Extracto
El nucleofosmin chaperona (NPM1) se sobreexpresa en el compartimiento epitelial de los tumores de próstata en comparación con el epitelio sano adyacente y puede representar uno de los actores clave que apoyan el fenotipo neoplásico de células de adenocarcinoma de próstata. Sin embargo, los mecanismos que subyacen fenotipo mediada NPM1 siendo difícil de alcanzar en la próstata. Para comprender mejor las funciones de NPM1 en células de cáncer de próstata, hemos tratado de caracterizar su impacto en el comportamiento de las células de cáncer de próstata y descifrar los mecanismos por los que se puede actuar. Aquí mostramos que NPM1 favorece la migración de células de tumor de próstata, invasión y de formación de colonias. Además, desmontables de NPM1 conduce a una disminución en el crecimiento de tumores LNCaP derivados injertados en ratones desnudos
in vivo
. Tales propiedades oncogénicas similares se encuentran en combinación con una regulación positiva de NPM1 en la ERK1 /2 (señal-regulado extracelular quinasas 1/2) fosforilación de quinasa en respuesta a EGF estímulo (factor de crecimiento epidérmico), que es crítica para la progresión del cáncer de próstata tras la creación de una producción autónoma del factor de crecimiento. NPM1 entonces podría ser un objetivo para apagar específicamente ERK1 /2 activación de la vía con el fin de disminuir o inhibir el crecimiento de células de cáncer y la migración
Visto:. Loubeau G, Boudra R, S Maquaire, Lours-Calet C, Beaudoin C, Verrelle P, et al. (2014) NPM1 silenciamiento reduce el crecimiento del tumor y la señalización MAPK en las células del cáncer de próstata. PLoS ONE 9 (5): e96293. doi: 10.1371 /journal.pone.0096293
Editor: Lucía R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Octubre, 2013; Aceptado: 6 Abril 2014; Publicado: 5 Mayo 2014
Derechos de Autor © 2014 Loubeau et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Investigación Científica (CNRS) y por la Región Auvernia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la progresión del cáncer de próstata está asociada con alteraciones de genes clave que controlan la homeostasis celular, su desregulación y /o amplificación que conduce a un aumento de la proliferación celular y capacidades invasivas. Hemos identificado previamente
NPM1
(nucleofosmina 1) como uno de los genes cuya expresión es significativamente mayor en las células de tumor de próstata en comparación con los no tumoral tejido adyacente [1], lo que indica que NPM1 podría actuar como un potenciador de la próstata la progresión del cáncer. NPM1 es una fosfoproteína multifuncional importante acumulada a alto nivel en la región granular del nucléolo y es capaz de lanzadera entre el nucléolo, el nucleoplasma y el citoplasma [2]. Debido a su localización nucleolar, su actividad RNasa intrínseca y su asociación con la maduración ribonucleoproteínas pre-ribosomal, NPM1 ha sido propuesta por primera vez para regular la transcripción del ribosoma y el procesamiento del ARN. Sin embargo, NPM1 Más recientemente se ha demostrado para mostrar las actividades de chaperona. Se une a las histonas, favorece el montaje de ADN-histona, media la formación de nucleosoma y relaja la cromatina [3] controlando de este modo la expresión génica. NPM1 también interactúa con una amplia gama de proteínas en maduración para inducir su plegamiento apropiado en el estado activo. Entre estas proteínas, hay reguladores del crecimiento celular, tales como la oncoproteína MDM2 (ratón Minuto doble homólogo 2). Además, NPM1 se une e inhibe el tumor supresor de proteínas P53 y Rb (retinoblastoma) [4] destacar que NPM1 podría tener un papel en los procesos oncogénicos. Algunas de las interacciones específicas NPM1 con los reguladores del ciclo celular ya se han aclarado, pero su papel en el comportamiento de las células de tumores sólidos, así como su integración en el signalosome celular aún no se ha determinado. Aquí nos ocupamos de la cuestión de si NPM1 podría potenciar las capacidades de la proliferación, la migración y la invasión de las células del cáncer de próstata. En este estudio, mostramos que el nivel de NPM1 en células de cáncer de próstata regula específicamente la expresión de EGF y la (proteína quinasas activadas por mitógenos) MAPK vía de señalización. También muestran que altos niveles de NPM1 un impacto positivo en la proliferación celular y la migración celular, participando así en el control del crecimiento tumoral.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Todos los animales se mantuvieron en un ambiente controlado y cuidado de los animales se llevó a cabo de conformidad con las políticas nacionales de normalización (C) 63 014,19. Todos los experimentos fueron aprobados el Comité de Ética Regional de Auvernia, Francia (CE09-08 protocolo).
