independiente de p53
Extracto
La nueva entidad molecular quinoxalinhydrazide derivado NVX-412 era identificado como un candidato a fármaco prometedor para el tratamiento de diversos tipos de cáncer debido a su actividad citotóxica fuerte y especificidad relativa. Aquí, proporcionamos primeros datos sobre los mecanismos de acción de NVX-412. Se demuestra que NVX-412 ejerce su actividad anti-neoplásica de una manera independiente de p53 y induce la detención de la fase S y daños en el ADN tal como se evaluó por tinción γH2AX. Se aconseja un modo de acción de NVX-412 (dependiente de la dosis) bi-modal, siendo principalmente citostático a un menor y predominantemente citotóxico a concentraciones más altas. Sobre la base de la amplia y consistente la actividad anti-neoplásica observado, NVX-412 es una promesa como un candidato a fármaco eficaz para el tratamiento de diversos tipos de cáncer, especialmente para neoplasias hematológicas con necesidad médica no satisfecha altamente
Visto:. Hebar A , Rütgen aC, Selzer e (2012) NVX-412, un candidato de Nueva Oncología de Drogas, induce la fase S-Detención y daño del ADN en las células del cáncer de Manera independiente de p53. PLoS ONE 7 (9): e45015. doi: 10.1371 /journal.pone.0045015
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Febrero, 2012; Aceptado: August 14, 2012; De publicación: septiembre 13 de, 2012
Copyright: © Hebar et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. eS es accionista y asesor de Novelix Pharmaceuticals, Inc. Novelix Pharmaceuticals, Inc. es el titular de la patente de NXV-412 y proporcionado NVX-412 para este estudio. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. De acuerdo con las cuentas de cáncer de la Organización Mundial de la Salud aproximadamente el 13% de todas las muertes en todo el mundo [1]. A pesar de la inversión extensa, la investigación y la investigación en las últimas décadas, los fármacos contra el cáncer disponibles en la actualidad están detrás de las expectativas y, por tanto, nuevos, agentes anticancerígenos bien tolerados e idealmente por vía oral bio-disponibles altamente activos están fuertemente necesarios. ácido pirazina-2-carboxílico N'- (7-fluoro-pirrolo [1,2-α] quinoxalin-4-il) ácido co-cristal de hidracida-oxálico, referido como NVX-412 (Figura 1), es una candidato a fármaco prometedor para el tratamiento de un número de tipos de cáncer. Este nuevo fármaco candidato entidad molecular cumple los criterios de la regla Lipinskís de cinco años, lo que da una primera pista sobre propiedades similares a las drogas y de si un candidato a fármaco putativo puede ser adecuado como un medicamento [2]. NVX-412 es un co-cristal de ácido oxálico y NVX-144, su compuesto líder de los padres. estructura de descubrimiento y química de NVX-144 fue descrito por Grande y colegas [3]. Pertenece a la clase química de quinoxalinhydrazides y se desarrolló a través de diseño racional de fármacos [3]. El hecho de que NVX-144 forma un co-cristal con ácido oxálico es de especial interés, ya que Aakeroy et al. han demostrado que los co-cristales de heterociclos que contienen nitrógeno con ácidos carboxílicos muestran ventajas sobre las sales correspondientes, relativa a determinadas propiedades físicas favorables para formulaciones farmacéuticas [4]. NVX-412 confirma esta noción, mostrando una mayor actividad citotóxica en comparación con el compuesto parental NVX-144 en las líneas celulares HT-29 y de carcinoma de colon HCT116 con una CI
50 que es 3-4 veces menor [3].
A: ácido pirazina-2-carboxílico N '- (7-fluoro-pirrolo [1,2-α] quinoxalin-4-il) hidrazida-oxálico ácido co-cristal; Fórmula molecular: C
18H
13FN
6O
5, peso molecular: 412 g /mol B: Solvente modelo de malla accesible. Blanco: de carbono; amarillo: flúor; azul: nitrógeno; rojo: el oxígeno. Ambas estructuras se generaron con ChemBio 3D Ultra 12.0 (CambridgeSoft, MA, EE.UU.).
