Extracto
El cáncer de ovario (OvCa) es la quinta causa más común de muerte por todos los cánceres entre mujeres en Estados Unidos y cerca de la principal causa de muerte por tumores malignos ginecológicos. Aunque la mayoría de los pacientes responden inicialmente a Ovča citorreducción quirúrgica y la quimioterapia, el 75% de los pacientes después sucumbir a la enfermedad. Por lo tanto, hay una necesidad urgente para probar nuevos agentes terapéuticos para contrarrestar la alta tasa de mortalidad asociada con OvCa. En este contexto, hemos desarrollado y fabricado Nanoceria (NCE), las nanopartículas de óxido de cerio, que posee propiedades anti-oxidantes, para ser utilizado como agente terapéutico en OvCa. Se demuestra por primera vez que NCE producción significativamente inhibido de especies reactivas de oxígeno (ROS) en las células A2780, el factor de crecimiento atenuado (sdf1, HB-EGF, VEGF
165 y HGF) mediada por la migración celular y la invasión de las células SKOV3, sin que afectan a la proliferación celular. tratamiento NCE también inhibió VEGF
165 proliferación inducida, la formación del tubo capilar, la activación de VEGFR2 y MMP2 en células humanas umbilicales vasculares endoteliales (HUVEC). NCE (0,1 mg /kg cuerpo pesan) tratamiento de las células de cáncer de ovario A2780 inyectados intraperitonealmente en ratones desnudos mostró una reducción significativa (p & lt; 0,002) en el crecimiento tumoral acompañado por disminución de la proliferación de células tumorales, como es evidente de la reducción de tamaño del tumor y tinción de Ki67. La acumulación de NCE se encontró en tumores aislados de grupo tratado utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM) y espectroscopia de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). La reducción de la masa tumoral fue acompañada por la atenuación de la angiogénesis, como se observa por la reducción de la tinción de CD31 y la apoptosis específica de células endoteliales vasculares. En conjunto, estos resultados indican que NCE a base de óxido de cerio es una novela de nanopartículas que potencialmente puede ser utilizado como un agente terapéutico anti-angiogénicos en el cáncer de ovario
Visto:. Giri S, Karakoti A, Graham RP, Maguire JL, Reilly CM, sello S, et al. (2013) Nanoceria: Una tierras raras de nanopartículas como un nuevo agente terapéutico antiangiogénico en cáncer de ovario. PLoS ONE 8 (1): e54578. doi: 10.1371 /journal.pone.0054578
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Julio, 2011; Aceptado: 13 de diciembre de 2012; Publicado: 31 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Giri et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio es apoyado principalmente por CA123249 y el apoyo de la Clínica Mayo de la Facultad de Medicina de VS y apoyado en parte por Marsh Rivkin otorga a SG y RR. Este trabajo fue apoyado en parte por la NSF EBNC, 0.708.172 y 0.930.170 de SS (para el desarrollo de nanopartículas en aplicaciones biomédicas). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En los Estados Unidos, 27.000 mujeres son diagnosticadas y aproximadamente 14, 000 mujeres mueren cada año a partir OvCa [1]. Tales altas tasas de mortalidad se deben a la mayoría de los pacientes (75%) se presentan con enfermedad avanzada (estadio III o mayor) en el momento del diagnóstico [2]. Más de 90% de los pacientes tienen mejor pronóstico si el cáncer se detecta en sus primeras etapas. El tratamiento del cáncer de ovario epitelial en general, implica la citorreducción quirúrgica seguida de quimioterapia con una combinación de platino y un agente que contiene taxano. Sin embargo, la mayoría de los pacientes se repiten y finalmente sucumben a su cáncer. En consecuencia, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevos agentes terapéuticos que pueden ser más eficaces en el tratamiento de cáncer de ovario y el retraso o la prevención de recurrencias. Las terapias innovadoras que se dirigen a la tumorigénesis de ovario se han investigado ampliamente, pero todavía tenemos que llegar a un fármaco prometedor.