Cultivo de células y transfección estable
células LNCaP (en nódulos linfáticos de carcinoma de próstata) se cultivaron en rojo fenol Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640, Life Technologies, Saint-Aubin, Francia) suplementado con 10% de condiciones estándar de suero bovino fetal (FBS) y se incubaron en inactivado por calor (37 ° C, 5% de CO
2).
Las células fueron infectadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante con partículas de lentivirus que contenían tres constructos específicos de la diana (shNPM1) o secuencias no relacionadas (shScr, srambled) (sc-29771-V, Santa Cruz, Heidelberg, Alemania). Después de la infección, puromycine (1 mg /ml) se añadió al medio de cultivo con el fin de seleccionar las células transducidas de manera estable y para llevar a cabo la selección monoclonal.
Cicatrización de heridas ensayo de migración
Control de las células LNCaP (shScr ) y las células LNCaP abatidos NPM1 (shNPM1) se sembraron en 24 placas de pocillos y se cultivaron hasta confluencia durante 24 horas. El cultivo en monocapa fue luego raspar-herido con una punta de micropipeta estéril con el fin de crear un espacio de anchura constante. Los restos celulares se lavaron con solución salina tamponada con fosfato 1 x (PBS) (Life Technologies). Las células se cultivaron en RPMI próximo 1640 10% de FBS que fue reemplazado 12 horas después de la herida y luego cada 24 horas. la migración de células LNCaP fue fotografiado en la región de los heridos a los 24, 48 y 72 horas siguientes a la de raspado (100 aumentos) y restantes zonas de la herida fueron cuantificados con software libre ImageJ.
ensayo de invasión de Boyden Cámara
Para el ensayo de migración celular, 3 × 10
5 células shScr y shNPM1 LNCaP cultivadas en RPMI 1640 libre de suero se sembraron en el pozo superior de un sistema de cámaras transwell. Medio que contiene 10% de FBS se añadió a la cámara inferior. Después de la incubación durante 24 a 48 horas, las células no migradas se eliminaron con el pocillo superior. Las células que migraron a la superficie de la pieza de fondo fueron fijadas con metanol y se tiñeron con una solución de Giemsa al 5%. Cinco campos al azar fueron fotografiados (200 aumentos) y las células se cuantificó con el software libre ImageJ como la media ± desviación estándar de colonias contadas por campo.
ensayos de formación de colonias en agar blando
placas de seis pocillos se prepararon con 2 ml /pocillo de una solución caliente de agarosa al 0,6% bajo punto de fusión (producto de agarosa Sea Plaque FMS bajo punto de fusión, 50101, Lonza, Ozyme, Montigny-le-Bretonneux, Francia) en RPMI 1640, FBS al 10%. Después de la solidificación, 5 × 10
3 de las células shScr o shNPM1 LNCaP se sembraron por pocillo en una solución de 500 l de 0,3% de agarosa en medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS. Las placas fueron incubadas en RPMI 1640, 10% de medio FBS que se cambió cada 3-4 días. Después de 2 semanas, la formación de colonias se cuantificó usando el software libre ImageJ: colonias fueron fotografiados (100 aumentos) en 5 campos diferentes y el número de colonias relativa se calcula como la media ± desviación estándar de las colonias contadas por campo
ensayo clonogénico
1 × 10
4 células shScr y shNPM1 LNCaP fueron sembradas en placas de 6 pocillos en medio RPMI 1640, 10% de medio FBS. El medio se cambió cada 3 días. Después de 2 semanas, se retiró el medio y las células se lavaron con PBS 1 x fijadas con metanol y teñidas con una solución Giemsa al 5%. la formación de focos y se evaluó la formación de colonias se cuantificó usando el software libre ImageJ: colonias fueron fotografiados (100 aumentos) en 5 campos diferentes y el número de colonias relativa se calcula como la media ± desviación estándar de las colonias contadas por campo
proliferación de las células de ensayo
la proliferación celular se determinó a través de proliferación celular ELISA BrdU (bromodesoxiuridina) kit colorimétrico (Roche) según las instrucciones del fabricante. Brevemente 5 × 10
3 shScr células LNCaP o shNPM1 por pocillo fueron sembradas en una placa de 96 pozos. Se cultivaron durante 24 horas en medio RPMI 1640, 10% de FBS en presencia de ausencia de EGF (E9644, Sigma). Después, se añadió solución de etiquetado BrdU a una concentración final de 10 mM durante 2,5 horas. Después de la fijación, las células se incubaron con solución anti BrdU-POD durante 1 hora, y la absorbancia se midió a 655 nm.
