Extracto
Nanog1 humana es un ácido (AA) que contiene homeodominio-factor de transcripción 305-amino crítico para la pluripotencia de las células madre embrionarias (ES) y células de carcinoma embrionario (CE). las células cancerosas somáticos predominantemente expresan un homólogo de retrogene Nanog1 llama NanogP8, que es ~99% similar a Nanog en el nivel AA. Aunque el M.W predicho de Nanog1 /NanogP8 es ~ 35 kD, ambos han sido reportados a migrar, el Western Blot (WB), en masas moleculares aparentes de 29-80 kD. Si todas estas bandas de proteína reportados representan proteínas Nanog auténticos no está claro. Por otra parte, los estudios bioquímicos detallados sobre Nanog1 /NanogpP8 han faltado. Mediante la combinación de WB utilizando anticuerpos anti-8 Nanog1, inmunoprecipitación, espectrometría de masas, y los estudios que utilizan proteínas recombinantes, aquí
Proporcionamos
evidencia directa de que la proteína Nanog1 en NTERA-2 células EC existe como múltiples especies de PM de $ ~ $ 22 KD de 100 kD con una banda principal de 42 kD detectable sobre WB. A continuación, demuestran que las proteínas recombinantes NanogP8 (rNanogP8) realizados en bacterias utilizando ADNc de múltiples células cancerosas también migrar, en la desnaturalización SDS-PAGE, en ~28 kD a 180 kD. Curiosamente, diferentes anticuerpos anti-Nanog1 exhiben reactividad diferencial hacia las proteínas rNanogP8, que pueden formar espontáneamente especies de proteínas de alta M.W. Finalmente, se muestra que la mayoría de las líneas celulares de cáncer cultivadas a largo plazo parecen expresar niveles muy bajos de proteína o diferente NanogP8 endógena que no puede ser fácilmente detectado por inmunoprecipitación. En total, el estudio actual revela propiedades bioquímicas únicas de Nanog1 en células EC y NanogP8 en las células cancerosas somáticas
Visto:. Liu B, Badeaux MD, Choy G, Chandra D, Shen I, Jeter CR, et al. (2014) Nanog1 en NTERA-2 recombinante y NanogP8 a partir de células somáticas cáncer Adoptar múltiples conformaciones de las proteínas y migrar a múltiples especies M.W. PLoS ONE 9 (3): e90615. doi: 10.1371 /journal.pone.0090615
Editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Enero, 2014; Aceptado 29 de enero de 2014; Publicado: 5 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado, en parte, por subvenciones del NIH (R01-CA155693), Departamento de Defensa (W81XWH-13-1-0352), CPRIT (RP120380), el Centro de MDACC de Epigenética del cáncer y el ARN Centro-Laura & amp; beca de la Fundación John Arnold (D. G. Tang), y por dos Subvenciones Center (CA166672 CCSG 5-P30 y ES007784). C. Jeter, M. persona, y C. Liu fueron apoyados, en parte, por CPRIT RP120394, CPRIT RP110782 y el DOD beca posdoctoral (PC121553), respectivamente. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Dra. Dhyan Chandra es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas y criterios editoriales.
Introducción
Nanog1 (comúnmente llamada Nanog) está codificada por el
nanog
gen localizado en Chr . 12p13.31 (Fig. S1 A). El gen tiene 4 exones y codifica un factor de transcripción de homeodominio que es crucial para la auto-renovación de células madre embrionarias (ES) las células [1], [2]. Nanog1 sobreexpresión en células ES de ratón (mESCs) supera el requisito de factor inhibidor de leucemia para el mantenimiento de la pluripotencia [1], [3], mientras que la interrupción de
NANOG
resultados en la diferenciación mESC a endodermo extraembrionario [4]. Baja regulación de Nanog1 en CME humanas (hESCs) también conduce a la pérdida de pluripotencia y la diferenciación de los linajes de células extraembryonic [5]. Además, en asociación con otros factores de reprogramación, Nanog1 supera las barreras de reprogramación y promueve la reprogramación de células somáticas [6], [7]. Por lo tanto, Nanog1 es un elemento intrínseco principal de la red transcripcional para el sostenimiento de la auto-renovación de los CES.
