) y se cultivaron en DMEM o RPMI 1640 de cultivo que contiene suero bovino fetal al 10% (FBS), respectivamente, a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. La transfección se realizó con Lipofectamine ™ 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante
Tratamientos de células en el
in vitro
experimentos
A2780s y células SKOV3 fueron tratados como sigue en:. Control, las células se dejaron sin tratar y se cosechan cuando se cultiva durante 72 h. pc3.1 (vector vacío), las células fueron transfectadas con pc3.1, y después se recogieron a las 48 h después de la transfección. hNOXA, se cosecharon las células transfectadas con pc3.1-hNOXA a las 48 h después de la transfección. El cisplatino, se añadió cisplatino (5 mg /ml) cuando las células se cultivaron durante 48 horas. 24 horas más tarde, se recogieron las células. hNOXA más cisplatino, se añadieron las células transfectadas con pc3.1-hNOXA cisplatino (5 mg /ml) a 24 h después de la transfección. Veinticuatro horas más tarde, se recogieron las células.
Para el silenciamiento de genes o sobreexpresión de Bax y Smac, los siRNAs o plásmidos correspondientes fueron co-transfectadas con plásmidos pc3.1 /pc3.1-Noxa en A2780s o SKOV3 Células. Se añadieron las células tratadas por encima de cisplatino durante 12 horas adicionales a las 12 h después de la transfección, y después se recogieron a las 24 h después de la transfección.
Detección de expresión hNOXA
in vitro
y
in vivo
para la detección de la expresión hNOXA
in vitro
, las células fueron tratadas A2780s acuerdo con los programas descritos anteriormente. Se utilizaron las células cosechadas para detectar la expresión hNOXA por RT-PCR y Western blot, respectivamente. Los tejidos tumorales se recogieron para detectar la expresión hNOXA
in vivo
por RT-PCR. Los cebadores utilizados para la amplificación de hNOXA y GAPDH fueron los siguientes: NOXA-F 5'-3 'y AAGAACGCTCAACCGAGC-NOXA-R 5'-GGTTCCTGAGCAGAAGAGT-3'; GAPDH-F-5 'AATCCCATCACCATCTTCC-3' y 5 'GAPDH-R-CAT CACGCCACAGTTTCC-3'.
viabilidad celular y la apoptosis ensayos
La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT [21] . La apoptosis se evaluó de la siguiente manera: la detección de la fragmentación del ADN con la célula kit ELISA de detección de muerte (Roche Diagnostics), análisis de transferencia Western de la activación de la caspasa, la medición de células apoptóticas por citometría de flujo (tinción con PI para sub-G1) y Hoechst 33258 tinción. La Detección de Muerte Celular ELISA cuantifica las células apoptóticas mediante la detección de los fragmentos de ADN histona-asociado (mono- y oligo-nucleosomas) generadas por las células apoptóticas [20], [22].
Flujo y análisis de citometría de Hoechst 33258 tinción
se realizó el análisis de citometría
flujo para identificar células sub-G1 células apoptóticas /y para medir el porcentaje de células sub-G1 en tampón hipotónico como se describe anteriormente [23]. Hoechst 33258 tinción se realizó accordingto las instrucciones del fabricante.
RT-PCR semicuantitativa
ARN total se aisló usando el reactivo Trizol (Invitrogen). Semicuantitativo RT-PCR se realizó para amplificar NOXA y GAPDH.