Western Blotting
Las proteínas se extrajeron usando HEPES 20 mM, NaCl 0,42 M , MgCl
2 1,5 mM, EDTA 0,2 mM, y Nonidet P-40 al 1% suplementado con fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM (Sigma), inhibidores de la proteasa (Complete 1X; Roche), NaF 0,1 mM, y Na
3Vo
4 0,1 mM (Sigma). Cuarenta mg de proteínas totales se sometieron después a la desnaturalización SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa una membrana Hybond-ECL (GE Healthcare Life Sciences, Vélizy-Villacoublay, Francia). Las detecciones se realizaron con anticuerpos producidos contra β-actina (A2066, Sigma), NPM1 (sc-6013-R, Santa Cruz, Heidelberg, Francia), EGFR (factor de crecimiento epidérmico, NB100596, Novus), fosfo-EGFR Tyr 1068 ( 2236S, señalización celular, Ozyme), ERK1 /2 (M5670, Sigma, Saint-Quentin Fallavier, Francia), fosfato ERK1 /2 p42 /44 (9101S, señalización celular, Ozyme) AKT (9272, La señalización celular, Ozyme), fosfo-AKT 473 Ser (2118-1 Epitomics) y revelado con peroxidasa conjugada anti-conejo IgG (inmunoglobulina G, PARIS, Compiègne, Francia) utilizando un kit de sistema de iluminación occidental (PerkinElmer, Villebon sur Yvette, Francia). la señal de cuantificación se realizó mediante un software Cantidad (Bio-Rad).
construcción de promotor, transfección y luciferasa ensayos
El fragmento del promotor EGF humano (-392 /+ 123) se consiguieron con la siguiente cebadores: 5'-GATCAAGCTTGGGCTGAAGGTGAACTATCTTTAC-3 '(hacia delante) y 5'-GATCCTCGAGGACAGAGCAAGGCAAAGGCTTAGA-3' (marcha atrás), a continuación, se clonó en los sitios de restricción HindIII /XhoI en un vector pGL3-basic (Promega, Charbonnieres, Francia). El plásmido de expresión constitutivamente activa la quinasa MAP quinasa kinase1 (caMEKK1) fue una especie de regalo del Dr. Dirck Bohmann (Universidad de Rochester Medical Center, Rochester, EE.UU.). células shScr y shNPM1 LNCaP fueron transfectadas 24 h después de la siembra con el pGL3-hEGF y /o plásmidos caMEKK1 en OPTI-MEM usando Metafectene transfectante de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Biontex, Martinsried-Planegg, Alemania). Veinticuatro horas después de la transfección, las células se lisaron en tampón de lisis Reportero 1 × (Promega) y la actividad luciferasa se midió usando el kit de ensayo de luciferasa Genofax A (Yelen, sobrevienen la Redonne, Francia).
Preparación de ARN y cuantitativa en tiempo real PCR
ARN celular total se extrajo usando el reactivo TRIzol (Life Technologies) y se sintetizó ADNc con 200 U de Moloney de la leucemia murina de la transcriptasa inversa de virus (Promega), 5 pmol de cebadores aleatorios ( C1181, Promega), 40 U de RNAsin (Promega), y 2,5 mM de desoxinucleótido trifosfato. los niveles de mRNA se cuantificaron en un Mastercycler ep realplex (MasterCycler2, Eppendorf, Le Pecq, Francia) con Mesagreen QPCR Mastermix Plus para SYBR (Promega). Las secuencias de los cebadores son los siguientes: NPM1, 5'-ATGGAAGATTCGATGGACATGG-3 '(adelante) y 5'-CGAGAAGAGACTTCCTCCACTGC -3' (marcha atrás); PCNA, 5'-TGCCTTCTGGTGAATTTGCACGT-3 '(adelante) y 5'-ACCGTTGAAGAGAGTGGAGTGGC-3' (marcha atrás), actina, 5'-CGCGAGAAGATGACCCAGATC-3 '(adelante) y 5'TCACCGGAGTCCATCACGA-3' (marcha atrás) (Eurogentec, Angers , Francia). Para EGF humano, cebadores fueron adquiridos de Qiagen (PPH00137B-200, Qiagen, Courtaboeuf, Francia).