Nanog1 proteína humana tiene 305 aminoácidos (aa) y 5 subdominios funcionales, es decir, el dominio N-terminal (ND ), homeodominio (HD), el dominio C1-terminal (CD1), el dominio rico en triptófano (WR) y C2-terminal de dominio (CD2) [8] - [11] (figura 1A).. El ND está involucrado en la interferencia de la transcripción y la región C-terminal contiene el activador de la transcripción. Se requiere que el dominio HD para Nanog localización nuclear y la transactivación y la región WR media la dimerización de la proteína Nanog, que se requiere para la actividad de la pluripotencia [12], [13]. De interés, humano
Nanog
tiene 11 pseudogenes [14], entre las que
NanogP8
, situado en Chr. 15q14, tiene un marco de lectura abierto completo [14], [15] (Fig. S1B) que posee un elemento Alu en el 3'-UTR homóloga a la de
Nanog1
de genes, lo que sugiere que
NanogP8
es un retrogene en lugar de un pseudogen. NanogP8 tiene al menos 6 nucleótidos conservada (nt) diferencias en comparación con Nanog1, lo que puede dar lugar a algunos cambios de aa [15].
(A) Representación esquemática de la proteína Nanog humana y 8 anti-Nanog Abs utilizan en este estudiar. Muestran entre paréntesis son epítopos de Abs individuales. ND, el dominio N-terminal; HD, homeodominio; CD1 y CD2, C-terminal de dominio 1 y 2; WR, dominio rico en triptófano. El asterisco en ND indica el residuo Leu61 reconocido por el mAb eBioscience (flecha) asignada desde nuestros estudios actuales. (B-H) WB análisis en NTERA 2-NE (N, dos lotes diferentes) o citosol (C) usando 8 anti-Nanog Abs. Ab individual se indica en la parte inferior y M.W a la izquierda. punta de flecha negro, la proteína de 35 kD Nanog predicho; punta de flecha roja, la principal banda de 42 kDa; . Flechas verdes, bandas adicionales (especialmente después de largas exposiciones) guía empresas
Curiosamente, se ha informado de muchas células cancerosas somáticas expresar ARNm y /o proteína [15] Nanog - [46]. Varias advertencias están asociados con muchos de estos estudios.
Primera
, en el ARNm, la diferencia de estudios rigurosos que emplea RT-PCR combinada con la secuenciación o la sensibilidad diferencial a la enzima de restricción AlwN1 [15], [17], [31], [32], [34] , [46], han demostrado que las células cancerosas somáticas expresan preferencialmente la transcripción de la
NanogP8
gen (figura S1B;. ver más abajo) en lugar de
Nanog1
. De hecho, hemos observado que el
nanog1
locus es silenciada en algunas células cancerosas somáticas [15]. Nuestro análisis de secuenciación revelan que el carcinoma embrionario NTERA-2 células (CE) expresan
Nanog1
pero no
NanogP8
ARNm mientras que todas las células cancerosas somáticas (6 tipos diferentes, incluyendo células derivadas de tumores primarios de próstata) muestran 5 de las 6 diferencias específicas nt a
NanogP8
[15]. Entre los 5 cambios nt conservadas en
NanogP8
, uno (nt759) debería resultar en un cambio a bis (Q253H), aunque algunas células cancerosas muestran otros cambios nt conservadas-no (es decir, los polimorfismos) que también podría dar lugar a cambios de aa (por ejemplo, L61P para HPCa6) [15]. Hacer la distinción entre Nanog1 y NanogP8 es importante porque las dos transcripciones se deriva de loci del genoma separada y tienen diferencias en los niveles de secuencia nt.
Segunda
, muchos estudios anteriores han sido meramente correlativa sin sondeo de la importancia funcional de la expresión NanogP8 en células de cáncer. Uso de cáncer de próstata humano (CaP) como modelo, hemos demostrado [15] que: 1) la proteína NanogP8 se expresa como un gradiente en células de CaP con NanogP8 nuclear fácilmente detectable en sólo una pequeña fracción de células de CaP; 2) las células que expresan la proteína NanogP8 se incrementan en el CaP primaria en comparación con juego tejidos benignos; 3)
NanogP8
proteína y ARNm NanogP8 están enriquecidas en CD44
+ y CD44
+ CD133
+ células de CaP primarias; 4) shRNA mediada desmontables de
NanogP8
inhibe la regeneración del tumor de próstata, de mama, de colon y de células cancerosas; y 5) Los efectos inhibidor de tumores de
NanogP8
desmontables están asociados con la inhibición de la proliferación celular y la expansión clonal de las células tumorales y la alteración de la diferenciación. Nuestros estudios recientes demuestran que la expresión NanogP8 inducible en células de CaP a granel es suficiente para conferir propiedades de células madre del cáncer (CSC) y promover andrógeno-independiente crecimiento de CaP [34] y que NanogP8 se enriquece en indiferenciada (PSA
- /lo) CaP las células y su caída retrasa consecuencia de CaP resistente a la castración [41]. Nuestros estudios [15], [34], [41] apuntan a posibles funciones pro-oncogénicas de NanogP8.