Fraccionamiento subcelular y Western Blot
Fraccionamiento subcelular se hizo para obtener fracciones mitocondriales y citosólicas como se describe anteriormente [24]. Lisados de células totales se prepararon como se describe anteriormente [25]. Lisados de células totales y lisados subfraccionamiento se utilizaron para análisis de transferencia Western.
modelos animales de tumores y el tratamiento
A2780s y células SKOV3 (2 × 10
6 células) fueron implantados s.c. en los flancos derecho de 6 a 8 semanas de edad ratones desnudos hembra, respectivamente. Para explorar la eficacia terapéutica de NOXA más cisplatino, se trataron los ratones en el día 10 después de la implantación de las células tumorales, cuando el diámetro del tumor alcanzó ~ 5 mm de diámetro. Los ratones se dividieron al azar en 5 grupos (5 ratones por grupo) y se tratan con: (a) 0.100 l de PBS; (B) 0,10 g pc3.1 plásmido /30 mg liposoma en 100 l de PBS; (C) 0,10 g pc3.1 -hNoxa plásmido /30 mg liposoma en 100 l de PBS; (D) 0.100 l de 0,1 mg de cisplatino (5 mg /kg de peso corporal); (E) 0,10 g pc3.1-hNoxa plásmido /30 g liposoma en 100 l de PBS y 100 l de 0,1 mg de cisplatino. Los ratones se trataron con el complejo de ADN-liposoma mediante la administración intravenosa
vía
la vena de la cola dos veces a la semana, y cisplatino por vía intraperitoneal una vez a la semana durante 4 semanas. Los volúmenes tumorales se calcularon mediante la siguiente fórmula: volumen del tumor (mm
3) = 0,52 x longitud (mm) x anchura (mm) x anchura (mm) [26]. Los tejidos tumorales se recogieron para los experimentos de TUNEL.
fin de etiquetado dUTP nick mediada por desoxinucleotidil-transferasa terminal (TUNEL) análisis
TUNEL se realizó con un kit de detección in situ de la muerte celular (Roche). apoptosis de las células se cuantificó mediante la determinación del porcentaje de células teñidas positivamente para todos los núcleos en 20 campos elegidos al azar /sección en 200 × magnificación. Diapositivas de los estudios de apoptosis se cuantificó de forma ciega por dos revisores independientes dos momentos diferentes.
Estadística
analiza
El análisis estadístico se realizó con el software SPSS (versión 17.0 para Windows). Todos los valores se expresan como media ± SD. ANOVA y Tukey-Kramer prueba de comparación múltiple se utiliza en las comparaciones. Las curvas de supervivencia se construyeron de acuerdo con el método de Kaplan-Meier. La significación estadística se determinó mediante la prueba de log-rank.
valor de p Hotel & lt; 0,05 se consideró significativo. Las barras de error representan el SEM a menos que se indique lo contrario.
Resultados
variantes genéticas entre las células del cáncer ovárico cisplatino-sensibles y resistentes a
Western Blot análisis mostró que el cisplatino-sensibles ( A2780s, IGROV1 y OAW42) líneas celulares expresan relativamente bajos niveles endógenos de Bcl-2, Bcl-x
L y MCL-1 mientras resistentes al cisplatino (A2780cp, líneas de células OVCAR-3 y SKOV3) eran por el contrario. En contraste con prosupervivencia proteínas Bcl-2 la familia, los niveles de pro-apoptótico Bak y Bax en A2780s, líneas celulares y IGROV1 OAW42 son más altos que los de A2780cp, las líneas celulares SKOV3 OVCAR-3 y (Figura 1A).
(a) Western Blot se realizó para las variaciones de expresión de prosupervivencia Bcl-2, Bcl-x
L y MCL-1 y proteínas Bak y Bax proapoptóticos entre los (A2780s, IGROV1 y OAW42) cisplatino-sensibles y resistentes a ( células de cáncer de ovario A2780cp, OVCAR-3 y SKOV3). β-actina se utilizó como control de carga. (B) A2780s (p53 WT) y SKOV3 (p53 - /-) las células se trataron con cisplatino (5 mg /ml) durante 24 horas y se analizaron para la expresión de p53, p73, p21
WAF1 /CIP1, NOXA y Bax por transferencia de Western. β-actina se utilizó como control de carga. (C) OVCAR3 (albergar R248Q p53 mutante) y A2780cp (que contiene p53 secuencia del gen de tipo salvaje, pero que muestra la pérdida de la función p53) las células se trataron con cisplatino (5 mg /ml) durante 24 horas y se analizaron para la expresión de p53, p73 , p21
WAF1 /CIP1, NOXA y Bax por Western Blot. β-actina se utilizó como control de carga.
