Extracto
Regulación de la expresión génica es una de las varias funciones propuestas para el tetrafosfato diadenosina nucleótidos inducida por el estrés ( p
4A). Hemos examinado esta directamente por un análisis de RNA-Seq comparativo de KBM-7 células de leucemia mielógena crónica y células KBM-7 en el que el
NUDT2 gratis (células Nuko) Ap
4A gen de hidrolasa fue interrumpido, provocando un aumento de 175 veces en la intracelular Ap
4A. 6.288 genes expresados diferencialmente se identificaron con
P Hotel & lt; 0.05. De éstas, 980 fueron reguladas y 705 las reguladas en las células Nuko con un factor de cambio ≥ 2. El ingenio
® Pathway Analysis (IPA
®) se utilizó para asignar estos genes a las vías canónicas conocidos y funcional redes. Vías asociadas con respuestas de interferón, receptores de reconocimiento de patrones y la inflamación alcanzan cifras importantes en el conjunto de las reguladas de los genes, mientras que las funciones asociadas con antígenos del MHC de clase II fueron prominentes entre los genes regulados, que de otro modo mostraron poca organización en grandes conjuntos de genes funcionales. catabolismo del triptófano también fue fuertemente reducido regulado al igual que numerosos genes que se sabe están involucrados en la promoción de tumores en otros sistemas, con papeles en la transición epitelio-mesenquimal, la proliferación, invasión y metástasis. Por el contrario, algunos genes pro-apoptóticos fueron reguladas. Los principales factores de aguas arriba predichos por el IPA
® para el gen de baja regulación incluyen NFkB, STAT1 /2, IRF3 /4 y SP1, pero no hay factores principales que controlan gen de la regulación fueron identificados. Los posibles mecanismos para la regulación de genes mediada por AP
4A y /o
NUDT2
interrupción incluyen la unión de Ap
4A a la HINT1 co-represor, la activación autocrina de purinoceptores por Ap
4A, la cromatina remodelación, efectos de la pérdida NUDT2 en la estabilidad de transcripción, y la inhibición de factores de regulación dependientes de ATP, tales como proteína quinasas por AP
4A. La evidencia existente favorece el último de ellos como el mecanismo más probable. En cualquier caso, nuestros resultados sugieren que la proteína NUDT2 podría ser una diana muy quimioterapia contra el cáncer, con su inhibición potencialmente ejercer fuertes efectos anti-tumorales a través de múltiples vías de participación de la metástasis, la invasión, la inmunosupresión y la apoptosis
Visto:. Marriott AS, Vasieva O, fang y, Copeland NA, McLennan AG, NJ Jones (2016)
eleva NUDT2
Interrupción diadenosina tetrafosfato (Ap
4A) y los genes regula a la baja la respuesta inmune y la promoción del cáncer. PLoS ONE 11 (5): e0154674. doi: 10.1371 /journal.pone.0154674
Editor: Francisco J. Esteban, Universidad de Jaén, ESPAÑA
Recibido: 9 de diciembre de 2015; Aceptado: 18 de abril de 2016; Publicado: 4 Mayo 2016
Derechos de Autor © 2016 Marriott et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos analizados se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y. Además, todos los archivos de datos están disponibles en el (número de E-MTAB-4104) ArrayExpress base de datos
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por North West cáncer de Investigación (http://www.nwcr.org) conceder a los números CR968 AGM, NJJ y NAC; CR891 al NAC; y el número de becas de investigación NWCR BR879 al NAC (www.nwcr.org). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción hidrolasas
NUDIX regular los niveles de una amplia variedad de nucleótidos canónicos y modificados y algunos sustratos fosforilados no nucleótidos, así como participar en procesos esenciales, tales como ARNm decapping [1, 2]. Uno de los más estudiados es NUDT2 mamíferos. Esta enzima se ha aislado de muchas fuentes [3, 4] y su sustrato principal se cree que es diadenosina 5 ', 5' '' -
P
1,
P
4-tetrafosfato (Ap
4A). En las células animales, Ap
4A puede ser sintetizado por la mayoría de aminoacil-ARNt sintetasas, ADN ligasas, luciérnaga luciferasa sintetasas y acil-CoA reductasa, mientras que un rango adicional de enzimas es capaz de hacerlo en plantas, hongos y bacterias [5-7 ]. Síntesis general implica transferencia de AMP a partir de una acil-AMP o reacción enzima-AMP intermedio a un aceptor ATP. También puede ser degradado por una serie de enzimas, además de NUDT2, incluyendo FHIT [8], aprataxina [9] y fosfodiesterasas no específicos [3]. Sin embargo, NUDT2 se cree que es el principal responsable de mantener el bajo nivel de intracelular Ap
4A [10-12].