herramientas y técnicas basadas en la nanotecnología están emergiendo rápidamente en el campo de la imagen médica y la administración de fármacos dirigidos. El óxido de cerio es un óxido de tierra rara que se encuentra en la serie de los lantánidos de la tabla periódica. óxido de cerio nanocristalina (nanoceria) presenta un desplazamiento hacia el azul en el espectro de absorción ultravioleta, el desplazamiento y la ampliación de Raman permite modos y la expansión de celosía, en comparación con el óxido de cerio a granel indicando sus propiedades únicas. NCE ha emergido como un material lucrativo en la ciencia biomédica debido a su capacidad única para cambiar estados de oxidación entre (III) y (IV) dependiendo del entorno. La capacidad de cambiar entre estados de oxidación mixtos de nanoceria es comparable a los antioxidantes biológicos. Esto imparte nanoceria con una propiedad biológica muy importante de captación de radicales libres que pueden ser sintonizado en base a la retención de vacantes de oxígeno (defectos) y concentración de especies en CE3 + nanoceria. La reversibilidad de estado de oxidación es la propiedad clave en la fabricación de nanoceria un potente antioxidante, reduciendo de este modo la necesidad de dosis repetida frecuente. Estudios previos han demostrado que las nanopartículas de óxido de cerio poseen excelentes propiedades antioxidantes y actúan como potentes eliminadores de radicales libres, regenerativos en los sistemas biológicos [3], [4], [5]. Estas propiedades antioxidantes regenerativas se deben, en parte, a la estructura de valencia del átomo de cerio combinado con defectos inherentes en la estructura de red cristalina, que se magnifican en la nano escala. Se ha sugerido que la estructura única de nanopartículas de óxido de cerio de ingeniería, con respecto a la valencia y de oxígeno defectos, promueve la longevidad celular y disminuye insultos tóxicos en virtud de sus efectos antioxidantes que se producen cuando las nanopartículas entran en las células [6], que impiden la acumulación de especies de oxígeno reactivas (ROS) en la célula [3].
angiogénesis del tumor se caracteriza por la formación de nuevos vasos sanguíneos irregular de una red vascular preexistente. Se requiere este angiogénesis anormal para el crecimiento, la supervivencia y metástasis de la mayoría de los tumores sólidos [7], [8]. Factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) es uno de los factores pro-angiogénicos más importantes, que actúa como un mitógeno para las células endoteliales vasculares
in vitro
y como un factor angiogénico
in vivo
[9 ]. Se sobreexpresa en diversos cánceres humanos [10], [11], [12], [13] incluyendo OvCa. Recientemente, se ha sugerido que ROS juega un papel importante en la regulación de la angiogénesis inducida por tumor mediante el control de la producción de VEGF. una mayor producción de VEGF se ha demostrado que se correlaciona con un mal resultado para los pacientes con inicial y avanzado OvCa. Varios agentes anti-angiogénicos han sido y son sometidos a evaluaciones en ensayos clínicos de cáncer de ovario. Un estudio de fase II de bevacizumab como agente único (un anticuerpo monoclonal dirigido contra VEGF) mostró resultados prometedores [14]. Por lo tanto, la señalización de VEGF está convirtiendo en el foco de la terapia antiangiogénica enfocadas, a OvCa
.
En el presente estudio, hemos probado las nanopartículas de óxido de cerio como agente terapéutico tanto
en
Opiniones y vitro
in vivo en las células
Ovča. Nuestros datos demuestran que NCE fue capaz de inhibir el factor de crecimiento mediada, la migración y la invasión de las células SKOV3, la proliferación inducida por VEGF
165, la formación del tubo capilar y la activación de VEGFR2 y MMP2 en células HUVEC. Más importante aún NCE tratamiento inhibe el crecimiento tumoral
in vivo fotos: por inhibición de la angiogénesis, específicamente por atacar a las células endoteliales vasculares.
Materiales y Métodos
Reactivos y anticuerpos
azul de tripano, MTT 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromuro) y HB-EGF eran de Sigma. SDF1, VEGF
165 y HGF fueron adquiridos de I + amp; D Systems (MN, USA). anticuerpos Ki-67 y VEGF eran de Dako (Glostrup, Dinamarca) y Abcam (MA, EE.UU.), respectivamente. CD31 (PECAM) era de Santa Cruz Biotechnology (CA, EE.UU.).
Cell Cultura y
línea celular de cáncer de ovario humano SKOV3 y HUVEC eran de la American Type Culture Collection. líneas celulares A2780 y C200 fueron una especie de regalo del Dr. Tom Hamilton (Fox Chase Cancer Center de). líneas celulares Ovča se mantuvieron y se cultivaron en medio RPMI completo que contiene 10% de FBS, antibióticos. Las células HUVEC se mantuvieron en EBM-2 medios comprados en Lonza (Dinamarca).