Hasta ahora, el mecanismo de acción de NVX-412 no se conoce. Aquí, demostramos que NVX-412 es un nuevo agente anticanceroso prometedor que ejerce sus efectos antineoplásicos en una amplia gama de líneas de células tumorales de diferentes histología. Además, sugerimos que NVX-412 tiene un mecanismo bi-modal de acción citostática ser principalmente a un menor y predominantemente citotóxico a concentraciones más altas. Se demuestra que NVX-412 induce la detención de la fase S, así como daños en el ADN y una disminución en la replicación del ADN. El modo de acción de NVX-412 es independiente de p53.
Materiales y Métodos
Medicamentos
NVX-412 (Figura 1) se obtuvo de Novelix Pharmaceuticals, Inc. (La Jolla, CA, EE.UU.). Para
in vitro
estudios en, el compuesto se disolvió en DMSO (25 almacena mM a -80 ° C) y se diluye a las concentraciones indicadas. Nutlin-3 y (S) - (+) - camptotecina (CPT) se adquirieron de Sigma-Aldrich (Viena, AUT) y se disolvió en DMSO (stocks: 3,5 mM y 5 mg /ml, respectivamente). Todas las soluciones estaban recién preparados antes de su uso.
NCI-60 DTP (Developmental Therapeutics Program) Tumor Humano Línea celular de la pantalla
NVX-412 se incluyó en una pantalla de actividad anti-cáncer por el Nacional del Cáncer Institute (NCI) [5]. El compuesto se ensayó frente a 59 líneas de células tumorales humanas diferentes, lo que representa la leucemia, melanoma y cánceres de pulmón, colon, cerebro, ovario, mama, próstata y riñón (para una lista completa de las líneas celulares consulte Shoemaker y cols., 2006 [5]). La metodología de este
in vitro pantalla cáncer en
se describe en detalle en el sitio web del NCI (http://dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.html). Brevemente, las líneas celulares de tumores humanos del panel de detección de cáncer fueron cultivadas en RPMI 1640 que contiene 5% de FCS y 2 mM L-glutamina en placas de 96 pocillos a densidades que van desde 5.000 a 40.000 células /pocillo. Después de 24 horas se añadió el fármaco experimental a 5 concentraciones más el control y las células se incubaron durante 48 horas adicionales. Para la determinación del efecto inhibidor del crecimiento del compuesto se realizó un ensayo de sulforodamina B que emplea una etapa de fijación química al final del tratamiento de la droga y una posterior tinción durante 10 minutos. Después de una etapa de lavado, la absorbancia se determinó a 515 nm. Tres parámetros de respuesta a dosis diferentes se calculan entonces: inhibición del crecimiento de 50% (GI
50), que es la concentración de fármaco que resulta en una reducción del 50% en el incremento neto de proteínas, la concentración de fármaco que resulta en la inhibición total de crecimiento (TGI) y la LC
50, lo que indica una pérdida neta de células después del tratamiento [5].
las curvas de dosis-respuesta de HT-29, HepG2, HeLa y células cancerosas HCT116. Las células se incubaron con las concentraciones indicadas de NVX-412 durante 72 horas y se contaron con un Beckman Coulter ViCell XR. B: supervivencia clonogénico de células HepG2 y HT-29. células HepG2 y HT-29 se incubaron con las concentraciones indicadas de NVX-412 durante 12 o 14 días, respectivamente. supervivencia clonogénico se redujo significativamente en una manera dependiente de la dosis. la cinética de proliferación más de un tratamiento de tres días con diferentes concentraciones de NVX-412 en células HT-29 que muestra la proliferación significativamente reducido a 300 nM y una disminución en el número de células en 1 tratamiento mu M NVX-412: C. Los datos representan valores medios (± DE) de al menos 2 experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 5.0. * Indica que el valor de p & lt; 0,05, **** indica el valor de p. & Lt; 0,0001 (ANOVA de dos vías)
Líneas Celulares