de terceros, las proteínas y Nanog1 NanogP8 previstos son idénticos ~99% [15 ]. En consecuencia, el término 'Nanog' se utiliza a menudo para referirse genéricamente a cualquiera de las proteínas (que es también el caso en el presente documento). Sin embargo, la especificidad de la mayoría de los anticuerpos anti-Nanog disponibles en el mercado (que todo se plantearon contra Nanog1; Tabla 1) para Nanog1 y, en particular, para NanogP8 permanece sin caracterizar. Por lo tanto, no está claro si las bandas de proteína Nanog putativo muestran en la transferencia Western (WB), en la que se muestra con frecuencia solamente una tira recortada, o la tinción de proteínas Nanog se muestra en la inmunohistoquímica (IHC) representa verdaderamente la proteína Nanog.
Finalmente
, curiosamente, a pesar de la masa molecular de la proteína Nanog predicado (por tanto Nanog1 y NanogP8) es ~ 35 kD, numerosos estudios han informado de posibles proteínas que migran Nanog, en SDS-PAGE, en masa molecular aparente de 29 a 80 kD en ES, EC, y las células de cáncer somáticas (Tabla 1) [2], [5], [17], [24] - [26], [46] - [59]. Aún más desconcertante, el mismo anticuerpo a menudo parece detectar bandas de proteínas diferentes "Nanog '(Tabla 1). Si todas estas reportados especie de proteína Nanog putativos son verdaderas proteínas Nanog aún tiene que ser
directamente
ha determinado.
Se realizó el presente estudio para hacer frente a las dos últimas preguntas. En primer lugar, proporcionan pruebas directas de que la proteína Nanog1 en NTERA-2 células EC migra a & lt; 30 a ~ 100 kD. A continuación, muestran que las proteínas recombinantes NanogP8 también pueden migrar a ~28 kD a ~ 180 kD. Estos resultados sugieren que las proteínas Nanog1 /NanogP8 probable adoptar múltiples conformaciones. finalmente Demostramos que las células cancerosas cultivadas somáticas más largo plazo parecen expresar niveles muy bajos de o NanogP8 endógeno bioquímicamente divergente tal que no puede ser inmunoprecipitada fácilmente por los 8 anticuerpos comerciales anti-NanogP8.
Materiales y Métodos
células y Reactivos
Varias líneas celulares de cáncer humano, incluyendo el cáncer de próstata (PC3, Du145, LNCaP), cáncer de mama (MCF-7), carcinoma de colon (Colo320), y melanoma (WM -562) las células, se obtuvieron de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) y se cultivaron en los medios recomendados que contienen 10% de FBS inactivado por calor (suero bovino fetal). células de teratocarcinoma (NTERA-2, clon D; CRL-1973) fueron adquiridos de ATCC y cultivadas en medio mTeSR ™ 1 (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canadá). kit de extracción nuclear era de Thermo Scientific (Rockford, IL). Ocho anti-Nanog anticuerpos primarios (ABS) se obtuvieron de las compañías comerciales (Tabla 1; Fig. 1A). Abs secundaria y control fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology. reactivos ECL fueron comprados de PerkinElmer, Inc. (MA, EE.UU.). La investigación actual no se trata de experimentos con animales o seres humanos (es decir, las personas que viven o información privada identificable). Todos los otros estudios presentados en este informe fueron la iniciada por el investigador y no requieren la aprobación de otros organismos reguladores.
siRNA- y shRNA mediada Nanog desmontables experimentos
Para los experimentos de siRNA desmontables (Fig. 2 ), se utilizó siGENOME SmartPool siRNA contra Nanog1 humana y siCONTROL siRNAs no director obtenidos de Dharmacon (Lafayette, CO). Células cultivadas en placas de 24 h antes en placas de 6 pocillos fueron transfectadas con siRNAs utilizando Lipofectamine 2000. 48 horas más tarde, se recogieron las células para los experimentos de WB.
(A) Nanog experimentos siRNA en NTERA-2 células. NTERA-2 células fueron transfectadas con una piscina de siRNAs Nanog-específicos para 48 h, se recogieron, y se utilizan para aislar el NE para WB con el Kamiya Ab. Los paneles de la izquierda y la derecha representan la películas de exposición a corto y largo (SE y LE, respectivamente) (tenga en cuenta que el panel inferior de la izquierda es la película más corta expuestos para ilustrar la caída significativa de la banda de 42 kDa). Lamina A /C fue el control de carga. UT, no transfectadas; NC siRNA, el control negativo (no siCONTROL focalización) siRNAs; Nanog siRNA, SmartPool siRNA contra Nanog. Rojo, negro, y puntas de flechas azules indican los principales 42 kD, 35 kD menores, y 48 bandas de proteínas kD, respectivamente, que se redujeron a Nanog caída. Las flechas verdes se refieren a bandas adicionales que también mostraron reducción. (B) El BM se realizó con el anticuerpo anti-conejo pAb Nanog CS.