Síntesis de nanopartículas
nanopartículas de óxido de cerio se prepararon por síntesis química húmeda como se describe anteriormente [15], [16], [17]. En pocas palabras, hexahidrato de nitrato de cerio se disolvió en agua desionizada y luego se filtró utilizando un filtro de 200 nm para deshacerse de cualquier partícula libremente de suspensión. A continuación, los iones de cerio solución que contiene se oxidó utilizando peróxido de hidrógeno e hidróxido de amonio. El pH de la solución se ajustó entre 3,5 a 4,0 mediante el uso de ácido nítrico o hidróxido de amonio. Todo el material de vidrio se trataron en autoclave antes de ser utilizados para la síntesis. El pH y el potencial zeta de la suspensión se estrechamente monitorizados como la solución se dejó edad a temperatura ambiente durante próximos varios días hasta la formación de nanopartículas con predominantemente Ce
3+ se observó concentración usando espectrofotometría UV-Visible.
las nanopartículas Caracterización
el cambio en los estados de oxidación de las nanopartículas como preparados en solución se controló usando espectrofotometría UV-Visible. Se tomaron alícuotas de la muestra original para las mediciones de absorbancia mediante el uso de Perkin Elmer 750 S espectrofotómetro. La distribución de la morfología y tamaño de partícula se estudió usando microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM). El tamaño de las nanopartículas en solución como se ha preparado antes de su uso en
in vitro
y
in vivo
estudios también se controlará mediante dispersión dinámica de luz (DLS). Los estados de oxidación de cerio enel partículas se confirmaron mediante espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS). Para alta resolución Microscopía Electrónica de Transmisión (HRTEM) una gota de la suspensión de nanopartículas se coló en la rejilla de cobre revestida de carbono. Las imágenes HRTEM de las partículas como preparados se obtuvieron con un Philips (Serie Tecnai) funcionar a 300 keV. Los datos se obtuvieron usando un espectrómetro XPS PHI 5400 ESCA (XPS). Las muestras fueron colados en una oblea de silicio y se seca dentro de una caja de guantes de nitrógeno para evitar la oxidación del cerio de oxígeno atmosférico y transferido utilizando una cámara de transferencia de muestra, sin exponer las muestras a la atmósfera de la gota. Sólo se obtuvieron exploraciones limitadas para evitar daños de rayos x de cerio. Una exploración inicial se guarda por separado para comparar con los resultados combinados de exploración y 5 no mostró diferencias en el Ce
+ 3 /Ce
4+ relación. La presión base durante el análisis XPS fue de 10
-9 Torr y Mg-K
radiación α
de rayos X (1253,6 eV) a una potencia de 200 W se utiliza como fuente de rayos x. La energía de enlace de Au (4f
7/2) a 84,0 ± 0,1 eV se utiliza para calibrar la escala de energía de enlace del espectrómetro. Cualquier cambio de carga producida en el espectro se corrigió por referencia a la posición C (1 s) en (284,6 eV) [13]. XPS alisamiento espectros de línea de base y la resta se llevó a cabo utilizando PeakFit (versión 4) de software.
migración y la invasión ensayos
SKOV3 se cultivaron en medio libre de suero durante la noche. La migración celular y la invasión se midieron como se describe [18] con modificaciones. Brevemente, suspensiones de células (500 l, 2,5 × 10
4 células) se sembraron en la parte superior de (ensayo de migración) sin revestir y las placas Transwell Matrigel recubierto (ensayo de invasión) (8-m de diámetro de poro; BD Biosciences). Las suspensiones celulares (500 l) libre de suero se añadieron a la cámara superior de la transwell. Las cámaras inferiores contenían medio libre de suero que contienen diversos factores de crecimiento, incluyendo SDF1, HB-EGF, VEGF
165 y HGF a la concentración de 25 ng /ml. Las células que invaden la cámara inferior se tiñeron con violeta de cristal 0,5% (60% de PBS, 40% EtOH) y se contaron con un microscopio invertido. Se presentan los resultados de al menos dos experimentos independientes por triplicado
Ensayos de proliferación
ensayo
(i) MTT:.
2,5-5,0 × 10
4 células fueron chapada en placas de 24 pocillos por triplicado y se trata con concentraciones indicadas de NCE para 72 h. ensayo de MTT se realizó como se describe antes [19], para determinar el número de células vivas.