En vivo
desnuda modelo de xenoinjerto de tumor de ratón
ShScr y shNPM1 LNCaP células se hicieron crecer hasta la confluencia y luego se resuspendieron en matrigel (BD matrigel sótano matriz de la membrana libre de rojo fenol, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Francia) a una concentración de 9 × 10
6 células /ml. Trescientos l de la suspensión de células (aproximadamente 3 × 10
6 células) se inyectaron por vía subcutánea en ratones de 6 semanas de edad Nude (Swiss nu /nu, Charles River, L'Arbresle, Francia). progresión de la enfermedad se controló diariamente, basado en un conjunto de criterios de bienestar generales establecidos por el comité de cuidado de los animales, y la masa corporal se registró tres veces por semana hasta que se alcanzó un punto final predeterminado. Los puntos finales fueron: la deshidratación y /o la pérdida de peso de más del 10%, cualquier evidencia de dificultad respiratoria, incremento de peso corporal de más de 5 g de la media. Los tumores se midieron tres veces por semana usando un calibrador electrónico ya que los tumores palpables eran detectables. Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical bajo anestesia con gas. Los xenoinjertos se retiraron a continuación, ponderan y se congelaron en nitrógeno líquido para análisis de ARN y proteínas.
Análisis estadístico
Todos los ensayos se realizaron en al menos 3 experimentos independientes. Los errores estándar se calcularon para cada medio, y las diferencias estadísticas entre los grupos fueron determinados por el estudiante de
t
prueba o la no paramétrica de Mann & amp; Whitney U test utilizando el software Prism. Para los análisis longitudinales, se consideró un modelo de efectos aleatorios (modelo mixto) para estudiar el grupo de efectos fijos (expresión NPM1), los puntos de tiempo y el grupo de interacción × tiempo teniendo en cuenta entre y dentro de la variabilidad del sujeto (pendiente de efectos aleatorios y la intersección).
Resultados
NPM1 regula las capacidades clonogénico y proliferativas de células de tumor de próstata
con el fin de analizar el impacto de NPM1 sobre la proliferación de células tumorales de próstata, se optó por una estrategia de derribo y generó sublíneas de células LNCaP que expresan establemente control (shScr) o NPM1 shRNA específico (shNPM1). Como se muestra en la figura 1a, el nivel de mRNA NPM1 disminuye en más de un 50% y la expresión de proteína NPM1 en más de un 30% en las células shNPM1, pero esto no se asocia con modificaciones en la morfología celular. Sin embargo, NPM1 knockdown altera la capacidad de las células LNCaP para formar colonias después de la siembra a baja confluencia (figura 1b). Esta disminución de las capacidades clonogénicas coincide con una disminución en la proliferación celular potencial (figura 1c). De hecho, la baja regulación de NPM1 conduce a una disminución del 30% en la incorporación de BrdU y esto se asocia con una disminución de 60% en el nivel de ARNm de PCNA (proliferantes antígeno nuclear de células), un marcador clave de la proliferación celular (Figura 1D). Curiosamente, NPM1 caída no altera la supervivencia celular como evaluadas por PARP (poli (ADP-ribosa) polimerasa) analiza la escisión por Western Blot (Figura S1), lo que indica que esta disminución en la tasa de proliferación no está asociado con un aumento de la apoptosis. Estos resultados en consecuencia muestran que NPM1 está implicada en el aumento de la proliferación y la capacidad de clonogénicas de células tumorales de próstata.