Las siguientes líneas celulares eran utilizados en este estudio (líneas celulares de NCI-60 pantalla de línea celular de tumor humano DTP no incluidos): El isogénica colorrectal humano de células de carcinoma líneas HCT116 p53 + /+ y p53 - /- y RKO p53 + /+ y p53 - /- fueron adquiridos de Horizonte Descubrimiento Ltd. (Cambridge, Reino Unido) y se cultivaron en medio 5A de McCoy suplementado con 10% de FCS, 1% Pen Strep y 2 mM L-glutamina (siempre que no se especifica el estado de p53 de las células HCT116 se utilizaron células p53 + /+) . CLBL-1 (linfoma de células B canino) [6], OSW [7] y CL 1-(canino linfoma de células T) [8] y GL-1 (leucemia de células B canino) [9] las líneas de células fueron amablemente proporcionada por BC Rütgen (Universidad de Medicina Veterinaria de Viena, Viena, AUT), y se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS y 1% Pen Strep. Las células B no Hodgkin líneas celulares de linfoma SU-DHL-6 y SU-DHL-8, comprado de DSMZ (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, GER), se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS y 1% Pen Strep. Las mismas condiciones de cultivo se utilizaron para todos los demás linfoma y celulares de leucemia líneas Raji [10], [11], Ramos [10], [11], KG-1 [10], [12], [13], [14 ], KG-1a [14], HL-60 [10], [12], [13], BV173 [10], [11], NALM-1 [12], [13] y K562 [10], [ ,,,0],12], [13], que fueron amablemente proporcionados por el P. Valent (Universidad de Medicina de Viena, Viena, AUT) y están todas las publicaciones anteriores líneas celulares disponibles procedente del ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE.UU.) o DSMZ . HS27, una línea celular de fibroblastos normales, fue proporcionado por D. (Centro de Investigación de Medicina Molecular, Viena, AUT) Barlow y se cultivó en DMEM con 10% de FCS y 1% Pen Strep [15], [16]. Hs578T se cultivaron en medio esencial mínimo-α (MEM) suplementado con 10% de FCS, 1% Pen Strep y 1% de L-glutamina y tratara de una especie de regalo de T. ronco (Universidad de Medicina de Viena, Viena, AUT) [17] . Ambas líneas celulares, Hs27 y Hs578T, están disponibles de ATCC. células humanas normales HUVEC endoteliales de vena umbilical se adquirieron de Lonza (Walkersville, Maryland, EE.UU.) y se cultivaron en medios Clonetics® EGM® BulletKit. preadipocitos humanos blancos (PMR) fueron adquiridos de PromoCell (Heidelberg, GER) y se cultivaron en medio de crecimiento de preadipocitos proporcionada por la empresa. La línea celular de adenocarcinoma de mama MCF-7, la línea celular de carcinoma cervical HeLa, la línea celular de carcinoma hepatocelular HepG2 y la línea celular de adenocarcinoma colorrectal se obtuvieron HT-29 a partir de ATCC y se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de FCS y 1% Pen Strep . Si no se indica lo contrario, todos los reactivos de cultivo celular fueron adquiridos de Gibco (Grand Island, NY, EE.UU.).
HCT116, HeLa y células HT-29 fueron tratados durante un máximo de 72 horas como se indica. Un control de DMSO se llevó a cabo, pero no mostró diferencias con respecto a UTC. Después se tomaron 24, 48 y 72 horas las imágenes (A, C, E). Los paneles B, D y F muestran la cuantificación de los tamaños de células después del tratamiento de 48 horas con concentraciones indicadas de NVX-412. diagramas de cajas representan los datos de células contadas dentro de los 5 campos de vista diferentes. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 5.0. **** Indica el valor de p & lt; 0,0001 (Mann-Whitney U Test). A, B: HCT116. C, D: HeLa. E, F: HT-29. UTC, control no tratadas; CPT, camptotecina.
Ensayos de citotoxicidad
Las células se sembraron en placas de 24 pocillos. Después se dejó que las células se recuperaran durante 24 horas, NVX-412 se añadió en medio de crecimiento fresco. La concentración de DMSO máxima alcanzada en todos los experimentos fue inferior a 0,01%. experimentos de control correspondiente en la concentración más alta de DMSO se realizaron con el fin de descartar los efectos inducida con DMSO. Después de 72 horas de incubación se determinó la proporción de células viables por recuento de células con un contador de partículas Coulter Z1 (Beckman Coulter, Viena, AUT), un ViCell XR (Beckman Coulter, Viena, AUT) o un contador de CASY® Cell (Schärfe, Reutlingen , Alemania). La citotoxicidad se expresa como IC
50 valores que se derivaron de las curvas de dosis-respuesta correspondientes.