(ii) incorporación de timidina:
proliferación de las células también se determinó por [
3H] -timidina en el ADN como se ha descrito antes [20]. En resumen, 2.5-5.0 × 10
4 células se sembraron en placas de 24 pocillos por triplicado y se trataron con concentraciones indicadas de NCE durante 72 h. Cada grupo fue tratado con 1 Ci de [
3H] timidina en el mismo medio durante 6 h. Las células adherentes se fijaron con ácido tricloroacético al 5% y se lisaron en tampón de lisis SDS /NaOH. Se midió la radiactividad por Beckman LS3801 contador de centelleo líquido (Canadá).
Formación de Colonias Ensayo
2000 células se sembraron por triplicado en placas de 6 pocillos y se trataron con las concentraciones indicadas de NCE. Se dejó que las células para formar colonias de hasta 2-4 semanas (dependiendo de la línea celular) y los medios de comunicación se reemplazó cada cuarto día. Las colonias fueron teñidas con MTT y se contaron como se ha descrito antes [19].
Medición de ROS
ROS se determinó utilizando la membrana permeable al colorante fluorescente 6-carboxi 2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein (DCFDA) en medio libre de suero como se describe anteriormente [21], [22]. Las células cultivadas, con o sin tratamiento con NCE, se trataron con 5 mM DCF colorante en PBS y el cambio en la fluorescencia se registró a una excitación 485 nm y emisión 530 nm para diversos período de tiempo de 10 a 60 min usando un Pro espectrofluorómetro Soft Max ( molecular Devices, Sunnyvale, CA).
análisis de inmunotransferencia
Después de un tiempo estipulado de incubación en presencia o ausencia de cantidades indicadas de NCE, análisis de inmunotransferencia con anticuerpos específicos se llevó a cabo como se describe anteriormente [19 ], [20], [21], [22]. En resumen, tratados y no tratados células HUVEC con VEGF
165 (25 ng /ml) y /o en varios NCE período de tiempo (5-30 min) se lisaron en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 250 mM, EDTA 5 mM, NaF 50, y 0,5% Nonidet que contiene un cóctel inhibidor de la proteasa P-40] (Sigma). 40 g de proteínas se resolvieron por SDS-PAGE y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. a continuación se bloqueó la membrana durante 1 h en 5% TTBS leche descremada en polvo (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, y 0,1% de Tween 20, pH 7,5) y se incubaron durante la noche en antisueros primaria (pVEGFR (Y1175), pVEGFR (Y951), VEGFR2 o actina β) que contiene leche en polvo desnatada al 5% o 5% de BSA en caso de fosfo-anticuerpos. Después de la incubación con HRP-conjugado Ab secundario, blots fueron desarrollados con un sistema de detección ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
en vitro vascular formación de tubos de ensayo
in vitro
ensayos de formación de tubos se realizaron según lo descrito por Melinda
et. al.
[23]. En resumen, matriz de matrigel se sembró uniformemente en portaobjetos de 8 pocillos de cámara (0,15 ml) y se incubaron a 37ºC durante 30 min. 2 × 10
5 células HUVEC /ml fueron tratados con NCE (25-50 M) y se mezcla con las células en presencia o ausencia de VEGF
165 (25 ng /ml) y se transfirió a cada pocillo (200 l ) recubiertas con matrigel. Las placas o láminas fueron incubadas a 37 ° C durante 16 h y la imagen bajo un microscopio invertido de contraste de fases a un aumento de 10X objetivo.
Zymography Ensayo
En la actividad de MMP-2, las células HUVEC fueron tratados con VEGF
165 (25 ng /ml) en presencia o ausencia de NCE (25-50 M). Pon 18 h, se recogió el sobrenadante de células, se centrifugaron a 12.000 g y 25 l de volumen se mezclaron con 5 x tampón de carga de SDS sin agente reductor y corrió en 10% de gel que contiene gelatina tris-glicina. Gel se lavó dos veces durante 1 h con una solución de renaturating (2,5% TritonX100 en 50 mM Tris pH 7,4, CaCl 5 mM, ZnCl2 1 mM) para eliminar el SDS y renaturalizar MMPs. Después de enjuagar con agua desionizada gel, gel se incubó durante la noche a 37 ° C con tampón que contenía 50 mM Tris pH 7,4, CaCl 5 mM, 1 mM ZnCl
2. Al día siguiente, el gel se tiñó con 0,5% de Coomassie G250 seguido de tinción para ver la actividad de MMP-2 en gel.
Animales
Declaración de Ética.