(a) NPM1 caída no altera la morfología de las células LNCaP. células LNCaP fueron transfectadas establemente con el control shRNA (shScr) o específica NPM1 shRNA (shNPM1). NPM1 ARNm y los niveles de proteína se analizaron por RT-qPCR y transferencia Western, respectivamente. Morfología de las células se observó por microscopía invertida y fotografiada. (B) NPM1 caída inhibe las células LNCaP clonogenicidad. Las células se sembraron a baja confluencia más de una semana, y luego fijadas con metanol y se tiñeron con Giemsa 5% azul antes de la observación microscópica. Los cuadros son representativos de tres experimentos independientes con resultados consistentes. La gráfica representa el número de clones de células (& gt; 50 células) en la condición shNPM1, calculado como la media ± SD de la cantidad de clones contados por campo, en 5 campos aleatorios, utilizando el software libre ImageJ y expresado relativamente a la cantidad de clones escrutados en la condición de control. (C, d) NPM1 controles proliferación de células de cáncer de próstata. Cinco mil células se sembraron por pocillo en una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 48 horas. (C) las células se incubaron después con una solución de etiquetado BrdU durante 2,5 horas y la incorporación de BrdU se midió por análisis densitométrico en 655 nm. (D) la proliferación se analizó también mediante un ensayo de RT-qPCR mediante la evaluación de PCNA acumulación nivel de mRNA relativa normalizada utilizando el nivel de ARNm de β-actina. Todos los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes por triplicado y la incorporación de BrdU como medio de experimentos por triplicado de 96 puntos cada uno. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar.
NPM1 impacto sobre la proliferación se asocia con el control de la migración, invasión, las capacidades de crecimiento tridimensional de células de cáncer de próstata y el crecimiento del tumor
los resultados anteriores demuestran que NPM1 ejerce un control sobre las capacidades clonogénicas de células de cáncer de próstata y sugiere que, además de su efecto sobre la tasa de proliferación celular, sino que también podría contribuir tanto el crecimiento del tumor y la agresividad. A fin de evaluar el papel de NPM1, se analizó la capacidad de invasión y migración de las células LNCaP shNPM1. La caída de NPM1 disminuyó significativamente la invasión de las células LNCaP a través de filtros matrigel recubierto por 40% (Figura 2a). Se evaluó además la capacidad de migración de células LNCaP por herir físicamente células sembradas en las placas de cultivo celular. Como se muestra en la Figura 2b, a las 72 h después de haber sido lavada, las células shNPM1 no fueron capaces de recolonizar zona desnuda tan más rápidamente como lo hizo las células de control. Para probar si la disminución de la capacidad de migración y la invasión se acompaña de una disminución de las capacidades de crecimiento tridimensionales de células LNCaP shNPM1,
in vitro
pruebas en en agar blando se realizaron (figura 2c). Disminución de NPM1 en las células LNCaP casi suprime su capacidad de formar colonias en 3-D. Estos resultados de
in vitro
ensayos sugieren fuertemente que NPM1 regula las propiedades migratorias e invasivas de las células del cáncer de próstata.
(a) NPM1 controla las capacidades de migración de las células LNCaP. Las células se sembraron a confluencia con el fin de crear una herida 24 horas más tarde. Se observó la recolonización de la herida después de 72 horas de cultivo por microscopía invertida y fotografiada. Los histogramas muestran la cuantificación de la herida utilizando el área de ImageJ y las imágenes son representativos de tres experimentos independientes con resultados consistentes. (B) NPM1 knockdown inhibe el potencial invasivo de células de cáncer de próstata. shScr células y shNPM1 LNCaP fueron sembradas a una confluencia en RPMI 1640 medio libre de suero en la membrana microporosa recubierta matrigel. 48 horas más tarde, migran células presentes en el lado opuesto de la membrana se fijaron y se tiñeron con Giemsa 5% azul y observado en el microscopio (200 aumentos). La gráfica representa el número de células en la condición shNPM1, calculado como la media ± SD del número de células contadas por campo, en 5 campos aleatorios, utilizando el software libre ImageJ y expresado relativamente al número de células contadas en la condición de control . (C) impactos NPM1 crecimiento tridimensional de células de cáncer de próstata. De control o NPM1 derribado células se sembraron a baja confluencia en agarosa /RPMI 1640 10% de FBS durante 2 semanas. a continuación, se observaron número y tamaño de los clones emergentes bajo microscopio invertido (x100) y se fotografiaron. La gráfica representa el número de clones de células (& gt; 50 células) en la condición shNPM1, calculado como la media ± SD de la cantidad de clones contados por campo, en 5 campos aleatorios, utilizando el software libre ImageJ y expresado relativamente a la cantidad de clones escrutados en la condición de control. (D, e, f, g) NPM1 knock-down abroga tumorigenicidad de las células LNCaP cuando se inyectan en ratones desnudos. shScr (n = 14) y shNPM1 (n = 14) células LNCaP fueron injertados por vía subcutánea en ratones desnudos y el volumen del tumor se midió cada 2 días tras el injerto (d). Gráfico en (e) es la cuantificación de shScr y derivados de shNPM1 volumen de los tumores en el día 24 después de la inyección. NPM1 nivel relativo de expresión se evaluó mediante Western Blot en tumores cuando se sacrificaron los ratones (f) y se midió el peso del tumor (g). Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes y se expresan como la media ± SD.