Para los experimentos desmontables shRNA Nanog, incluyendo los lentivirus pLL3.7, Nanog-shRNA y TRC-shRNA fueron producidos en envases 293FT células (Clontech Laboratories, Mountain View, CA) usando los protocolos modificados descritos anteriormente [15], [60]. En resumen, de principios del paso 293FT células, seleccionado geneticina-(6 × 10
6/15 plato cm) fueron transfectadas con el RRE (6 g), REV (4 g) y VSVG (4 g) envasar plásmidos, junto con un vector lentiviral (6 g) usando Lipofectamine 2000 para llevar a cabo la transfección. En 36 a 48 h, se recogieron los medios que contienen virus y medio fresco añadido. Después de un 12 a 24 h adicionales de cultivo, se recogieron los sobrenadantes virales de nuevo, se agruparon, y ultracentrifugar para producir stocks virales concentradas. Los títulos individuales fueron determinadas por el virus de la GFP-etiquetados utilizando células HT1080. La no-GFP etiquetada virus de la TRC-shRNA se preparó de forma paralela y se le asignó el título de control (pLL3.7). Las células diana se cultivaron 24 h antes y se infectaron a una densidad celular de aproximadamente 50% y se recogieron para
in vitro
o
in vivo
experimentos 48-72 h después de la infección.
bacteriana expresión y purificación de proteínas recombinantes Nanog (rNanog) guía
NanogP8
o
Nanog1
de ADNc en el cultural NTERA-2, MCF-7, y LNCaP células o en el CaP humana primaria muestras (HPCa1, HPCa5, y HPCa6) se amplificó por RT-PCR usando cebadores LDF1 /LDR1 (LDF1 5'-TCTTCCTCTATACTAACATGAGT-3 '; LDR1 5'-AGGATTCAGCCAGTGTCCA-3') y se clonaron en pCR2.1 [15]. Los fragmentos EcoRI /NotI o BamHI /SalI que contiene la secuencia de codificación de Nanog fueron luego subclonados en los mismos sitios, ya sea en pET-28a (+) o pET-28b (+) vector de expresión bacteriano para generar proteínas de fusión con cola de histidina. Después de la verificación inserto mediante análisis de digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN, los plásmidos se utilizaron para transformar BL21 (DE)
3 bacterias competentes para expresar las proteínas de fusión. proteína Nanog se indujo mediante IPTG 0,5 mM durante 3-6 horas a 37 ° C y sedimento bacteriano se mantuvo a -80 ° C. Para la purificación, los gránulos bacterianos que contienen His-proteína Nanog se lisaron en tampón de lisis (NaH 50 mM
2P0
4, pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, cóctel inhibidor de la proteasa, y 1 mg /ml de lisozima ), se sonicó durante 10 segundos (un impulso). Su-etiquetados Nanog en el sobrenadante se purificó mediante perlas de níquel según las instrucciones del fabricante (Qiagen).
WB utilizando proteínas recombinantes (rNanog), toda lisado celular (CMT), o extracto nuclear (NE)
proteínas rNanog y purificado como se ha descrito anteriormente. CMT y NE (a partir de células cultivadas) se prepararon como se describe anteriormente [15]. 50-80 g proteínas (rNanog y NTERA-2 NE) se analizaron por 12,5% de SDS-PAGE y los geles se transfirieron a una membrana de transferencia Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA). La membrana se bloqueó con 5% de leche seca no grasa en TBST (10 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM y 0,1% de Tween-20) durante 1 h a temperatura ambiente, y se incubó durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario. Las membranas se lavaron tres veces con tampón TBST, después se incubaron durante 1 h con 1:2000 anticuerpo secundario, y se revelaron con reactivo de detección ECL Plus WB (PerkinElmer).
inmunoprecipitación (IP)
recombinante proteínas (500 g) o NE (800 mg o en función de fines experimentales) se incubaron con los anticuerpos anti-Nanog indicados durante la noche a 4 ° C. A continuación, la solución se incubó con proteína A /G-agarosa (Sigma, MO, EE.UU.) durante 1 hora a 4 ° C. Después de la incubación, las perlas se lavaron tres veces con tampón RIPA. Proteínas unidas a la proteína A-agarosa se eluyeron con tampón de carga SDS-PAGE y se hierve durante 8 minutos y se sometieron a SDS-PAGE.