Un aumento en Ap
4A resultante de la activación de la síntesis, la inhibición de la degradación o ambos se ha implicado en diversos procesos intracelulares. tensiones genotóxicos, térmicas y otros conducen a una mayor Ap
4A [13-17] y así Ap
4A se ha implicado en la regulación de la replicación del ADN después de daño en el ADN y en la promoción de la apoptosis [17 a 19]. P
4A también puede elevarse en respuesta a ligandos externos y actuar como un segundo mensajero intracelular [20-22]. También actúa como un mensajero extracelular a través de su interacción con un número de receptores de tipo P2 [23]. Ap
4A es también un ligando para un número de proteínas incluyendo un complejo multiproteico que contiene ADN polimerasa-α [24, 25], proteínas quinasas [26-28], uracilo-ADN glicosilasa [29], chaperones de la proteína [30] , el supresor de tumor HINT1 [31], la 5'-nucleotidasa II [32], proteínas de dominio CBS [33, 34] y CFIm25 [35], pero en la mayoría de los casos el significado de esta unión no es clara. De particular interés, sin embargo, es la posibilidad de que Ap
4A puede actuar como un regulador transcripcional. Se ha sugerido que un mayor nivel de Ap
4A inducida en las células cebadas por factores externos activa la expresión de un subconjunto de genes controlados por los factores de MITF y de transcripción USF2 mediante la unión a y el desplazamiento de la proteína HINT1 inhibidora de estos factores [ ,,,0],10, 31, 36].
con el fin de determinar si la regulación transcripcional de p
4A se limita a relativamente pocos genes o es más generalizada, se ha analizado el transcriptoma de un derivado de final de la KBM- 7 línea celular (LMC) leucemia mieloide crónica [37] en el que el nivel intracelular de Ap
4A se ha aumentado 175 veces por la ruptura de la
NUDT2
gen (KBM-7-Nuko, se refiere de aquí en adelante como Nuko). Estas células muestran cambios profundos en la expresión génica en comparación con el KBM-7 línea celular padre con un total de 6288 genes expresados diferencialmente significativamente (DEGs) identificados. El ingenio
® Pathway Analysis se utiliza para resaltar las redes de genes y vías de señalización metabólica y afectados, revelando la baja regulación de interferón, la respuesta inmune inflamatoria y la innata y la regulación de los procesos que implican antígenos MHC de clase II. Además, muchos de los genes más fuertemente afectados tienen un papel en la promoción de la metástasis del cáncer y la invasión, lo que sugiere que NUDT2 puede ofrecer una novela, objetivo pleiotrópicos para la quimioterapia del cáncer.
Materiales y Métodos
Las células
el KBM-7 referencia clon B (número de producto. P00174E07) y el derivado de KBM-7-Nuko (P01289H04) en la que el
NUDT2
gen ha sido inactivado por inserción para atrapar genes retrovirales [ ,,,0],38] se obtuvieron de Haplogen y se mantuvo a 37 ° C en 5% (v /v) CO
2 /aire en Isocoves medio de Eagle modificado (IMEM, Sigma) suplementado con 10% (v /v) suero bovino fetal ( Sigma), 2 mM de L-glutamina (Sigma) y 100 mg ml
-1 penicilina-estreptomicina (Sigma).