A fin de determinar el papel de NPM1 en cáncer de próstata, se analizó la génesis de tumores de la próstata LNCaP y shNPM1 shScr LNCaP líneas celulares de cáncer de
in vivo
tras la inyección subcutánea en el flanco de ratones desnudos masculinos. ShNPM1 células producen tumores más pequeños (Figura 2d, e) y, contrariamente a las células LNCaP shScr, son más propensos a producir ningún tumor en absoluto cuando injertado (figura 2e). En detalle, los tumores iniciados a partir de células LNCaP de control aparecen a los 22 días después de la inyección mientras que los tumores se originan a partir de células LNCaP shNPM1 sólo son perceptibles a los 24 días después de la inyección. Por otra parte, las curvas de crecimiento nunca se paralelo, incluso después de 29 días (figura 2d). Por lo tanto, los tumores iniciados a partir de células abatidos NPM1 permanecieron más pequeños que los tumores de control con 85% de disminución del volumen del tumor promedio (figura 2e). Esta importante disminución de los resultados de volumen de tumor en una disminución de 95% del peso del tumor a partir de células LNCaP shNPM1 (figura 2g). Esta disminución es poco probable debido a una pérdida de la expresión de la anti-NPM1 shRNA ya que todos los tumores shNPM1 preservan una disminución del 90% en la acumulación de NPM1 (Figura 2F). Tomados en conjunto, estos datos demuestran claramente que NPM1 está implicada en el crecimiento del tumor de próstata
in vitro
y
in vivo
.
NPM1 está involucrado en el control de la expresión de EGF
con el fin de comprender mejor cómo NPM1 puede promover el comportamiento de las células del cáncer de próstata, se realizó un análisis de matriz qPCR (array RT2 ProfilerTM, SPAS-121A-2, Qiagen) y se determinó la naturaleza de los genes cuyos niveles de transcripción son modulados por el desmontables de NPM1 (datos no mostrados). Entre los 84 genes manchas en la matriz, la acumulación de ARNm del factor de crecimiento epidérmico (EGF) fue la disminución más significativa en células LNCaP shNPM1. Esta modulación de la expresión de EGF no es resultado de un efecto inhibitorio sobre la expresión génica mundial ya que la mayoría de los genes no se ven afectados o hasta reguladas cuando se disminuye NPM1 (datos no mostrados). Este resultado se confirmó mediante ensayos de RT-qPCR como la acumulación EGF mRNA se reduce en 40% en las células LNCaP shNPM1 (figura 3a). Por otra parte, para poner a prueba la actividad relativa de la actividad del gen del promotor EGF en las células LNCaP y shSCR shNPM1, transfectadas estas células con un plásmido reportero phEGF-luciferasa. Desmontables de NPM1 induce una disminución de la actividad del promotor de EGF, lo que demuestra que el efecto de NPM1 es probable que se ejerce en el nivel transcripcional (figura 3b). Estos resultados sugieren que NPM1 controla directa o indirectamente la expresión de EGF. Como se sabe que EGF para activar específicamente el receptor EGF (EGFR), se investigó si la activación del complejo EGFR, así como la activación de sus efectores aguas abajo, ERK1 /2 y AKT, es modulada por el nivel de expresión NPM1. Basado en el análisis de su estado de fosforilación, se muestra que la activación de EGFR (pEGFR) y de ERK1 /2 (pERK1 /2) se redujo drásticamente o casi abolió cuando la expresión de NPM1 es inhibida (figura 3c). Curiosamente, la fosforilación de AKT es menos sensible a una inhibición tal, lo que sugiere que NPM1 específicamente impactos de la vía MAPK (figura 3c). Estos efectos de NPM1 sobre la expresión de EGF y ERK1 /2 sugieren fuertemente que NPM1 podría estar implicado en el ajuste del bucle EGF autorregulación.