Además, examinó inducida por cisplatino niveles de expresión de p53, p73, p21
WAF1 /CIP1, NOXA y Bax en varias líneas celulares de cáncer de ovario humano con diferente estado de p53 incluyendo A2780s (WT p53), SKOV3 (p53 - /-), OVCAR-3 (que alberga p53 mutante R248Q) y A2780cp (que contiene p53 secuencia del gen de tipo salvaje, pero que muestra la pérdida de la función p53). Todas las células indicadas se trataron con 5 mg /ml de cisplatino durante 24 horas. Como se muestra en la Figura 1B y C, p53, p73, p21
WAF1 /CIP1, NOXA y Bax fueron encontrados a ser significativamente inducida por cisplatino en la línea celular A2780s p53 de tipo salvaje, pero en otros tres p53 mutante resistentes al cisplatino líneas celulares SKOV3 OVCAR-3, y A2780cp, las expresiones de p73, p21
WAF1 /CIP1, NOXA y Bax se mantuvo sin cambios. Además, el nivel de Bax endógena en cisplatino resistente OVCAR-3, las líneas celulares A2780cp y SKOV3 es muy baja (Figura 1B y C). Estos resultados indican que las respuestas de NOXA y Bax a cisplatino están regulados principalmente por p53 distinta de p73 en líneas celulares de cáncer de ovario.
reducción de la viabilidad de las células de cáncer de ovario
in vitro
por hNOXA y cisplatino
La función pro-apoptótica de NOXA y la falta de inducción NOXA en SKOV3 intrínsecamente resistentes al cisplatino (p53 - /-) células de ovario nos llevó a investigar si la sobreexpresión de NOXA suprime el crecimiento de células de cáncer de ovario. La sobreexpresión de hNOXA en las células transfectadas A2780s fue confirmada por RT-PCR (Figura 2A) y análisis de transferencia Western (Figura 2B), respectivamente. Teniendo en cuenta que las funciones de Noxa aguas abajo de la vía de apoptosis mediada por p53, y que la acción citotóxica de cisplatino está mediada por daño en el ADN, lo que, a su vez, transactivates genes diana (egp53AIP, PUMA, Noxa) para causar la apoptosis, que predice que los niveles elevados NOXA expresión puede sensibilizar a las células de cáncer de ovario con el cisplatino. Para probar esta hipótesis, primero se trataron las células con cisplatino A2780s a las concentraciones indicadas, con un intervalo de 24 ó 48 horas, y se encontró que la dosis de CI
50 de cisplatino varió de 5 mg /ml a 10 g /ml (Figura 2C). Entonces, se trataron las células con cisplatino a una dosis subóptima (5 mg /ml), con un intervalo de 24/48 horas, de acuerdo con los diferentes horarios como se describe en Meterials y Métodos. Después del tratamiento, la viabilidad de las células se determinó mediante el ensayo de MTT. Como se muestra en la Figura 2D, en comparación con el control, ya sea hNOXA o cisplatino reducido significativamente la viabilidad celular A2780s por 41% /47% (P & lt; 0,001) y 43% /49% (P & lt; 0,001), respectivamente. hNOXA más cisplatino reducen de manera muy significativa la viabilidad celular A2780s por 68% /76% (P & lt; 0,001). En las células SKOV3 deficientes en p53, en comparación con el control pc3.1, hNOXA también redujo significativamente la viabilidad celular (P & lt; 0,001), mientras que el cisplatino mostró sólo un ligero efecto, pero no estadísticamente significativo en el crecimiento de células SKOV3 (24 h, p = 0,874; 48 h, p = 0,921). Sin embargo, la combinación de hNOXA y cisplatino reduce muy significativamente la viabilidad celular SKOV3 por 65% /68% (P & lt; 0,001). (Figura 2E)
(A) Análisis de RT-PCR de la expresión hNOXA
in
vitro después de la transfección de las células A2780s. GAPDH se utilizó como control de carga. (B) Análisis de transferencia de Western de expresión hNOXA