6-8 semanas de edad ratones desnudos femeninos fueron adquiridos de cáncer Institute-Frederick de Investigación del cáncer y el Centro Nacional de Desarrollo (Frederick, MD). Todos los ratones fueron alojados y mantenidos bajo condiciones específicas en las instalaciones de la Clínica Mayo de Rochester, Minnesota. Las instalaciones están aprobados e inspeccionados por la Asociación Americana para la Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC Acreditación#000717) y de acuerdo con las regulaciones y normas del Departamento de Agricultura de EE.UU., Departamento de Salud y Servicios Humanos, y los NIH EE.UU. actuales. Todos los estudios fueron aprobados y supervisados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Clínica Mayo (IACUC) bajo el número de protocolo A11309. Después de la inducción del tumor, los ratones fueron monitoreados diariamente para detectar signos de cualquier peligro. controles periódicos de salud también se llevan a cabo por el personal veterinario Mayo. Los ratones fueron sacrificados humanamente cuando la carga tumoral alcanza el peso mandato en los ratones no tratados.
Los ratones fueron mantenidos de acuerdo con el protocolo aprobado por el IACUC institucional. 2 × 10
se inyectaron células 6/200 l suspendidas en PBS en la cavidad intra-peritoneal (día 0) de 6-7 semanas de edad ratones desnudos tal como se describe antes [24]. Los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en dos grupos. tratamiento NCE a la dosis de 0,1 mg /kg de peso comenzó 3 días después de la inoculación de las células y se le dio intraperitonealmente en cada día rd 3
hasta el final del estudio. El grupo control recibió inyecciones de PBS. Los ratones se sacrificaron a las 4 semanas y los tumores se fijaron en formalina para el corte. La sangre se recogió en tubos recubiertos de heparina para obtener plasma. Hígado, riñón, corazón y el bazo de todos los animales fueron fijados con formalina y se procesan. Una diapositiva de tumor y los órganos de cada ratón se tiñó con H & amp;. E
Ensayos de citotoxicidad
La sangre se recogió en tubos recubiertos de heparina justo antes de los ratones fueron sacrificados.. Plasma aislado de la sangre de seis ratones de cada grupo se sometió a análisis de un panel de pruebas de función hepática (aspartato aminotransferasa; alanina aminotransferasa; albúmina) y pruebas de función renal (creatinina; urea; albúmina) como se describe antes [24]. Todos los ensayos se realizaron usando equipos de ensayo biológico, Sistemas siguiendo las instrucciones del fabricante (CA, EE.UU.).
Determinación de NCE en los tejidos.
Al final del estudio, incluyendo varios tejidos del tumor, el hígado , bazo y riñón de grupo tratado NCE se colocaron en ácido nítrico al 70% durante la noche para iniciar el proceso de digestión. Las muestras fueron luego microondas digerido. La temperatura se elevó a 200 ° C durante 20 min y se mantuvo durante otros 20 min. Las muestras fueron luego reducirse a menos de 1 ml cada una y se reconstituyó en agua a un volumen exacto de 10 ml. los niveles de cerio se evaluaron utilizando espectroscopia de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) como se ha descrito antes [25].
Para microscopía electrónica de transmisión (TEM), tumor de ovario aislados de los ratones tratados NCE se fijaron en fijador de Trump (1 % de glutaraldehído y formaldehído al 4% en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,2). Tumor se ha incrustado en resina de Spurr y (90 nm) secciones delgadas fueron cortadas en un ultramicrotomo Reichert Ultracut E, colocado en rejillas de cobre de malla 200 y se tiñeron con citrato de plomo. Micrografías fueron tomadas en un Tecnai 12 que opera a AA 120 KV.
IHC.
tumores extirpados de los ratones fijos se procesaron para inmunohistoquímica para CD31, Ki-67 y TUNEL (Millipore) tal como se describe anteriormente [24 ]. H & amp; E tinción se realizó por las instalaciones del Núcleo inmunohistoquímica Mayo. Ki-67 y H & amp; E secciones fueron examinadas bajo microscopio de luz y pictogramas representativos fueron tomados de 5 diapositivas diferentes de cada grupo. Para la tinción de CD31, se usó anticuerpo secundario marcado con TRITC y se visualizó usando microscopio de fluorescencia. Para la doble tinción, los portaobjetos se procesan en primer lugar para la tinción de CD31 seguido por tinción de inmunofluorescencia TUNEL, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
mediciones tumorales vivas.