Diálisis replegado experimentos
Para aislar y purificar una gran cantidad de rNanog, sedimentos bacterianos se sometió a ultrasonidos 6 veces con 10 segundos pulsos. La solución de tratamiento con ultrasonidos se centrifugó a 10.000 rpm durante 15 min a 4 ° C. Los gránulos se lavaron con PBS frío tres veces. El material precipitado era el cuerpo de inclusión de proteínas rNanog. Para disolver el cuerpo de inclusión, se utilizó un tampón que contenía urea 7 M y después la solución se sometió a diálisis frente a las memorias intermedias de 1,5 M, 0,6 M, 0,3 M y 0,1 M de urea (en 1,5 M NaCl, mM Tris HCl 10, pH 7,0). La solución de diálisis se sometió a SDS-PAGE para determinar la existencia de la proteína Nanog soluble.
identificación de proteínas Nanog (ID) por espectrometría de masas (MS)
análisis
Tres conjuntos de proteínas basado en MS experimentos de identificación se llevaron a cabo en cualquiera de las proteínas rNanog o NE preparan a partir de NTERA-2 células. En el
primer experimento ID
, immunoprecipitated una gran cantidad de NTERA 2-NE celular (~ 2 mg en total) con el amplificador de I +; D pAb de cabra. Después de lavar (3x) con tampón RIPA, las proteínas unidas a la proteína G-agarosa se eluyeron con tampón de SDS-PAGE de carga y se hirvieron durante 8 min y se sometieron a SDS-PAGE. A continuación, el gel se tiñó con solución SYPRO Ruby. cortes de gel /áreas que contienen bandas de interés se cortaron, las proteínas se eluyeron, y se sometieron a digestión con tripsina. Los digeridos trípticos se analizaron por LC-MS /MS utilizando el Dionex último 3000 RSLCnano LC acoplado a la Thermo Orbitrap Elite. Antes de la separación por HPLC, los péptidos se desalaron utilizando Millipore U-C18 ZipTip Puntas de pipeta siguiendo el protocolo del fabricante. A 2 cm de largo x 100 micras de diámetro interno C18 5 micras columna trampa (Proxeon FÁCILES Columna) fue seguido por un I.D. 75 micras columna analítica × 15 cm de largo llena de C18 material de 3 micras (Dionex Acclaim PepMap 100). Tampón A estaba compuesta de ácido fórmico al 0,1% en agua y el tampón B ácido fórmico 0,1% en acetonitrilo. Los datos fueron adquiridos por 35 min usando un gradiente de HPLC de 5% B a 45% de B durante 30 min con un caudal de 300 nl /min. La resolución FT-MS se establece en 120.000, y las 20 MS /MS se adquieren en el modo de trampa de iones CID. Los datos en bruto se procesó utilizando SEQUEST incrustado en Proteoma descubridor v1.3 usando los siguientes parámetros: tripsina completa a digerir con la máxima perdida divisiones, fijo modificación carbamidomethylation de la cisteína, la oxidación variable modificación de la metionina y deaminidation de la asparagina y la glutamina, la búsqueda de la proteoma humano referencia 2 de Uniprot de marzo de 2012 (80990 entradas). La exactitud de la masa de los precursores fue establecido en 10 ppm en masa monoisotopic, por los fragmentos de iones fue de 0,8 monoisotopic masa Da. Una base de datos señuelo se genera a partir de la base de datos humana Uniprot y utilizado por el péptido Validador y Andamios para el cálculo de los valores falsos positivos. X! Tandem búsquedas en las bases (El GPM, thegpm.org, versión CICLON (2010.12.01.1)) se realizaron incrustado en Andamios 3 + Q (Proteoma Software) utilizando los mismos parámetros de búsqueda como SEQUEST. Andamios se utilizó para la validación de péptidos y proteínas identificaciones con filtrado de confianza de 95% de confianza para los dos péptidos, y un punto de corte confianza proteína 99,9%. los valores de péptidos y proteínas de falsos positivos se calcularon como 0,02% y 0,1%, respectivamente, por Andamios.