(a) NPM1 controla la expresión de EGF. Los niveles relativos de ARNm de EGF en comparación con ß-actina se analizaron por RT-qPCR en las células LNCaP que expresan de control (shScr) o NPM1 shRNA específica (shNPM1). (B) la actividad del promotor de EGF de control NPM1. células shScr y shNPM1 LNCaP fueron transfectadas con el plásmido informador phEGF-luciferasa. promotor de la actividad EGF se evaluó midiendo la actividad de luciferasa 24 horas después. Los resultados del ensayo se estandarizaron usando el promotor CMV como control y se expresaron como veces de inducción de más de las células de control (shScr). (C) NPM1 controla la activación de los efectores de la vía EGF /EGFR. Las proteínas, extraídos a partir de células shScr y shNPM1 LNCaP cultivadas en RPMI 1640 10% de FBS, se sometieron a electroforesis por SDS-PAGE. Las membranas fueron transferidos a inmunotransferencia con anticuerpos indicados. Los histogramas muestran la cuantificación banda informado de que el nivel de β-actina. Blots son representativos de tres experimentos independientes con resultados consistentes. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes y se expresan como la media ± SD.
NPM1 potencia específicamente la actividad vía MAPK para promover la proliferación y migración de las capacidades de células de cáncer de próstata
los datos anteriores demuestran que NPM1 está involucrado en el control de la expresión de EGF, un factor de crecimiento que controla la vía MAPK y promueve el comportamiento tumorigénico de células de cáncer de próstata. Por lo tanto, nos preguntamos si era la razón por la cual las células LNCaP shNPM1 mostraban disminución de la conducta tumorigénico. por tanto, se investigó si una ingesta exógena de EGF podría rescatar a la activación de los efectores de la vía /EGFR EGF y, posteriormente, aumentar la proliferación de células LNCaP y la migración. Control (shScr) o derribados NPM1 (shNPM1) las células LNCaP se mueren de inanición con el fin de apagar las vías de señalización y luego tratados con EGF.
Western blot análisis demuestran que el EGF suplementación exógena lleva a la fosforilación,
es decir
, la activación de tanto el receptor de EGF y uno de su objetivo de aguas abajo, AKT, tanto en las células shScr y shNPM1. Por el contrario, y lo más interesante, la fosforilación de ERK1 /2 se deteriora específicamente en las células shNPM1 (figura 4a). De acuerdo con este resultado, además de EGF exógeno es incapaz de restaurar las capacidades de migración e invasión de células LNCaP shNPM1 en los ensayos correspondientes (figura 4b, c). Estos resultados demuestran claramente que NPM1 se requiere específicamente para la activación de la vía de señalización MAPK y que la potenciación de esta ruta de transducción está implicado en el control de la proliferación y migración capacidades de las células de cáncer de próstata.
(a) NPM1 baja regulación inhibe la actividad de EGF inducida ERK1 /2. células shScr y shNPM1 LNCaP se trataron con 100 nM EGF y se analizó la fosforilación de los efectores de la vía EGF /EGFR usando transferencia Western. Los histogramas muestran la cuantificación banda informado de que el nivel de β-actina. La transferencia es representativo de tres experimentos independientes con resultados consistentes. (B) A pesar del tratamiento EGF, las capacidades de migración de LNCaP disminuyó de NPM1 no se han restaurado. Cierre de la herida se analizó 72 horas después del tratamiento continuo con 100 nM EGF. Las células se observaron bajo microscopio invertido y fotografiada. Los histogramas muestran la cuantificación de la herida área usando ImageJ. (C) el tratamiento de EGF no rescata la proliferación de las células LNCaP caída NPM1. ensayo de incorporación de BrdU se realizó en shScr y shNPM1 LNCaP 24 horas después del tratamiento 100 nM EGF. Densitometría se midió a 655 nm. Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes y se expresan como la media ± SD.