Medición de Ap
4A y derivados
El nivel intracelular de Ap
4A en las células KBM-7 y Nuko fase logarítmica se determinó como se ha descrito anteriormente utilizando un ensayo luminométrico sensible con ligeras modificaciones para su uso con células en suspensión [17, 39]. Se recogieron las células de la suspensión mediante centrifugación a 500
g
durante 5 min y se utiliza para la extracción de nucleótidos. Ap
4A también se midió en el medio de cultivo sobrenadante de estas células, que se filtró a través de un filtro Millipore de 0,2 micras, desproteinizados con 10% TCA, a continuación, se ensayó como anteriormente. derivados de p
4A (ADPR-Ap
4A) se separaron por cromatografía de intercambio iónico y se identificó y se ensayó como se ha descrito anteriormente [17].
ensayos de inhibición del crecimiento
Las células (2 x 10
5) fueron sembradas en 25 cm
2 matraces que contenían 7 ml de medio de crecimiento. se añadieron los agentes químicos como se indica y las células cultivadas durante 96 horas a 37 ° C después de lo cual los cultivos se centrifugaron a 500
g
de 5 min, las células se resuspendieron en medio fresco, y se contaron usando un hemocitómetro. cuentas medias se normalizaron a la cantidad de elementos de la cultura sin tratar
análisis de RNA-Seq:. biblioteca de cDNA preparación y secuenciación
tres muestras independientes de RNA total se prepararon a partir tanto de KBM-7 y Nuko Células. La extracción de ARN se realizó con un mini kit Qiagen RNeasy con QIAshredder, y la cantidad y calidad determina usando un Nanodrop y Agilent Bioanalyzer. Para cada una de las seis muestras, 10 g de ARN fue tratado con DNasa usando un Ambion TURBO ADN
libre
™ kit y posteriormente se purificó usando perlas de AMPure XP. 2 g de ARN total tratado con DNasa se sometió entonces a la depleción de rRNA utilizando el oro Ribo-Zero (/ratón /rata humano) kit y se purificó de nuevo con perlas Ampure XP. agotamiento de éxito se evaluó utilizando un fluorómetro Qubit y Agilent 2100 Bioanalyzer y todo el RNA empobrecido se utilizó para la preparación de la biblioteca de ARN-Seq utilizando el protocolo v2 ScriptSeq. Después de 15 ciclos de amplificación de las bibliotecas se purificaron utilizando perlas Ampure XP. Cada biblioteca se cuantificó usando Qubit y la distribución del tamaño evaluó mediante el Agilent 2100 Bioanalyzer. Las bibliotecas finales se combinaron en cantidades equimolares utilizando los datos Qubit y Bioanalyzer. La cantidad y la calidad de cada piscina se evaluó con el Bioanalyzer y por qPCR utilizando el kit de KAPA Biblioteca cuantificación para plataformas Illumina en un Roche LC480II Light Cycler de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La plantilla de ADN fue desnaturalizado de acuerdo con el protocolo descrito en la guía del usuario Illumina CBot y cargado a una concentración de 21:00. La secuenciación se llevó a cabo en un carril de un Illumina HiSeq 2000 con la versión 3 química generando 2 × 100 pb extremo emparejado lee. El control de calidad se mantuvo con una PhiX espiga-en 1%.
El análisis bioinformático de los datos de RNA-Seq
Basecalling y de-multiplexación de indexado lee para cada biblioteca de la muestra se realizó mediante Casava 1.8. 2 (iluminación). archivos FASTQ primas fueron procesados mediante Cutadapt 1.2.1 [40] con la opción "-O 3" set para eliminar las secuencias adaptadoras de 3 pb o más. Las lecturas fueron recortados aún más el uso de la hoz 1.200 para separar las bases de baja calidad y, finalmente, lee & lt; 10 pb fueron retirados. La versión 2.0.10 TopHat2 alineador [41] fue utilizado para alinear el recortado R1-R2 leer pares a la asamblea de referencia del genoma humano GRCh38, que contiene 64,253 genes. Se utilizaron los parámetros por defecto, excepto para la opción de tipo de biblioteca, que fue establecido en "fr-secondstrand" para todas las muestras como el kit utilizado produjo una segunda cadena tipo de biblioteca (se espera R1 para mapear en el 5 '→ 3' hebra y R2 en el 3 '→ 5' hebra). Lee alinear a la referencia en más de una posición fueron descartados y los valores FKPM (fragmentos por transcripción kilobases por millón lee mapeados) calculado. análisis de expresión génica diferencial se llevó a cabo en el entorno R utilizando el paquete bordeadora [42]. Los datos de recuento se normalizaron a través de las bibliotecas usando la media M-valores recortadas método (TMM) en bordeadora con parámetros por defecto. Tagwise parámetros de dispersión se calcularon y luego se usa para acceder
2FC (log
2 veces el cambio) de estimación y prueba en bordeadora usando el cociente de probabilidad (LR prueba) [43].