En el
segundo conjunto de experimentos utilizando el NE de células NTERA-2, se realizó el tándem IP utilizando el pAb Kamiya seguido por el amplificador de I +; D pAb y los inmunoprecipitados se separaron en una espectrometría de masas de trampa de iones-lineal (LTQ, Oorbitrap Velos) como se describe [61]. Simplemente, los fragmentos escindidos se destiñeron con solución decolorante (40% de metanol, 50 mm NaHCO
3 en agua) y se sometieron a en-gel digestión usando 100 ng de tripsina en mM NH 50
4HCO
3, pH 8,5, durante 12 h. Los péptidos se extrajeron con acetonitrilo y se secaron en un secador de Speed-Vac (Thermo Savant). Cada muestra seca se disolvió en 20 l de solución de 5% de metanol /95% de agua /0,01% de ácido fórmico y se inyectó en el sistema HPLC Surveyor (Thermo Finnigan) utilizando un automuestreador. Una columna C18 100 mm × 75 mm (5 m, 300 Å de diámetro de poro, PicoFrit; New Objetivo) se utilizó con fases móviles de A (ácido fórmico al 0,1% en agua) y B (ácido fórmico al 0,1% en metanol), con una gradiente de 5-95% de la fase B durante 45 min seguido de 95% de fase B durante 5 min a 200 nl /min. Los péptidos se electrospray directamente en el (LTQ Oorbitrap Velos (Thermo Scientific) utilizando una fuente de nanopulverización. El LTQ fue operado en el modo dependiente de los datos para adquirir espectros de fragmentación de los 20 iones fuertes bajo el control directo del software Xcalibur (Thermo Scientific). Obtenidos MS /MS espectros se registraron en contra de meta-señuelo base de datos RefSeq humano en Proteoma descubridor 1.2 interfaz (Thermo Fisher) con el algoritmo de la mascota (mascota de 2.1, Matrix Science). variable modificación de acetilación (lisina), di-glicina (lisina), la fosforilación ( se permitió serina y treonina) y oxidación (metionina). también, se dejó que la modificación estática de DeStreak (cisteína). La tolerancia de masa precursor fue confinado dentro de 10 ppm con el fragmento de tolerancia de masa de 0,5 dalton y un máximo de dos divisiones perdidas permitido. Asignada péptidos fueron filtradas con 5% de tasa de falsos y están sujetos a verificaciones manuales descubrir.
en el
Identificación de terceros experimento, proteínas rNanog1 /rNanogP8 se purificaron y se utilizaron cortes de gel que contienen diversas bandas de proteínas en MALDI -TOF identificación /TOF como se describe anteriormente [62]. digestos trípticos se analizaron mediante un analizador de 4700 Proteómica MALDI-TOF /TOF (AB Sciex, Foster City, CA). Las muestras se desalaron con μC18 ZipTips (Millipore, Billerica, MA) con elución directamente sobre la diana MALDI usando la matriz de α-ciano-4-hidroxicinámico en 5 mg /ml en 67% de acetonitrilo /ácido trifluoroacético al 0,1%. MS y MS /MS espectros fueron adquiridos de forma automática usando el Explorador de 4000 Serie V 3.0 RC1. Hasta 20 picos con S /N 20 fueron seleccionados para fragmentación MS /MS, con exclusión de los picos de la matriz, de la tripsina, y la queratina. procesamiento pico adicional y de búsqueda de base de datos se realizaron utilizando el Explorador de GPS v3.5. V2.0 o V2.2 MASCOTA. Los espectros se registraron en contra de la base de datos Swiss-Prot incluyendo secuencias humanos (1 de septiembre de 2009 20495 entradas). Los parámetros de búsqueda elegidos fueron la escisión por tripsina /P con un máximo de 2 fallado divisiones, modificación fija de carbamidomethylation de cisteína y modificaciones variables de proteína N-terminal de acetilación, la oxidación de metionina y la modificación del ácido piroglutámico de residuos de glutamina péptido N-terminal. La búsqueda de base de datos usando la tolerancia a la masa 50 ppm para las masas MS monoisotopic y 0,2 Da para MS /MS, hasta 100 picos con mínima S N 15 fueron seleccionados /para la EM, y hasta 65 fragmentos de iones con mínima S /N 3. La búsqueda salida combina las puntuaciones de MS de búsqueda y la búsqueda de MS /MS utilizando un algoritmo probabilístico MOWSE. La puntuación MASCOT se define como -10 * logP, donde P es la probabilidad de que el partido observado es un evento aleatorio. La mascota de la puntuación de 56, que corresponde a p & lt;. 0.05 se elige como punto de corte para un golpe significativo, y da cuenta de aquellas proteínas que exceden el valor de corte