NPM1 actúa aguas arriba y aguas abajo de MEK1 de EGFR para activar la vía MAPK, para el control de un auto EGF -Regulación bucle en células de cáncer de próstata
Como la fosforilación de ERK1 /2 se deteriora específicamente en las células shNPM1 incluso en presencia de EGF, se sugiere que, en la vía MAPK, NPM1 actúa aguas arriba de ERK1 /2. Para identificar el efector (s) de la vía de señalización de EGFR inducida en el que NPM1 puede actuar, y para determinar si la acción NPM1 es directa o no en el promotor del gen de EGF, se realizaron ensayos de transfección con una forma constitutivamente activa de MEKK1 (caMEKK1) : caMEKK1 fosforila ERK1 /2 quinasa MEK1 /2, y por lo tanto, constitutivamente activa ERK1 /2 en ausencia de inhibición de MEK1 /2. En las células shScr LNCAP, caMEKK1 transfección induce la fosforilación de ERK1 /2. En las células LNCaP shNPM1 caMEKK1 transfección induce un efecto similar, rescatando así la vía de señalización (figura 5a) EGFR. Este resultado sugiere que NPM1 se dirige a la vía MAPK aguas abajo de EGFR pero aguas arriba de MEK1 /2 con el fin de regular la ERK1 /2. Además, la cotransfección de la construcción de caMEKK1 con un plásmido reportero de luciferasa-phEGF también rescata la actividad del promotor EGF (Figura 5B) en células LNCaP derribados para NPM1. Estos resultados demuestran que 1- es poco probable que NPM1 transactiva directamente el promotor de EGF en células de cáncer de próstata. 2- NPM1 puede más bien estimular la vía de señalización MAPK para mejorar la transcripción del gen de EGF. 3- datos de fosforilación de AKT y ERK1 /2 sugieren fuertemente que NPM1 actúa a nivel de MEKK1 o Ras /Raf en esta vía.
(a) 2 activación /ERK1 es rescatado por caMEKK1. shScr células LNCaP y shNPM1 son transfectadas con un constructo activado de forma constitutiva de la MEKK1 (caMEKK1) y /2 fosforilación de ERK1 nivel se analizó mediante Western Blot. (B) la activación de ERK1 /2 vía restaura la actividad del promotor de EGF en las células LNCaP regulación a la baja de NPM1. LNCaP shSCR y células shNPM1 fueron transitoriamente co-transfectadas con phEGF-luc y caMEKK1. promotor de la actividad EGF se evaluó midiendo la actividad de luciferasa 24 horas después. Los resultados del ensayo se estandarizaron contra la actividad de reportero de control CMV-Luc y se expresaron como veces de inducción de más de las células de control (shScr). Los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes y se expresan como la media ± SD.
Discusión
NPM1 juega un papel esencial en el crecimiento y la proliferación celular. Entre otros, se favorece la progresión del ciclo celular, la biogénesis de ribosomas y la duplicación del centrosoma [5] - [7]. En consecuencia, una correlación entre el aumento de los niveles de expresión NPM1 y la progresión del tumor se ha establecido en un amplio conjunto de tumores sólidos de diversos orígenes histológicos tales como en gastric- [8], [9], colon [9], el riñón [10] o de ovario tipos de cáncer [11]. No obstante, algunos estudios revelaron que, paradójicamente, NPM1 es capaz tanto de actuar como un supresor de tumores y como proto-oncogén durante la génesis tumoral [12]. Por un lado, NPM1 participa en el mantenimiento de la estabilidad cromosómica y regula la actividad de ARF [13] y, por otro lado, NPM1 promueve la inhibición de varios supresores de tumores, incluyendo p53 o Rb, y la activación del proto-oncogen c-Myc para mejorar su actividad transformadora [14]. Nuestros resultados anteriores mostraron que el NPM1 chaperona molecular se expresa en off en el tejido de carcinoma de próstata, en comparación con el control de tejido adyacente donde estimula la transcripción dependiente de andrógenos [1]. Ahora hemos querido investigar más concretamente, si esta desregulación de la expresión NPM1 puede actuar sobre las células tumorales de próstata invasivo y capacidades de migración. En este sentido, NPM1 fue eliminado hacia abajo en las líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP, cuyas características tales como la capacidad de migración, la proliferación y la invasión tumoral están bien establecidos.