in vitro
después de la transfección de las células A2780s. β-actina se utilizó como control de carga. (C) El tratamiento de cisplatino en concentraciones y períodos indicados reducción de la viabilidad celular A2780s, que muestra que la dosis de IC
50 varió de 5 mg /ml a 10 mg /ml. (D) El tratamiento de hNOXA más cisplatino redujo la viabilidad celular A2780s forma más significativa que el tratamiento de hNOXA solo o cisplatino solo lo hicieron. Las diferencias significativas en comparación con el grupo control (24 h, ** P & lt; 0,001; 48 h,
## P & lt; 0,001). (E) El tratamiento de cisplatino solo tuvo poco efecto sobre la supervivencia de las células SKOV3, y la combinación de hNOXA más cisplatino redujo la viabilidad celular SKOV3 más significativa que el tratamiento de hNOXA solo o cisplatino solo hizo. Las diferencias significativas en comparación con el grupo control (24 h, ** P & lt; 0,001; 48 h,
## P & lt; 0,001). Se calculó el porcentaje de supervivencia. Los resultados se muestran como medias ± SD de tres pozos y experimentos por triplicado. En cada experimento, el tratamiento de sólo medio (no tratado) indica 100% de viabilidad celular.
La inducción de la apoptosis de las células de cáncer de ovario
in vitro
por hNOXA y cisplatino
la evaluación cuantitativa de células sub-G1 mediante citometría de flujo se utilizó para estimar el número de células apoptóticas. Como se muestra en la figura 3A, en células A2780s cisplatino-sensibles, las células apoptóticas representaron el 34,6% en el grupo tratado con hNOXA frente a 15,6% en el grupo tratado con pcDNA3.1 y 8,7% en el grupo control. Las células apoptóticas representaron el 63,6% en el grupo de combinación en comparación con 48,3% en el grupo tratado con cisplatino. Estos resultados sugieren que cisplatino o hNOXA apoptosis inducida por sí solo de manera significativa de las células A2780s, y hNOXA más cisplatino aumentarse aún más la inducción de apoptosis. Se obtuvieron resultados similares en células SKOV3 intrínsecamente resistentes a excepción de que el cisplatino solo se encontró que tienen poca capacidad de inducir la apoptosis de las células SKOV3 (Figura 3B)
.
(A) histogramas de fluorescencia de ADN representativos de células teñidas-PI. las células se trataron con A2780s hNOXA durante 24 h, y luego con 5 g /ml de cisplatino durante 24 h adicionales. células A2780s fueron tratados con pcDNA3.1 o hNOXA, cisplatino solo o hNOXA más cisplatino y grupos Ctrl, pc3.1, hNOXA, cis y hNOXA + Cis corresponden a estos cinco tratamientos (el mismo como se muestra en los paneles posteriores), con 8,7 % (Ctrl), 15,6% (pc3.1), 34,6% (hNOXA), el 48,3% (IC) y el 63,6% (hNOXA + Cis) células sub-G1 (células apoptóticas), respectivamente, como se evaluó por citometría de flujo. las células (B) SKOV3 se trataron con hNOXA durante 24 h, y luego con 5 g /ml de cisplatino durante 24 h adicionales. SKOV3 no se trataron, se trataron con el vector vacío o hNOXA, cisplatino solo o hNOXA más cisplatino, con un 4,9% (Ctrl), 6,4% (pc3.1), 38,4% (hNOXA), 9,1% (IC) y el 52,3% (hNOXA + Cis) las células sub-G1 (células apoptóticas), respectivamente, como se evaluó por citometría de flujo. (C) normal y la morfología nuclear apoptótica de las células A2780s se analizó por Hoechst 33258 tinción. células A2780s fueron tratados con las mismas condiciones como se describe anteriormente. (D) normal y la morfología nuclear apoptótica de las células SKOV3 se analizó por Hoechst 33258 tinción. células SKOV3 se trataron con las mismas condiciones como se ha mencionado anteriormente.