Los valores P servicios asociados con el registro
2FC fueron ajustados para múltiples pruebas utilizando el método de Tasa de Falso Descubrimiento (FDR) [44]. DEGs significativos fueron definidos como aquellos con un
P & lt
valor ajustado-FDR; 0.05. Todos los datos de RNA-Seq originales producidos en este estudio han sido presentados a la base de datos EMBL-EBI ArrayExpress bajo el número de E-MTAB-4104.
RT-PCR análisis de los genes seleccionados
La extracción de RNA se realizó con un mini kit Qiagen RNeasy con QIAshredder y se sintetizó ADNc usando un kit de síntesis de cDNA Bioline Tetro, tanto de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cDNA se cuantificó mediante PCR utilizando SYBR Green Maxima mezcla maestra (Thermo) y un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus ™ (Applied Biosystems). Los cebadores se obtuvieron de Sigma y se enumeran en la Tabla S1. El 2 Se utilizó el método
-ΔΔCt para determinar los niveles de transcripción relativos utilizando un gen constitutivo GAPDH para normalizar los datos [45].
Pathway análisis
Los genes que muestra ≥ 2 veces arriba o baja regulación con un
P & lt
valor ajustado-FDR; 0,05 se analizaron mediante el uso de QIAGEN Ingenuity
® software Pathway Analysis (IPA
®, QIAGEN, Redwood City, http://www.ingenuity.com) con el fin de asignarlos a diferentes redes funcionales. IPA
® utiliza la mano curada Ingenuity® Knowledge Base, que contiene información de varios genes y la expresión de la proteína, la interacción y la anotación bases de datos tales como intacto, BIND y MIPS, así como de la literatura publicada [46]. También usamos IPA para identificar genes relacionados funcionalmente que corresponden a vías canónicas específicas que eran más significativo para el conjunto de datos a partir de una colección de 200 metabólico, en cascada y enfermedad-asociadas de señalización celular vías curada. La prueba exacta de Fisher de la independencia se utilizó para calcular la probabilidad de que la asociación entre los genes en el conjunto de datos y la vía canónica puede explicarse sólo por casualidad. Por último, se utilizó el análisis regulador de aguas arriba IPA para identificar los factores que pueden controlar los genes y las vías relieve por el análisis de red para proporcionar hipótesis comprobables para la regulación de genes de Ap
4A.
Resultados
nivel de p
4A en 7 KBM-células-Nuko
el padre KBM-7 línea utilizada en este estudio contiene el
BCR-ABL1
fusión de genes y las mutaciones que inactivan potencialmente en
TP53
y
NOTCH1
, pero carece de las otras aberraciones genéticas comunes que se encuentran en las neoplasias mieloides [38]. Expresa la mayoría de las proteínas anotadas a partir de una amplia gama de rutas de señalización, por lo que es una línea celular adecuada para este estudio. La ausencia completa de proteínas NUDT2 de la Nuko
NUDT2
de alteración fue confirmada por Western Blot (Fig 1). La concentración en estado estacionario de intracelular Ap
4A en células de mamífero no acentuadas está típicamente en el rango de 0,1-1,0 pmol /10
6 celdas (0,05-0,5 M), siendo la cantidad exacta especie y tipo de células dependientes [17, 47]. la fase de registro KBM-7 células tenían un nivel de 0,21 ± 0,02 (
n
= 3) /10
6 células pmol. Sin embargo, el derivado Nuko tuvo un aumento en el nivel 175 veces mayor de 36,9 ± 0,3 (
n
= 3) pmol /10
6 celdas, que proporciona la evidencia más clara de que Ap
4A es una importante sustrato NUDT2
in vivo
y que esta enzima juega un papel esencial en el mantenimiento del bajo nivel de fondo de Ap
4A. Tenga en cuenta que un contenido de p
4A de 1 pmol /10
6 células equivale más o menos a una concentración intracelular de 0,5 M si se distribuye de manera uniforme [17] por lo que el nivel en las células Nuko será de alrededor de 20 mM. En cuanto a si este alto nivel y los cambios resultantes en las células encontradas son biológicamente relevantes, hemos medido previamente hasta 20 mM p
4A en las células de reparación defectuosa de ADN tratados con mitomicina C [17] mientras que una concentración tan alta como 775 M se ha descrito en los mastocitos activados-FCεR1 [31]. El análisis cromatográfico de la Ap
4A a partir de células Nuko mostró que alrededor del 35% estaba presente en la forma de derivados ribosylated-ADP (ADPR-Ap
4A), principalmente mono-ADPR-Ap
4A (figura 1 ). Hemos demostrado previamente que el ADP-ribosilación de Ap
4A por PARP1 y PARP2 en células EM9 de hámster chino y los fibroblastos de embrión de ratón se produce en respuesta al daño del ADN [17]; Sin embargo, parece que el alto nivel de p
4A aquí está sujeta a constitutiva ADP-ribosilación.