Ensayos clonogénicos
células
En ensayos por clonación, HT-29 y HepG2 se sembraron en 60 mm platos a una densidad de 1000 células por placa. Después de 24 horas se añadió NVX-412 a las concentraciones indicadas. Después de cultivar durante 12-14 días (cuando las colonias fueron evaluables visible), las colonias se fijaron en etanol al 70%, se tiñeron con 0,5% de violeta cristal y se contaron manualmente.
análisis de Western Blot para p-p53 (Ser15) en las células HCT116 después de 24 y 48 horas de incubación con 0, 0,15, 0,5 y 1 M NVX-412 y 1 CPT mu M como control positivo. B: tinción de inmunofluorescencia correspondiente para p-p53 (Ser15) (verde) de las células HCT116 después de 24 horas de incubación con 0, 0,15, 0,5 y 1 M NVX-412 y 1 CPT mu M como control positivo. Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (azul). C: Confirmación del estado de p53 en HCT116 p53 + /+ y p53 - /- células por inmunotransferencia. Las células se cultivaron en presencia y ausencia de 375 M 5-FU durante 24 horas. D, E: números de la célula de p53 HCT116 + /+ o p53 - /- (D), p53 RKO + /+ o p53 - /- células (E) después de 72 horas de incubación con NVX-412 o Nutlin-3. Las células se cultivaron durante 72 horas con diferentes concentraciones de NVX-412 o Nutlin-3, respectivamente. el número de células viables se determinaron utilizando un XR Beckman Coulter ViCell. Los datos representan valores medios (± DE) de dos experimentos independientes.
Proliferación Kinetics
células
HT-29 se sembraron (2 × 10
4 células /pocillo) en 24 -Bueno placas. Después de un período de recuperación de 24 horas, NVX-412 se añadió en medio de crecimiento fresco a concentraciones finales de 0, 300 y 1000 nM, respectivamente. Después de 24, 48 y 72 horas el número de células se determinó con un contador de partículas Coulter Z1.
Morfología Los ensayos
Para investigar los posibles cambios morfológicos en el tratamiento con NVX-412, HCT116, HeLa y HT- 29 células se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron durante hasta 72 horas con las concentraciones indicadas de NVX-412, DMSO como control del vehículo y 1 M camptotecina (CPT) como un control positivo para la morfología apoptótica. Los experimentos de control se llevaron a cabo para asegurar que los cambios morfológicos no se deben a diferencias en la confluencia. Después de 24, 48 y 72 horas se tomaron fotografías con un sistema de microscopio y una cámara Olympus IX71 invertido (Olympus color Ver III) a 20 × magnificación.
La cuantificación de los tamaños celulares
tamaños celulares se cuantificaron utilizando software especializado de formación de imágenes (ImageJ 1.45d, NIH de Estados Unidos, Bethesda, MD, EE.UU.). superficies medias de todas las células presentes dentro de los 5 campos de vista diferentes por muestra se determinaron después de 48 horas de tratamiento con 0, 0,15 y 1 mM NVX-412. Se utilizó la prueba no paramétrica de Mann-Whitney para evaluar la significación estadística de las diferencias entre los tamaños de celda, ya que la prueba de Kolmogorov-Smirnov mostró que los datos no se distribuyen normalmente (GraphPad Prism 5.0, La Jolla, CA, EE.UU.).