La apoptosis se evaluó adicionalmente por Hoechst 33258 tinción. Similar a los resultados anteriores, tanto en A2780s y células SKOV3, se observó el número de núcleos condensados (intactas o fragmentados), que son característicos de la apoptosis, en el grupo de combinación que en hNOXA- o células tratados con cisplatino. No hubo núcleos condensados significativamente en los grupos tratados y único- pc3.1-mediano. Sin embargo, cabe hacer notar que las células SKOV3 tratados con cisplatino no mostraron signos de apoptosis similares (Figura 3C y D).
Los efectos sensibilizadores de NOXA están mediados por la liberación de Cyt C y SMAC en el citosol
NOXA induce la apoptosis a través de la activación de Bax y /o Bak para desencadenar la disfunción mitocondrial y la caspasa-9 de activación [10], [11], [27]. Como era de esperar, en las células A2780s cisplatino-sensibles, ya sea hNOXA o cisplatino solo dieron lugar a importantes sobre regulación de Bax y la activación de las caspasas 3 y 9, y su combinación mejorar aún más la sobre regulación de Bax y la activación de las caspasas (Figura 4A ). Además, la apoptosis fue acompañado por la liberación de Cyt C y Smac en el citosol (Figura 4B). Resultados similares se obtuvieron en las células SKOV3 intrínsecamente resistentes, excepto que el cisplatino solo fue encontrado para no causar la sobre regulación de Bax y la activación de las caspasas y la liberación de Cit C y Smac (Figura 4A y B).
(a) A2780s y células SKOV3 se sometieron a los tratamientos indicados como se describe en Materiales y Métodos. La activación de caspasa se analizaron por transferencia Western. Las flechas indican las formas activas de las caspasas. β-actina se utilizó como control de carga. (B) A2780s y SKOV3 células fueron sometidas a los tratamientos indicados como se describe en Materiales y Métodos. La liberación de Cyt C y Smac en el citosol se analizaron por transferencia Western. manchas de Cox-IV indican controles de carga mitocondriales mientras β-actina se utilizó como control de carga para la fracción citosólica.
Las alteraciones en el eje de Bax /Smac determina la sensibilidad de las células de cáncer de ovario a cisplatino
Hemos observado que la regulación de Bax y la liberación de Smac en el citosol en A2780s y células SKOV3 (Figura 4) NOXA tratos y que el cisplatino también condujo a Bax regulación y la liberación de Smac en las células A2780s (Figura 4 ), pero en las células SKOV3, que no causó la regulación de Bax (Figura 1 y 4) y la liberación de Smac en el citosol (Figura 4). Estas observaciones nos llevó a especular que eje Bax /Smac pueden ser uno de los determinantes principales de la quimiosensibilidad en células de cáncer de ovario resistentes al cisplatino, y que las alteraciones inducidas por NOXA en el /Smac Axis Bax pueden aumentar la sensibilidad de las células de cáncer de ovario a cisplatino. Para probar la especulación, decidimos investigar si NOXA y /o apoptosis inducida por cisplatino fue atenuada en las células A2780s cisplatino-sensibles cuando son tratados con siRNA dirigidos Bax o Smac, y si NOXA y /o apoptosis inducida por cisplatino se mejoró en cisplatino células SKOV3 resistentes cuando pretratado con Bax construir o péptido Smac N7, respectivamente.