Un extracto de nucleótidos a partir de células Nuko se sometió a cromatografía de intercambio iónico y las fracciones se ensayó para luminométricamente Ap
4A como se describe en Materiales y Métodos. Recuadro: una muestra de extractos NUDT2 y proteínas recombinantes de células KBM-7 y KBM-7 Nuko se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida y posteriores transferencias de nitrocelulosa probaron para la presencia de NUDT2 con policlonal de conejo anti-NUDT2 (Santa Cruz) seguido por la detección con HRP-conjugado IgG de cabra anti-conejo y ECL visualización (ECL Select, GE Healthcare). Ratón β-actina se detectó con HRP-conjugado de cabra anti-IgG de ratón (Santa Cruz).
RNA-Seq y análisis de la expresión génica diferencial
p
4A tiene han reportado para activar la transcripción de los subconjuntos de genes controlados por los factores de transcripción MITF y USF2 [31, 36]. En vista de esto, y para explorar aún más el fenotipo de las células
NUDT2
knockout, se realizó un análisis comparativo de los transcriptomes de células Nuko KBM-7 y por la RNA-Seq para identificar DEGs. Un promedio de 46,1 millones de pares de 100 pb de extremo emparejado lee por muestra se generaron que alinea a la referencia del genoma humano. alineación de los resultados se resumen en la Tabla 1, que muestra el número y porcentaje de lecturas asignadas para cada muestra. porcentajes de asignación para las seis muestras fueron entre 80,2 y 81,3%. 31.177 (48,5%) de los genes de referencia 64,253 tenía al menos una lectura alineados, mientras que 33,076 genes tenían ninguna lectura alineado de cualquiera de las seis muestras.
La diferencia en los perfiles de expresión génica entre los dos tipos de células se ilustra en el gráfico de Análisis de componentes Principales (PCA) de los datos de expresión génica log2 que se muestran en la figura 2A. Las muestras por triplicado de cada tipo de células se agrupan bien lejos unos de otros, lo que indica un alto grado de expresión génica diferencial entre ellos. Además, el mapa de calor de los coeficientes de correlación de Pearson en la figura 2B indica que los perfiles de expresión para las tres muestras del mismo tipo de células fueron mucho más estrechamente correlacionadas de muestras de diferentes tipos de células, lo que demuestra que el efecto de
NUDT2
nocaut sobre la expresión génica era mucho más fuerte que la influencia de las variaciones técnicas o biológicas entre muestras. El mapa de calor también muestra una correlación muy alta (R & gt; 0,99) entre las muestras del mismo tipo celular. Por lo tanto, podemos concluir que la expresión diferencial de genes detectados aquí es estadísticamente muy robusto.
(A) PCA trama de datos de expresión de genes que muestran el log 2 2
ª y 3
componentes principales RD. visualización (B) Mapa de calor de los coeficientes de correlación de Pearson de registro
2 la expresión de genes entre las muestras. Las tres muestras de tipo salvaje KBM-7 células se marcan WT1-ET3 y los de las células KBM-7-Nuko KO1-KO3. (C) MA trama que muestra la distribución de los niveles medios de expresión génica (log
2Counts por millón asignada lee) frente al log
2 veces el cambio (KO
vs
WT) para el gen respuestas individuales. genes de baja expresión (log
2CPM & lt; -5) son de color naranja. Importantes genes expresados diferencialmente (DEGs) son de color rojo; genes que muestran ningún cambio en la expresión son de color negro.