Resultados
Siete de los ocho anti-Nanog anticuerpos detectan, en WB, la principal de 42 kD y menores de 35 kD en bandas NTERA 2-NE
Human
Nanog1
gen (gi 13376297), localizada en Chr. 12p13.31 y expresado principalmente en células madre embrionarias y de la CE, tiene un marco de lectura abierto de 915 pb (Fig. S1 A). Codifica una proteína de 305-aa que se refiere comúnmente como Nanog (Fig. 1A). proteína Nanog1 humana se predice que tienen una masa molecular de ~ 35 kD. Curiosamente, se ha informado de proteínas Nanog putativos que migran en masas moleculares aparentes de 29 a 80 kD en WB en ES, EC, y las células de cáncer somáticas (Tabla 1). No está claro, sin embargo, si estas especies de proteínas Nanog reportados representan realmente las proteínas Nanog. Para abordar esta cuestión y para determinar directamente la masa molecular (es) de la proteína Nanog endógena, primero se realizó un análisis exhaustivo del BM en las células CE NTERA-2 utilizando 8 comercial anti-Nanog (es decir, anti-Nanog1) anticuerpos (Abs) dirigida contra diferentes regiones de la proteína Nanog humano (Fig 1A;. Tabla 1, los primeros 8 Abs). Entre las 8 Abs anti-Nanog, cuatro [Kamiya Rb pAb, SC (Santa Cruz) de cabra pAb N17, Señalización Celular (CS) Rb pAb y Rb mAb] están dirigidos a la ND, dos (SC Rb pAb H-155 y R & amp ; D pAb de cabra) al extremo C-terminal, y un (Rb BioLegend pAB) para el HD (homeodominio) mientras que otro (eBioscience mAb) se levanta contra la proteína humana de longitud completa Nanog1 (figura 1A)
Los resultados WB revelaron que diferentes anticuerpos muestran una reactividad distinta y cada anticuerpo detectan varias bandas en NTERA-2 NE (nos centramos en la expresión nuclear como Nanog es un factor de transcripción nuclear) con MW que van desde ~28 kD a ~ 100 kD (Fig . 1B-H). En concreto, los resultados demostraron que:. 1) del mAb eBioscience mostró el
más limpio y más
específica
reactividad, detectando sólo un fuerte banda de ~42 kD (Figura 1B, punta de flecha roja) y una banda débil de ~ 35 kD (Fig. 1B, punta de flecha negro) en el NE sin bandas inmunorreactivas en el citosol con la exposición 3 min de la película (Fig. 1B). Por otra parte, el mAb eBioscience exhibió la sensibilidad más baja entre los anticuerpos 8. La banda de 35 kDa y otra banda de ~ 65 kD en el NE se hicieron evidentes después de un tiempo de exposición prolongado (15 min; Fig. 1B). 2) El Kamiya pAb mostró
el segundo más limpio
reactividad (Fig. 1C). Tras la exposición a corto (10 sec), se detectó una fuerte banda de 42 kD con una banda muy débil de 35 kD en el NE (Fig 1C;. Puntas de flecha rojo y negro, respectivamente). En el citosol, se detectó la banda kD 42 y varias otras bandas (Fig. 1C). Tras la exposición más larga (2 min), el Kamiya pAb también detectó tres bandas superior en ~48 kD, ~ 65 kD y ~ 90 kD en ambos NE y el citosol (Fig. 1C, las flechas verdes en panel derecho). 3) Tanto CS Rb PAB y los mAb fueron
los
anticuerpos más sensibles, que detectan los prominentes 42 kD y 35 kD bandas con solamente 1-5 segundos de exposición (Fig. 1D). Ambos anticuerpos también detectaron varias bandas adicionales (Fig. 1D, flechas verdes). 4) El SC pAb de cabra (N17) detecta una obvia banda 42 kD y una banda débil de 35 kD, junto con dos bandas superiores de ~55 kD y ~58 kD (Fig. 1E). 5) El Biolegend Rb pAb era el "más sucia 'Ab y se detecta una serie de bandas fuertes en el citosol y sólo débil 42 kD banda en el NE (Fig. 1F, flecha roja). 6) El SC Rb pAb (H-155) detecta la obvia 42 banda kD y la más débil 35 banda kD (Fig. 1G, rojo y negro puntas de flecha, respectivamente), junto con varias otras bandas a 100 kD, 70 kD, 58 kD y ~28 kD (Fig. 1G, flechas verdes). 7) Por último, el R & amp;.. D pAb de cabra detectó una banda aparente de 42 kD y una banda menor de 35 kD (Fig 1H, puntas de flecha de color rojo y negro, respectivamente), junto con varias bandas adicionales (Fig 1H, puntas de flecha verde) .