Como era de esperar, Bax siRNA significativamente atenuada NOXA y /o la apoptosis inducida por cisplatino en células A2780s (Figura 5A). Resultados similares se encontraron en las células A2780s después del tratamiento con siRNA dirigidos Smac (Figura 5B). La especificidad de Bax y Smac siRNA dúplex se evaluó mediante el análisis de Bax y expresión de la proteína Smac en las células transfectadas con A2780s la construcción shRNA correspondiente (Figura 5C). SKOV3, la sobreexpresión de Bax, lo cual fue confirmado por análisis de Western Blot (Figura 5D) en pc3.1-Bax-transfectadas, aumentó significativamente NOXA y /o apoptosis inducida por cisplatino (Figura 5E). Del mismo modo, la adición de un heptapéptido NH2-terminal de Smac (Smac-N7) también mejoró significativamente NOXA y /o apoptosis inducida por cisplatino (Figura 5F).
siRNAs (a) la selección Bax atenuó significativamente NOXA y /o cisplatino apoptosis inducida en células A2780s quimiosensibles (* P & lt; 0,01; ** P & lt; 0,001). (B) siRNAs dirigidos Smac significativamente atenuada NOXA y /o la apoptosis inducida por cisplatino en células chemosensitive A2780s (
#P & lt; 0,05; * P & lt; 0,01; ** P & lt; 0,001). (C) El descenso de regulación de Bax o Smac por Bax o siRNA Smac siRNA fueron confirmados por Western blot. (D) La sobreexpresión de Bax se confirmó por Western blot. las células (E) SKOV3 fueron co-transfectadas con plásmidos NOXA y pc3.1-Bax durante 12 horas, seguido de /mL tratamiento con cisplatino 5 mg durante 12 horas adicionales. La sobreexpresión de Bax aumentó significativamente NOXA y /o la apoptosis inducida por cisplatino en células quimiorresistentes SKOV3 (* P & lt; 0,01). células (F) SKOV3 se trataron con NOXA y /o cisplatino como se describió anteriormente, a continuación, con el péptido /L Smac-N7 20 mol durante 3 horas adicionales. péptido Smac-N7 aumentó significativamente NOXA y /o la apoptosis inducida por cisplatino en células SKOV3 quimiorresistentes (
#P & lt; 0,05; * P & lt; 0,01)
eficacia antitumoral mejorada de la combinación de hNOXA. y cisplatino en vivo
sobre la base de la
in vitro
efectos pro-apoptóticos de hNOXA y cisplatino inhibidor del crecimiento y, hemos examinado aún más el efecto antineoplásico de hNOXA más cisplatino en tumores A2780s y SKOV3
in vivo
. Como se muestra en la figura 6A y B, en el día 34 después de la implantación, los tumores A2780s y SKOV3 de ratones tratados con PBS alcanzaron 1174.28 ± 70.43 y 823.82 ± 73.27 mm
3 en volumen, respectivamente. Los tumores A2780s y SKOV3 tratados con hNOXA fueron significativamente (modelo A2780s,
P Hotel & lt; 0,001; SKOV3 modelo,
P Hotel & lt; 0,001) menor que los tratados con PBS, alcanzando sólo 686,06 ± 81.39 y 429.38 ± 22.9 mm
3 en volumen, respectivamente. el crecimiento del tumor La combinación de hNOXA y cisplatino suprimir adicionalmente de tal manera que los A2780s y tumores SKOV3 alcanzó 342,84 ± 38,8 y 279,27 ± 47,16 mm
3 en volumen, respectivamente, que fueron significativamente (modelo A2780s,
P Hotel & lt ; 0,001; modelo SKOV3,
P Hotel & lt; 0,001) más pequeños que los tumores de control, y significativamente más pequeños que los tumores tratados con hNOXA (modelo A2780s,
P Hotel & lt; 0,001; SKOV3 modelo, p & lt ; 0,05) o cisplatino (modelo A2780s,
P Hotel & lt; 0,05; modelo SKOV3,
P Hotel & lt; 0,001). El cisplatino también resultó en una reducción significativa en el volumen tumoral (577.08 ± 77.04 mm
3) en comparación con los tumores de control (
P
& lt; 0,001) en el modelo A2780s. Sin embargo, en el modelo de SKOV3, no se observó diferencia significativa en el volumen del tumor (605,44 ± 80,51 mm
3) en el grupo tratado con cisplatino en comparación con el grupo tratado con pc3.1 (695.57 ± 79.28 mm
3) (
P = 0,222
).