De los 31.177 lecturas asignadas (S2 Tabla) un total de 6.288 DEGs fueron identificados con un
P-valor
(FDR ajustado o por ) & lt; 0,05, de los cuales 2.550 fueron reguladas y 2.285 las reguladas con un factor de cambio ≥ 1,2 (Figura 2C y la Tabla S3). La trama MA en la figura 2C muestra una distribución bastante simétrica de los genes regulados hacia arriba y hacia abajo en todos los niveles de expresión. De estos genes, 980 fueron hasta reguladas y 705 el regulado con un factor de cambio ≥ 2. En ambos casos, el 88% tienen FPKM ≥ 0,3 para uno o ambos de los conjuntos de datos WT y KO. El 40 abajo con más fuerza y hasta regulado genes anotados se muestran en las Tablas 2 y 3, respectivamente. Tenga en cuenta que muchos de estos genes tenían cuenta cero de lectura, ya sea para el WT KO o conjuntos de datos que requieran la adición de una pequeña desviación del cero pseudocount por el software bordeadora para el cálculo de registro
2FC [42].
El análisis de ARN-Seq fue validado mediante la realización en tiempo real QRT-PCR en una selección de genes que representan diversas vías afectadas (Figura 3). Estos resultados confirmaron la dirección de regulación (arriba o abajo) para todos los genes estudiados. La magnitud del cambio también fue similar para la mayoría de los genes, con un coeficiente de correlación de 0,83 entre los dos conjuntos de datos (Fig 3, recuadro). Sin embargo, para algunos genes con un valor cero de FPKM para una de las muestras en el análisis de ARN-Seq, el uso del método pseudocount por bordeadora para calcular un factor de cambio ha llevado a un valor significativamente diferente, por ejemplo,
GFRA1
y
TNF
. Sin embargo, los valores calculados por bordeadora se utilizan en las siguientes discusiones ya que están disponibles para todos los genes y todavía son una buena indicación relativa del cambio en la expresión. Con el fin de mostrar que la expresión diferencial de genes observada correlaciona únicamente con un aumento de Ap
4A en lugar de los
derivados 4A ADPR-AP relacionadas, el análisis de QRT-PCR también se realizó con ARN extraído de células Nuko cultivadas en presencia de 100 nM KU-0.058.948, un inhibidor de PARP1 y PARP2 que impide la síntesis de ADPR-Ap
especies 4A [17]. Los resultados fueron muy similares a los obtenidos en ausencia de KU-0.058.948 (Fig 3), mostrando que, para estos genes, por lo menos, ADPR-Ap
4A no es la causa de la expresión diferencial. La función de ADPR-Ap
4A, en su caso, todavía no está claro.
análisis QRT-PCR se realizó en ARN seleccionados a partir de células Nuko KBM-7 y en presencia y ausencia de 100 nM de la inhibidor de PARP KU-0058948 utilizando los cebadores enumerados en la Tabla S1 como se describe en Materiales y Métodos y en el registro
2 veces el cambio en la expresión representa junto a los obtenidos por análisis de RNA-Seq. Recuadro: diagrama de correlación simple del registro
2 factores de cambio en la expresión obtenidos por la RNA-Seq (
x
eje x) y QRT-PCR sin inhibidor de PARP (
y
eje x ).
Ingenio
® Pathway Analysis
para colocar los datos de expresión génica en un contexto biológico, Ingenio
® Pathway Analysis (IPA
® software) se utiliza para asignar los DEGs a las vías canónicas conocidos y redes funcionales con el fin de predecir las funciones biológicas de los cambios transcripcionales. Por simplicidad, el análisis inicial incluía sólo los genes que estaban arriba o hacia abajo reguladas por ≥ 2 veces (
P Hotel & lt; 0,05); Sin embargo, cuando están presentes en las vías y redes resultantes, los genes arriba-abajo o reguladas por ≥ 1.2 también se considera de interés potencial ya que no hay justificación biológica para un valor de corte de 2. Se encontró que los DEGs asignada a un gran número de vías con una puntuación significativa de enriquecimiento (-log (
P
-valor)) (S4 Tabla). Mejor clasificado dentro de los dos conjuntos de genes regulados hacia arriba y hacia abajo, fueron vías relacionadas con la inmunidad y la inflamación de señalización. Vías asociadas principalmente con la respuesta inmune innata, tales como la activación de factores de interferón de regulación (IRF) por los receptores de reconocimiento de patrones (PRRS), y la inflamación se enriquecieron específicamente en el conjunto regulado hacia abajo de los genes, mientras que las funciones asociadas con antígenos del MHC de clase II eran específicos para el conjunto de genes regulados (Tabla 4). El predominio de estas vías en el conjunto de datos puede reflejar la naturaleza mieloide de la línea celular KBM-7 [37]. Estas vías se discuten en detalle a continuación.
respuesta de interferón y la inmunidad innata.