a: análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo para HT-29, HeLa y células HCT116 tratados durante 24 horas como se indica con NVX-412 o CPT. Los porcentajes de células en G1, se muestran S y G2 /M fase del ciclo celular. Las células se analizaron usando un BD FACScan. B: NVX-412 reduce la replicación del ADN de una manera reversible en HeLa y células HCT116. células HeLa y HCT116 se trataron durante 24 horas como se indica. Además, después de 24 horas de tratamiento de células se dejaron recuperar durante 24 horas en medio de crecimiento normal sin NVX-412 o CPT. tasa de replicación del ADN se analizó la incorporación de BrdU. C: Western Blot para pChk1 (Ser296) en las células HCT116 después de 0-48 horas de incubación con 150 nM NVX-412. D: NVX-412 induce γH2AX en células HeLa de una manera reversible. Las células fueron tratadas durante 3 y 24 horas como se indica. Además, después de 24 horas de tratamiento de células se dejaron recuperar durante 24 horas en medio de crecimiento normal sin NVX-412 o CPT. Los datos representan el cambio veces en la intensidad media de fluorescencia γH2AX por núcleo (± DE), según la cantidad de tinciones de inmunofluorescencia. UTC, control no tratadas; CPT, camptotecina. se muestran los valores medios de al menos 2 experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 5.0. **** Indica el valor de p. & Lt; 0,0001 (ANOVA de dos vías) guía empresas
Western Blot
Las células tratadas se lisaron directamente en tampón de lisis celular NP40 (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.) que contiene inhibidores de la proteasa y de fosfatasa. Las concentraciones de proteína se midieron colorimétricamente (D
C de ensayo de proteínas, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Las proteínas fueron separadas por SDS - electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Whatman ™, Viena, AUT). La igualdad de carga fue verificada por Ponceau S (Serva, Heidelberg, GER) tinción. El antígeno unido se visualizó con la mejora del sistema de detección de quimioluminiscencia (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EE.UU.). Estos procedimientos se realizaron de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se utilizaron anticuerpos específicos para las siguientes proteínas de interés: pChk1 (Ser296), p-p53 (Ser15), β-tubulina y GAPDH se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE.UU.) a una dilución 1:1000. Los anticuerpos secundarios fueron etiquetados con peroxidasa de cabra anti-conejo o IgG (Cell Signaling Technology) de ratón anti-(1:2000).
La tinción de inmunofluorescencia de p-p53 (Ser15) y γH2AX (Ser139)
HCT116 y células HeLa fueron sembradas en cubreobjetos de vidrio en placas de 6 pocillos. 24 horas después de la siembra, las células HCT116 se incubaron con 0,15, 0,5 y 1 M NVX-412 y 1 CPT mu M durante 24 horas para la tinción de p-p53. Para investigar γH2AX, las células HeLa se incubaron con 0,21, 0,5 y 1 M NVX-412 y 1 CPT mu M durante 3 o 24 horas. Además, se permitió que las células se recuperaran durante 24 horas en medio de crecimiento normal después de 24 horas de incubación con NVX-412 o CPT (experimento lavar-out). Después de los respectivos tratamientos, las células se lavaron y se fijaron con 4% de formaldehído libre de metanol (Polysciences Inc. Warrington, PA, EE.UU.) durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 /PBS durante 2 minutos a habitación temperatura. Después de bloquear con suero de cabra (5%) en 1% BSA /0,3% Triton X-100 /PBS, se añadió el anticuerpo primario respectivo y las células se incubaron a 4 ° C durante la noche. Los anticuerpos utilizados fueron: ratón p-p53 (Ser15) (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.) a 1:100 dilución y el ratón p-H2AX (Ser139) (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) a la dilución en 1:1000 1% BSA /PBS, respectivamente. Después, las células se lavaron 3 veces durante 10 minutos con 0,25% de BSA /0,1% Triton X-100 /PBS y se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 anti-ratón (1:1000 en 0,25% de BSA /0,1% Triton X-100 /PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Las células se lavaron 3 veces durante 10 minutos con 0,05% de Tween-20 /PBS que contiene Hoechst 33342 (Sigma Aldrich, Viena, AUT) y montado con medio de montaje (Fluoprep, bioMérieux, Marcy l'Etoile, FRA). La fluorescencia se registró inmediatamente en un microscopio de barrido láser Zeiss LSM700.
La cuantificación de γH2AX
El procedimiento común para la evaluación de la inducción γH2AX es contar γH2AX focos. Ya que con NVX-412 y el control positivo de activación CPT γH2AX fue que se observaron fuertes, no hay focos distinguibles y contables. Por lo tanto, se determinó la intensidad media de fluorescencia γH2AX por núcleo. Con este fin, las intensidades γH2AX dentro de un determinado campo se midieron utilizando Cantidad Uno -4.6.9 (versión básica gratuita, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) y se divide por el número de núcleos en este campo.