supresión tumoral y la ventaja de supervivencia en ratones. células A2780s (A, C) o células SKOV3 (B, D) de 2 × 10
6 se inocularon por vía subcutánea en ratones desnudos hembra a las 6-8 semanas de edad. Los ratones (cinco por grupo) fueron tratados con PBS, pcDNA3.1, pcDNA3.1-hNOXA, cisplatino y pcDNA3.1-hNOXA + cisplatino. En el modelo de tumor A2780s, diferencias significativas en la supresión de tumores (** P & lt; 0,001) y el tiempo de supervivencia (
? P & lt; 0,05) en ratones tratados con hNOXA o cisplatino en comparación con los controles de PBS y pcDNA3.1; diferencia significativa para los tumores tratados con hNOXA + cisplatino frente a PBS y los controles pcDNA3.1 (** P & lt; 0,001;
ΔΔP & lt; 0,01), y la diferencia significativa para la terapia de combinación frente a hNOXA o cisplatino en monoterapia (
#P & lt; 0,05;
† P & lt; 0,05). Resultados similares se encontraron también en el modelo de SKOV3, excepto que no hay diferencias significativas en la supresión de tumores (
P
= 0,222) y el tiempo de supervivencia (
P
= 0,433) entre cisplatino y pcDNA3.1- se encontraron tumores tratados. tinción (E-F) TUNEL de los tejidos tumorales. secciones representativas fueron tomadas de A2780s (E) y los tejidos tumorales SKOV3 (F) de los ratones que recibieron PBS, pcDNA3.1, hNOXA, cisplatino y hNOXA + cisplatino. índice (G) por apoptosis en los tejidos tumorales y A2780s SKOV3 se contaron. En el modelo A2780s, una diferencia estadísticamente significativa en el índice de apoptosis en los tumores tratados con hNOXA o cisplatino frente a PBS y los controles pcDNA3.1 (** p & lt; 0,001); diferencia significativa para los tumores tratados con hNOXA + cisplatino frente a los dos controles (** p & lt; 0,001); y diferencia significativa para la terapia de combinación frente a hNOXA o cisplatino en monoterapia (
## P & lt; 0,001). Resultados similares se encontraron también en el modelo de SKOV3, excepto que no se encontraron diferencias significativas en el índice apoptótico entre tumor tratados con cisplatino y el tumor tratado con pcDNA3.1 (P = 0,981) o tumor tratado con PBS (P = 0,705). El índice apoptótico se calculó como una relación del número de células apoptóticas en el número total de células en cada campo. (H) Análisis de RT-PCR de la expresión de hNOXA exógena in vivo.
análisis de la curva de supervivencia (Figura 6C) mostró que tumor A2780s teniendo ratones en el PBS o grupos pc3.1 tratados sobrevivieron menos de 65 días en promedio. Por el contrario, ya sea hNOXA o cisplatino resultó en una disminución significativa (
P Hotel & lt; 0,05) aumento de la esperanza de vida en comparación con los dos grupos de control, con el tiempo medio de supervivencia es de 74 y 80 días, respectivamente. La combinación de hNOXA y cisplatino más mejora de la supervivencia en un grado mayor que los dos grupos de control (
P
& lt; 0,01), con el tiempo medio de supervivencia del 87 días.