El diámetro máximo del tumor viable se calcula sumando RPG el diámetro más grande uni-dimensional de cada fragmento de tumor utilizando la Olympus BX-41 microscopio y un micrómetro. Del mismo modo, se midieron las áreas necróticas y el tamaño del tumor en vivo compuesta se calculó a partir de cada diapositiva.
formación de tubo endotelial.
Para examinar el efecto de NCE en la formación de tubos en las células HUVEC, Matrigel matriz era uniformemente en placas sobre portaobjetos de cámara de 8 pocillos (0,15 ml) y se incubaron a 37 ° C durante 30 min. Las células HUVEC se contaron y se diluyeron a 2 × 10
5 /ml en medio. Las células se trataron con NCE (25-50 M) se mezcló con células en presencia o ausencia de VEGF
165 (25 ng /ml) y se transfirió a cada pocillo (200 l), recubierta con matrigel. Las placas o láminas fueron incubadas a 37 ° C durante 16 h y la imagen bajo un microscopio invertido de contraste de fases a las 10 × aumento del objetivo.
Análisis estadístico.
Los datos fueron analizados estadísticamente utilizando dos la prueba t de Student de cola (Prisma). *** P & lt; 0,001; ** P & lt; 0,01, * P & lt; 0,05; NS:. No es significativo en comparación con los no tratados
Resultados
Síntesis y caracterización de nanopartículas de óxido de cerio
nanopartículas de óxido de cerio utilizados en este estudio contiene cristalitos individuales de 3-5 nm de que se aglomeran sin apretar a 15-25 nm. A medida que el proceso de síntesis está libre de cualquier tensioactivo orgánico, la aglomeración de las nanopartículas duro se controla controlando estrechamente el pH de las nanopartículas por debajo de 3,5 durante la síntesis para mantenerlos en gama coloidal. Las nanopartículas pueden ser diluidas en medios acuosos o celulares después de la síntesis. Figura 1 A y B muestra las micrografías de alta resolución electrónica de transmisión (HRTEM) de nanopartículas NCE. Es evidente a partir de la imagen que las nanopartículas se aglomeran libremente a aproximadamente 15 a 25 nm agregados que también podría ser inducido por el proceso de secado. El radio hidrodinámico (37,8 ± 0,8 nm) de la distribución multimodal del tamaño (volumen%) el análisis de medidas de DLS está de acuerdo con el tamaño de aglomerado suelto del análisis HRTEM. Imagen de alta magnificación confirma los planos de la red de NCE en individuales cristalitos 3-5 nm. espectroscopia UV-Visible se utilizó para analizar los estados de oxidación de las nanopartículas de óxido de cerio antes y después de tratamiento de envejecimiento. La Figura 1 muestra los espectros UV-Visible a partir de nanopartículas de óxido de cerio frescas y envejecidas indicando claramente el predominio de Ce
3 estado de oxidación desde el pico de absorción a 252 nm en comparación con pico de absorción a 298 nm para Ce
4+ . La confirmación adicional en los estados de oxidación de las nanopartículas se obtuvo a partir del análisis XPS. El espectro de XPS de cerio es muy compleja que contiene varios picos de la órbita de acoplamiento espín de orbitales 3d [26]. Varios picos en la región Ce3d que se han atribuido a 3d
3/2 (899,5, 900,9, 903,5, 906,4 y 916,6) y 3d
5/2 (880,2, 882,1, 8885, 888,1 y 898) que surjan de múltiples estados de valencia de cerio. El espectro de NCE muestra un predominio de cerio en estado de oxidación +3 tal como se representa por los picos característicos a 880,2, 885,0, 899,5 y 903,5 eV. Tomados en conjunto los datos de caracterización de NCE es coherente con los informes anteriores, en el que el cerio puede ser retenido en la oxidación trivalente al disminuir el tamaño de las nanopartículas [15], [16], [17], [26].