Determinación de la situación de dependencia de p53
Las células de carcinoma de colon HCT116 líneas isogénicas p53 + /+ o p53 - /- y RKO p53 + /+ o p53 - /- se cultivaron en placas de 12 pocillos. Después de un período de recuperación de 24 horas, se añadió NVX-412 o Nutlin-3 en medio de crecimiento fresco a las concentraciones indicadas. se utilizó Nutlin-3, un antagonista de MDM2 y por lo tanto p53 activador vía para demostrar los efectos biológicos diferenciales del estado de p53. Después de 24 o 72 horas, el número de células se determinaron con un Beckman Coulter ViCell XR.
réplica de la Tasa de
HeLa y células HCT116 se sembraron en negro placas de 96 pocillos. Después se dejó que las células se recuperaran durante 24 horas NVX-412 o CPT ha sido incorporado en el medio de cultivo fresco. Después de 24 horas de incubación a quimioluminiscente de incorporación de BrdU ELISA (Roche Applied Science, Penzberg, Alemania) se realizó con medio de las placas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células en las placas restantes se dejaron recuperar durante 24 horas en medio de crecimiento normal antes de la replicación del ADN se midió (experimento lavar-out). Para comprobar si un posible descenso en la tasa de replicación del ADN no se debe simplemente a número de células más bajos debido a la inducción de la muerte celular, se determinó la proporción de células viables en paralelo por un ensayo de citotoxicidad basado en MTT de acuerdo con el protocolo del fabricante (EZ4U, Biomedica, Viena, Austria). Colorimétrico (a 492 y 620 nm) y mediciones de quimioluminiscencia se realizaron utilizando un FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania).
Los análisis de citometría de flujo del Ciclo Celular
HT-29, HeLa y HCT116 Las células se sembraron en placas de 6 pocillos. Después se dejó que las células se recuperaran durante 24 horas, NVX-412 se añadió en medio de crecimiento fresco en el respectivo IC
50 concentración y 0,5 y 1 mM. CPT se utilizó a 50 nM y 1 mM. Para analizar la distribución del ciclo celular, las células se recogieron después de 24 horas de incubación y se lavaron con PBS. Las células se fijaron en etanol al 70% durante al menos 2 horas. Para el análisis, las células se transfirieron a PBS, se incubaron con RNasa A (concentración final 0,04 mg /ml) durante 30 minutos a 37 ° C, se trató con 40 g /l de yoduro de propidio durante 30 minutos a 4 ° C y luego se analizaron por citometría de flujo utilizando FACScan BD (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.). Los histogramas de ADN resultantes se cuantificaron utilizando ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME, EE.UU.)
Análisis estadísticos
Si no se indica lo contrario, de dos vías ANOVA (análisis de varianza;. GraphPad Prism 5.0) se utilizó para evaluar la significación estadística de las diferencias entre los datos.
resultados
NVX-412 ejerce una fuerte actividad anti-neoplásica
para obtener una visión independiente de el rango de actividad de NVX-412 (Figura 1) contra un panel de líneas celulares de cáncer bien descritos, el candidato a fármaco se incluye en una pantalla de actividad anti-cáncer realizada por el NCI contra 59 líneas celulares de tumores humanos diferentes procedentes de diversos cáncer tipos. Esta pantalla reveló una actividad anti-cáncer muy fuerte y amplia de NVX-412 en líneas de células tumorales de todos los tipos de cáncer en el rango nanomolar bajo con una IC media
50 de alrededor de 200 nM (Tabla 1). líneas celulares leucémicas eran más sensibles, con una media de CI
50 de 62 nM. Además de la DTP humano Línea pantalla Tumor Cell NCI-60 (véase la Tabla 2), se probaron líneas celulares adicionales derivados de diversas entidades tumorales y dos especies diferentes, incluyendo células caninas células normales no cancerosas y humanos y también. De acuerdo con los datos obtenidos en la pantalla de NCI, estos datos mostraron que la actividad anti-cáncer en todas las líneas celulares ensayadas en toda una variedad de tipos de tumores. La Figura 2A muestra las curvas de dosis-respuesta para HT-29 adenocarcinoma de colon, carcinoma hepatocelular HepG2, carcinoma cervical HeLa y células de carcinoma de colon HCT116, que son líneas celulares utilizadas para todos los experimentos adicionales en este estudio. Las células normales endoteliales humanas (HUVEC) y preadipocitos humanos blancos (PMR) muestran una sensibilidad reducida en comparación con líneas celulares de cáncer. Para las células HUVEC el CI
50 se determinó en 2,0 M y de los preadipocitos humanos blancos hwp a 1,0 M, respectivamente.