Los interferones son importantes mediadores de la respuesta inmune innata, que proporciona una defensa fundamental inicial contra los patógenos invasores (virus , bacterias, protozoos) después de la interacción de los componentes de los agentes patógenos y PRRs en diferentes compartimentos celulares. También pueden inhibir la proliferación celular, modulan la respuesta inmune adaptativa, y ser pro- o anti-inflamatoria, dependiendo del contexto [48-51]. La presentación de la serie de 4.835 DEGs con factor de cambio ≥ 1,2 a la base de datos Interferome (v2.01) [52] reveló un subconjunto de al menos 1.038 DEGs se sabe están regulados por IFN tipo I (IFN y IFNß) en otros sistemas. Aproximadamente la mitad de ellas se superponen con el conjunto de 944 que muestra la regulación conocida por los IFN Tipo II (IFN). Algunos (56) III regulación también mostró Tipo (IFNλ) con 15 de estos potencialmente exclusivos del tipo III (Tabla S5).
La figura 4 muestra el IPA
® vía canónica para la activación de los receptores de interferón (IFNRs ) por Tipo I y Tipo II interferones, con ejemplos de genes que se encuentran diferencialmente expresadas en este estudio resaltado. La mayoría de las funciones de esta vía se redujeron regulado, con expresión de
IFNB sobre ser la más afectada (15 veces, S3 Tabla). Las vías de señalización JAK-STAT son fundamentales para la respuesta de interferón. En el tipo de señalización II interferón, homodímeros STAT1 activadas se unen a la GAS (Interferón Gamma Secuencia Activado) promotor e inducir la expresión de genes, mientras que la señalización de tipo I implica la combinación de heterodímeros STAT1-STAT2 con irf9 (Interferón Factor de respuesta 9) que forma ISGF3 (Interferón estimulada génica Factor), que después se une al promotor ISRE (interferón-Stimulated Response Element).
STAT1
,
STAT2
y
irf9
eran todos abajo reguladas (1.4-, 1.8- y 3.7 veces, respectivamente), mientras que los supresores de la vía
SOCS1
y
PTPN2
fueron hasta reguladas (1,2-1,4 veces). Aunque leve individualmente, el efecto combinado de estos cambios, no obstante, podría ser significativo. Los aumentos en
SOCS1
y
PTPN2
también muestran que no hay sólo una supresión general de la expresión génica, sino que a través de la retroalimentación negativa de estos genes se conserva. Por último, varios de los genes STAT-controlado que están reguladas por sí mismos son activadores de otros genes de respuesta IFN, por ejemplo,
IRF1
,
IRF7
y
irf9 gratis (1.2-, 3.8- y 3.7 veces, respectivamente).
abajo de los genes regulados están en verde, hasta reguladas genes en rojo. La intensidad del color se corresponde con el factor de cambio; fronteras negrita destacan los genes con & gt; 2 veces el cambio en la expresión. Líneas corresponden a las interacciones físicas y flechas a las relaciones funcionales entre las proteínas. Las líneas continuas y flechas implican relaciones directas y líneas de puntos y flechas implican relaciones indirectas. relaciones funcionales incluyen modificaciones post-traduccionales, regulación de la transcripción, la proteólisis o co-expresión. puntas de flecha indican la inhibición planas.