de alta resolución micrografías electrónicas de transmisión muestran la presencia de un aglomerados sueltos de 15-20 nm a pocos aumentos individuales B 3-5 cristalitos nm. El espaciamiento de d 0,31 nm muestra la presencia de planos de ceria mientras que el patrón de difracción de electrones área seleccionada (SAED) confirma la presencia de celosía fluorita de óxido de cerio. La tendencia en el estado de oxidación de nanoceria en C muestra que las nanopartículas sintetizadas tienen predominio del estado de oxidación trivalente que sufre una transformación lenta de Ce
3 estado de oxidación durante un período de 28 días de espectro de fotoelectrones de rayos x D a partir de un óxido de cerio referencia muestra en la que el cerio está predominantemente en estado de oxidación 4 se compara con el espectro de un 4 semanas muestra de nanoceria demostrando la alta concentración de Ce en estados de oxidación +3 años. E. niveles basales de ROS en la línea celular de cáncer de ovario. células A2780 fueron tratados con NCE (50-100 M) durante 48 h. Las células se lavaron con PBS y se cargan con DCF-DA colorante (5 M) y la fluorescencia se registró a una excitación de 485 nm y de emisión de 530 nm para diversos períodos de tiempo (5-60 min). Los pocillos que contenían sólo células sin colorante DCFDA (cruz) o sin células que contienen DCFDA colorante (rombo relleno) se utilizaron como blanco. F. gráfico de barras representa los niveles de ROS en los 60 minutos de tratamiento con el tinte DCF-DA. Los resultados se muestran como la media ± S.D. de 4 muestras. *** P & lt; 0,001 NCE en 100 uM; * P & lt;. NCE 0,05 en comparación con las células no tratadas utilizando dos colas la prueba t de Student (Prisma) guía empresas
Tratamiento NCE inhibe la producción de niveles de ROS en la línea celular A2780
nanopartículas de óxido de cerio se ha demostrado que actuar como captadores de radicales libres mediante la inhibición de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) [3], [4], [5]. Dado que, está bien establecido que la acumulación de ROS juega un papel importante en la iniciación y progresión de la tumorigénesis en el cáncer de ovario humano [27], [28], [29], se examinó el efecto de NCE en la generación de ROS en la línea celular de cáncer de ovario A2780. línea celular A2780 fue tratado con NCE (50-100 M) y post 48 h de tratamiento, la generación de ROS se midió usando el tinte DCFH2-DA seguido por la lectura de fluorescencia. Como se muestra en la figura 1E-F, el tratamiento NCE inhibió significativamente los niveles de ROS en la línea celular A2780, lo que sugiere que el tratamiento NCE inhibe los niveles basales de estrés oxidativo en la línea celular A2780 OvCa.
NCE no afectó la proliferación de células del cáncer de ovario Líneas celulares
Para determinar si el tratamiento NCE inhibe la proliferación celular, A2780, C200 y SKOV3 se sembraron en placas de 96 pocillos a 4 x 10
3 células /pocillo y se trataron con diversas concentraciones de NCE (25-200 M). La viabilidad celular se determinó a las 72 horas por el ensayo de MTT. Como se muestra en la figura 2A, el tratamiento NCE no tuvo efecto significativo sobre la proliferación o la supervivencia de las líneas celulares de cáncer de ovario. En consonancia con esta observación, nuestros ensayos clonogénicos también mostraron ningún cambio en la tasa de proliferación al aumentar la concentración NCE (Fig. 2B). [3H] timidina en A2780, C200 y células SKOV3 (Fig. S1), también confirmó que el tratamiento NCE no alteró la tasa de proliferación. Se obtuvieron resultados similares en líneas celulares de cáncer de ovario adicionales incluyendo CaOV3 y TOV21G (datos no mostrados). En conjunto, estos resultados indican que el tratamiento NCE no inhibió significativamente el crecimiento de células de cáncer de ovario líneas
in vitro
.