NVX-412 muestra la actividad bi-modal y Cambios morfológicos Induce
para entender mejor los efectos inducidos por NVX-412, se realizaron de crecimiento celular, la supervivencia celular y la muerte celular experimentos. ensayos de supervivencia clonogénicos [18] se realizaron con HepG2 y células HT-29. Las células se incubaron con diferentes concentraciones de NVX-412 durante 12 o 14 días, respectivamente. Como puede verse en la Figura 2B, NVX-412 reduce la capacidad de HepG2 y células HT-29 para formar colonias de una manera dependiente de la dosis. Es de destacar que la concentración de NVX-412 para lograr efectos mitad de la máxima determinados por el ensayo clonogénico es similar a la concentración determinada por el ensayo de proliferación de 3 días. la cinética de proliferación se determinó más de 3 días de tratamiento con células HT-29 de carcinoma de colon (Figura 2C). En el IC
50 (300 nM), la proliferación de las células se redujo significativamente después de 2 días en comparación con las células de control no tratadas. A concentraciones por encima de la IC
50 (a 1 M), el número de células comenzaron a disminuir por debajo de los números de células sembradas en el comienzo del experimento, lo que sugiere una inducción directa de la muerte celular, así como la detención del ciclo celular. Además, la morfología de las células expuestas a NVX-412 ya sea en el
50 o mayores concentraciones de IC (1 M) se investigó en HCT116, HeLa y HT-29 células (figuras 3A, C, E). El tratamiento con NVX-412 en el IC
50 dio lugar a cambios en el aspecto morfológico de los tres tipos de células investigadas en 24 horas; las células parecían más grandes que las células no tratadas. DMSO solo como control de vehículo no cambian la apariencia morfológica (control DMSO no mostrado). Para investigar este fenómeno interesante en más detalle, los tamaños de células se cuantificaron después de tratamiento de 48 horas con NVX-412. Un aumento altamente significativo en tamaños de celda se observó para las tres líneas celulares analizadas (Figura 3B, D, F). Durante los siguientes 48 horas una disminución de las densidades de células se observó para HCT116, HeLa y las células HT-29. Sin embargo, esta situación cambió drásticamente cuando se aplicaron concentraciones más altas de NVX-412. Una vez más, las células muestran una apariencia morfológica alterada y tamaño ampliado en comparación con las células no tratadas (Figura 3), pero ya después de 48 horas el número de separarse y las células muertas aumentaron (datos no mostrados), similar a la del tratamiento con el CPT inductor de muerte celular.
Hechos NVX-412 p53 estado Independiente
Para investigar una posible dependencia del estado de p53 NVX-412, se determinó el estado de fosforilación de p53 en Ser15 [19], [20]. tinciones de inmunofluorescencia para p53 fosforilada en Ser15 se realizaron en las células HCT116 después de 24 horas de incubación con diferentes concentraciones de NVX-412 (Figura 4B). Como se esperaba, las células tratadas con CPT 1 M fueron positivos para la tinción nuclear de p-p53 (Ser15), mientras que las células no tratadas eran claramente negativo. La incubación con el IC
50 concentración de NVX-412 no condujo a p-p53 tinción (Ser15), mientras que las células tratadas con concentraciones más altas (0,5 y 1 mM) mostraron una tinción positiva. Esto se correlaciona con el análisis de transferencia Western que se realizó en las mismas condiciones y con los mismos puntos de tiempo después de 24 y 48 horas (Figura 4A). Una vez más, las células no tratadas y células tratadas por debajo o en el IC
50 fueron negativos para p53 fosforilada, mientras que el experimento de control con CPT 1 M y las células tratadas con NVX-412 a concentraciones por encima de la IC
50 mostró una fuerte inducción .