En resumen, este análisis WB integral utilizando 8 ABS y anti-Nanog la NTERA 2-NE ha puesto de manifiesto que: 1) a excepción de la BioLegend Ab, las otras 7 anti-Nanog Abs todos los
comúnmente
reconocer una de las principales 42 kD y una banda de proteína de 35 kD menor; 2) Tres anticuerpos generados contra el extremo N-terminal, es decir, Kamiya Rb pAb, CS y CS pAb mAb, dan resultados WB limpia a la exposición a corto de las películas; 3) con una exposición más larga, todos los anticuerpos detectan bandas de proteínas adicionales que van desde ~28 kD a & gt; 100 kD. Sin embargo, diferentes Abs detectan diferentes patrones de bandas de proteínas reactivas; 4) Con respecto a la sensibilidad, el mAb CS y CS pAb son los más sensibles seguido por el Ab Kamiya mientras que el mAb eBioscience es la menos sensible; 5) El BioLegend anti-Ab Nanog no detecta los 42 kDa como la banda de proteína importante en la NTERA 2-NE; y 6) Los diferentes anticuerpos pueden reconocer preferencialmente diferentes bandas de proteínas. Por ejemplo, el Kamiya pAb, pero no el CS pAb o mAb reaccionaron con la banda de 48 kD.
siRNA mediada por knock-down revela la banda de proteína de 42 kD como el predominante isoforma proteína Nanog en NTERA-2 células
Dado que la proteína Nanog predicho es ~ 35 kD, podemos inferir que el menor banda de proteína de 35 kD comúnmente detectado en WB más probable es la proteína Nanog. Para confirmar esta inferencia y para determinar si el predominante de 42 kD y cualquiera de las bandas adicionales también se Nanog proteínas, hemos realizado experimentos siRNA knock-down en NTERA-2 células. Como se muestra en la Fig. 2A, el Kamiya Rb pAb detecta constantemente la fuerte banda de proteína de 42 kDa, que disminuyó en respuesta a Nanog siRNA. Además, el menor 35 kD banda y varias otras bandas más débiles que migraba a 48 kD, 65 kD, 75 kD y 90 kD todo disminuye en las células tratadas con ARNsi Nanog (Fig. 2A). Cuando se realizó utilizando el BM CS Rb pAb, el Nanog siRNAs también derribado el 42 kD y 35 kD bandas (Fig. 2B). Además, una banda superior 65 kD también se redujo (Fig. 2B). Tenga en cuenta que el CS pAb no detectó 48 kD o de otras bandas superiores, excepto la banda 65 kD (Fig. 2B), en consonancia con los resultados anteriores WB con el CS pAb y mAb (Fig. 1D). En conjunto, el siRNA knock-down experimentos sugieren que
la proteína Nanog en células NTERA-2 parece a emigrar, en la desnaturalización SDS-PAGE, en múltiples masas moleculares incluyendo aproximadamente
35
, España
42
, España
48
, España
65
, España
75
, y
90
kD con ser la banda de 42 kDa de la dominante "isoforma"
.
Caracterización de las especies de proteína Nanog en NTERA-2 células por inmunoprecipitación (IP) seguido de espectrometría de masas de identificación (MS) (ID)
Para corroborar los resultados siRNA desmontables, que realizaron dos series de experimentos de identificación de proteínas basadas en MS.
En la primera
, hemos realizado experimentos IP utilizando 500 g de NE de NTERA-2 y somáticos células cancerosas y con 5 anti-Nanog Abs, es decir, eBioscience mAb, Kamiya APB, CS Rb mAb, SC pAb H155 y R & amp; D pAb de cabra (Fig 3;.. Fig S2A-B; datos no mostrados). Los 5 anticuerpos inmunoprecipitaron la banda de 42 kD Nanog en NTERA 2-NE. Por ejemplo, cuando IP se realizó con el pAb Kamiya seguido de WB utilizando eBioscience mAb (Fig 3A, carril 9.) O R & amp; D pAb de cabra (Fig. S2A, carril 10), se inmunoprecipitó la proteína 42 kD. IP con el Rb mAb CS, también dirigido contra el N-terminal de Nanog, tira hacia abajo la banda de 42 kD (WB usando el R & amp; D pAb de cabra; la Fig. 3B, carril 9). Cuando IP se realizó con el SC pAb H-155, dirigido hacia el C-terminal de Nanog, seguido por WB utilizando eBioscience mAb (Fig 3C, carril 8.) O R & amp; D pAb de cabra (Fig. S2B), el 42 proteína kD se inmunoprecipitó en la NTERA-2 NE. Como se muestra en la Fig.