La vía canónica en la figura 5 pone de relieve el papel de los tres PRRs helicasa RIG-1-al igual que de la respuesta inmune innata, RIG-1 (DDX58), MDA5 (IFIH1) y LGP2 (DHX58) en la activación de
IFNB
después de la estimulación por los ARN de doble cadena virales y la retroalimentación proporcionada por IFNß en la expresión de estos derechos y responsabilidades parentales. Los tres genes receptores están regulados hacia abajo (3.1-, 2.3- y 3.0 veces, respectivamente) (Tabla S3) en las células Nuko. Además,
IFITM2
y
IFITM3
, cuyos productos restringir la entrada de muchos virus [53], y los cuatro miembros de la familia antivirales IFIT que se unen los componentes virales (
IFIT1
,
2
,
3 Opiniones y
5
) [54] están reguladas hacia abajo entre 1,6 y 6,8 veces. Otros genes antivirales incluyen reguladas por
PKR
,
GBP1
y
TLR10
[55-58] (Tabla S3).
Explicación de símbolos que en la figura 4.
señalización de citoquinas, inflamación y NF-kB.
la interleucina-1 de señalización (IL-1) se encuentra en posición por el IPA
® como parte activa las reguladas vía (Tabla 4) con la expresión reducida de los miembros pro-inflamatorios importantes de la IL-1 superfamilia [59]. Por ejemplo, el ARNm de la IL-1β, su receptor IL-1R1 y proteína accesoria IL-1RAP se disminuyó de 1,5, 11.7- y 1,2 veces, respectivamente, mientras que IL-18, IL-18R1 e IL-18RAP están abajo 2.3-, 3.0- y 4.0 veces, respectivamente. La expresión de pro-inflamatoria
IL32
también se reduce de 5 veces, mientras que la expresión del factor de necrosis tumoral (
TNF
o
TNFa
), que puede activar tanto de tipo I IFN y el mediador inflamatorio NF-kB, es el regulado de 30 veces (Tabla S3). La vía canónica conduce a la activación transcripcional de NF-? B a través de IL-1, TNF y otros ligandos se muestra en la Fig 6. El complejo NF-kappa B es un importante mediador de las respuestas inflamatorias e inmunes y responde a PRRs y citoquinas pro-inflamatorias [ ,,,0],60]. Puede sinergia con STAT de señalización con el aumento de la inducción de genes diana que resultan de la unión de coordinar las estadísticas y NF-kB al gas y NF-kB promotores. Los componentes p50 y p52 del NF-kB complejo y el
RELB
transactivador están todas las reguladas, como lo son muchos de los componentes de las vías de señalización que conducen a la activación de NF-kB.
se sabe que IFN tipo I y TNF puede suprimir mutuamente expresión de cada uno, y se ha sugerido que los cambios en la cruz de regulación de estas vías pueden afectar el equilibrio entre las posibles funciones destructivas y de protección de estas citoquinas en la patogénesis de enfermedades autoinmunes enfermedades inflamatorias tales como el lupus eritematoso sistémico (SLE) y la artritis reumatoide (AR) [61]. IPA
® identifica señalización en la AR como una vía de alta clasificación canónica afectada (Tabla 4) y la lista de DEGs asociados con la AR y LES se muestran en la Tabla S6. A pesar de los modestos cambios en la expresión de algunos otros receptores de citoquinas podrían ser potencialmente pro-inflamatorias (por ejemplo,
IL10RA
y
IL23R
), el panorama general es uno de la supresión de la inflamación mediante la elevada Ap
4A, con la baja regulación de la señalización de NF-kB fuertemente caracterizado.
vías canónicas hasta reguladas y los antígenos MHC de clase II.
KBM-7 células pueden ser considerados como precursores inmaduros a las células presentadoras de antígeno profesionales, tales como los macrófagos y las células dendríticas y las vías canónicas casi la totalidad de los 20 primeros regulados arriba señalados por IPA
® implicar funciones asociadas con la respuesta inmune adaptativa, incluyendo la presentación de antígenos, la señalización OX40, el rechazo de aloinjertos y desarrollo de células B (Tabla 4 y Tabla S4). Sin embargo, se debe enfatizar que esto es en gran parte porque todas estas vías implican uno de los más destacados conjuntos de genes regulados hasta, los antígenos MHC de clase II (MHC inducibles-II). moléculas MHC-II se refieren principalmente a la presentación de antígenos derivados de patógenos extracelulares resultantes en T CD4 + de cebado de células cooperadoras y la producción de anticuerpos por las células B [62]. Casi todos los genes de clase II del subtipo muestran un aumento significativo en la expresión, con algunos que muestra un gran incremento, por ejemplo,
HLA-DOA
47 veces y
HLA-DPA1
de 12 veces. *
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