Para investigar más a fondo un potencial de dependencia de estado de p53 de la actividad de NVx 412-dos modelos diferentes de líneas celulares isogénicas solamente difieren en su estado de p53 fueron investigados; células HCT116 con una p53 + /+ o p53 - /- fenotipo, y células RKO con un p53 + /+ o p53 - /- fenotipo. El estado de p53 de las células se confirmó por inmunotransferencia (Figura 4C). En la Figura 4D y 4E las curvas de dosis-respuesta para NVX-412 y el control Nutlin-3 en p53 + /+ y p53 - /- se muestran las células. Se pudo demostrar que en ambas líneas celulares, HCT116 y RKO, el estado de p53 no influye en la sensibilidad a la NVX-412; los valores de IC50 para las líneas celulares isogénicas eran comparables. En contraste con los que la respuesta a Nutlin-3 mostró una dependencia clara la condición de p53, p53 con células + /+ es mucho más sensible que la p53 - /-. Celdas de detención
NVX-412 Induce la fase S, aumenta los niveles los marcadores de daño en el ADN y reduce la réplica de la
a partir de los resultados descritos anteriormente, hemos tratado de obtener mayor conocimiento en los efectos del ciclo celular de NVX-412. Por lo tanto, se realizó un análisis del ciclo celular por citometría de flujo en células HeLa, y HCT116 HT-29. En las tres líneas celulares investigado un aumento dependiente de la dosis en la fracción de células en fase S se observó después de 24 horas de incubación con NVX-412 (Figura 5A). Ya después de 24 horas de tratamiento con NVX-412 en CI
50 concentraciones se observó un aumento en el número relativo de células en fase S que se hizo aún más pronunciada con concentraciones más altas. Además, un aumento en la población de células sub-G0 /G1, que es característica de las células apoptóticas, se observó a concentraciones más altas de NVX-412 y también de CPT (datos no presentados). CPT sirvió como control positivo para G2 /M o la detención de la fase S. En células HeLa HT-29 y CPT inducida G2 /M detención a 50 nM y la detención de la fase S a 1 mM. En las células HCT116 50 nM CPT indujo también la detención /M-fase G2, mientras que a una concentración de 1 mM mayoría de las células ya estaban muertos (que no se muestra en la figura). El retraso del ciclo celular observado por análisis FACS es compatible con los resultados de ELISAs incorporación de BrdU que mostraron una reducción de la replicación del ADN en el tratamiento NVX-412 en HeLa y células HCT116 (Figura 5B). Una vez más, CPT se utilizó como control positivo para la reducción de la tasa de replicación del ADN. Curiosamente, cuando se permitió que las células se recuperaran durante 24 horas en medio de crecimiento normal después del tratamiento de 24 horas, la replicación del ADN se recuperó y la tasa aumentó a niveles normales, tanto en células HeLa y en células HCT116. Después del tratamiento CPT una recuperación sólo se observó en la concentración más baja ensayada. Para estudiar un posible daño en el ADN efecto de inducir NVX-412, se investigaron los cambios en el estado de fosforilación Ser296 de Chk1. La fosforilación se encontró que aumentarse después de 4 horas de tratamiento NVX-412, que es indicativo de un efecto de daño del ADN (Figura 5C). Para dar seguimiento a esta observación, la inducción de γH2AX focos se determinó mediante la tinción de inmunofluorescencia en células HeLa (Figura 5D). se encontraron niveles γH2AX a ser elevados después de un tratamiento de 24 horas en una forma dependiente de la dosis. En línea con la capacidad de las células para restablecer su tasa de replicación del ADN normal después de un período de recuperación de 24 horas (Figura 5B), los niveles de γH2AX disminuyeron a niveles casi basales dentro de las 24 horas después de la retirada de NVX-412 (Figura 5D, barras negras ). El efecto de 1 M CPT que se utilizó como control positivo para la inducción γH2AX no era reversible.
Discusión
Hemos investigado la actividad anti-neoplásica de NVX-412, un nuevo candidato a fármaco. En una pantalla completa realizada por el NCI, NVX-412 se encontró que ejercer una fuerte actividad anti-cáncer en el rango submicromolar con un promedio IC
50 de 200 nM para todas las líneas celulares combinados. Los datos adicionales recogidos de 21 líneas celulares de cáncer de relieve la actividad potente contra el cáncer de NVX-412. Nuestros hallazgos iniciales proporcionan la primera evidencia de que NVX-412 es una interesante investigación -. Candidato a fármaco fase que pueden ser prometedoras como terapéutica, en particular contra las neoplasias hematológicas
ensayos de supervivencia clonogénicos demostraron que NVX-412 redujo significativamente o completamente bloqueado la capacidad de HepG2 y células HT-29 para formar colonias. Estos resultados confirman bien los resultados de experimentos de proliferación a corto plazo.