A en. Porcentaje de viabilidad de A2780, las células C200 y SKOV3 tratado con dosis indicadas de NCE (25 a 200 mM) como se determina mediante el ensayo de MTT. Los datos se representa tres experimentos individuales realizaron por triplicado. NS: no significativo, en comparación con las células no tratadas en el respectivo punto de tiempo utilizando la prueba t de Student de dos colas (Prisma). B. Para la formación de colonias, 2000 células /pocillo (A2780, C200 y SKOV3) se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron con las concentraciones indicadas de NCE, cada tercer día durante 2 semanas hasta que se formaron colonias. Las colonias fueron teñidas con MTT y se contaron. Los datos representan tres experimentos separados realizados por triplicado. NS:. No significativa en comparación con las células no tratadas utilizando la prueba t de Student de dos colas (Prisma) guía empresas
La migración celular mediada por el factor de NCE inhibió el crecimiento y la invasión
in vitro
Desde, el tratamiento NCE no afectó a la proliferación celular, se evaluó el efecto de NCE en el factor de la migración celular mediada por el crecimiento y la invasión. SKOV3 crecido durante la noche en suero bajo (0,2%) que contiene medio estaban rayados usando una punta de pipeta de 200 l estéril, una vez que alcanzaron el 90% de confluencia. Se añadieron varios factores de crecimiento incluyendo SDF1, HB-EGF, VEGF
165 y HGF (25 ng /ml) de forma individual para el medio en presencia o ausencia de NCE (100 M). 24 horas más tarde, se calculó la tasa de cierre de la herida. Como se muestra en la figura 3A, NCE inhibió todo el factor de crecimiento migración celular mediada en la línea celular SKOV3. Se obtuvieron resultados similares para las líneas de células A2780 y C200 (datos no mostrados). A continuación se evaluó el efecto de NCE en la inhibición de la invasión GF mediada por células SKOV3 utilizando el ensayo de migración Boyden cámara (BD Bioscience) como se ha descrito anteriormente [18]. La Figura 3B demuestra claramente que el tratamiento 100 M NCE inhibió significativamente todo invasión inducida por factor de crecimiento de las células SKOV3 en comparación con las células no tratadas. Estos resultados indican que, NCE tiene la capacidad de inhibir la migración y la invasión de células de cáncer de ovario sin afectar a la proliferación celular.
A. Efecto de NCE en varios factores de crecimiento mediada por la migración de células se examinó usando un ensayo de cierre de la herida como se describe en Material y Métodos. Los resultados se muestran como la media ± S.D. de n = 7. B. Para examinar el efecto de NCE en invasión, 1 × 10
5 SKOV3 Las células se sembraron en los pocillos superiores con 100 mM NCE en la cámara de FIA en 500 l de medio de cultivo. Varios factores de crecimiento (EGF, VEGF
165 y SDF1) (25 ng /ml) se añadió a los medios de comunicación subyacentes. 24 horas más tarde, la invasión se determinó siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se muestran como la media ± S.D. de triplicados. *** P & lt; 0,001 factor de crecimiento tratado en comparación con el control. $$$ P & lt; 0,001 NCE tratado en comparación con el uso del factor de crecimiento de dos colas la prueba t de Student (Prisma) guía empresas
NCE Tratamiento atenuada crecimiento tumoral en el carcinoma de ovario humano A2780 Línea Celular Teniendo desnuda modelo de ratón
Para determinar el efecto de NCE
in vivo
, ratones desnudos fueron intraperitoneal inyectados con células A2780. Los ratones se trataron con NCE (0,1 mg /kg de peso corporal) administrada por vía intraperitoneal, cada tercer día hasta el final del estudio (día 30) como se describe en material y métodos. Figura 4A (panel superior) muestra una fotografía representativa de un ratón NCE tratadas y no tratadas que lleva xenoinjerto de A2780 al final del estudio (día 30). La circunferencia abdominal, indicativa de la carga tumoral en el peritoneo (Fig. 4B) y el peso del tumor (Fig. 4C) en los ratones tratados NCE fueron significativamente (p & lt; 0,002) reducida en comparación con ratones no tratados. El peso medio de los tumores extirpados fue de aproximadamente 33% menos en NCE (4,56 + 0,345 gm) ratones tratados en comparación con vehículo (PBS) ratones (6,79 + 0,53 gm) (Fig. 4C). Estos datos indican claramente que NCE tiene la posibilidad de restringir el crecimiento del tumor de ovario
in vivo cuando se administra
incluso a una dosis muy baja (0,1 mg /kg).
A. morfología bruto de ratón representativo con tumores en el día 30 (n = 6). B. circunferencia abdominal acumulada al final del estudio. C. extirparon el peso del tumor de vehículo (PBS) tratado y NCE (0,1 mg /kg en peso bd; cada tercer día). Los resultados se muestran como la media ± S.D. de seis animales individuales. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig.