Extracto
La identificación de nuevos biomarcadores de cáncer es importante para la detección temprana del cáncer, ya que puede reducir las tasas de mortalidad. El secretoma cáncer, la colección de todas las macromoléculas secretadas por una célula tumoral, altera su composición en comparación con el tejido normal, y este cambio juega un papel importante en la observación de la progresión del cáncer. La recopilación y el análisis preciso de secretomas cáncer podrían conducir al descubrimiento de nuevos biomarcadores, lo que mejora los resultados del tratamiento del cáncer. Hemos descubierto inesperadamente que el autoensamblaje enzima capacitada (EISA) de un D-péptido resultados hydrogelator en nanoredes /hidrogel alrededor de las células cancerosas que sobreexpresan ectophosphatases. Aquí mostramos que estas nano-redes son capaces de recoger rápidamente las proteínas en el espacio pericellular (es decir, cerca de la superficie) de las células cancerosas. Debido a que las sustancias secretoras están en su concentración más alta cerca de la superficie de la célula, el uso de nano-redes pericelulares para recoger el cáncer secretoma maximiza el rendimiento y calidad de las muestras, reduce las variaciones de pre-análisis, y permite el perfilado dinámico de muestras secretoma. Por lo tanto, este nuevo enfoque tiene un gran potencial en la identificación de la señalización heterotípica en microambientes tumorales mejorando así la comprensión de microambientes tumorales y acelerar el descubrimiento de biomarcadores potenciales en la biología del cáncer. Los datos están disponibles a través de ProteomeXchange con PXD003924 identificador
Visto:. Zhou R, Kuang Y, Zhou J, X Du, Li J, Shi J, et al. (2016) Nanonets Recoger cáncer secretoma desde el espacio pericellular. PLoS ONE 11 (4): e0154126. doi: 10.1371 /journal.pone.0154126
Editor: Mateo Bogyo, Universidad de Stanford, Estados Unidos |
Recibido: 31 Agosto, 2015; Aceptado: 9 Abril de 2016; Publicado: 21 Abril 2016
Derechos de Autor © 2016 Zhou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo es apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud (R01CA142746), Fundación Kenneth Rainin, y una beca de la Fundación Nacional de Ciencia (DMR-1420382). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Como el cáncer es una de las enfermedades más costosas y mortales para la salud pública (por ejemplo, NIH estima que los costes globales de cáncer en 2008 fue de $ 201.5 millones de euros [1]), la detección temprana del cáncer, por lo general resulta en menos extenso tratamiento y mejores resultados generales, es una solución óptima para minimizar significativamente el costo y salvar vidas. De hecho, esfuerzos considerables se han centrado en el descubrimiento de biomarcadores de cáncer. Mientras que el secretoma se define como el conjunto de todas las macromoléculas secretadas por una célula, la secretoma cáncer difiere en composición de la secretoma de los tejidos normales debido a mutaciones genéticas específicas en células de cáncer. En principio, el secretoma cáncer es un tesoro de biomarcadores de cáncer. [2] Sin embargo, la identificación definitiva de los biomarcadores del cáncer sigue siendo un reto importante debido a que las proteínas en secretoma cáncer, los componentes solubles clave de microambientes tumorales, [3,4] son
dinámico y complejo
. Desafortunadamente, los métodos convencionales (por ejemplo, medio condicionado (CM)) de recogida de cáncer secretoma tiene sus límites y no puede acomodar la dinámica y complejidad de secretoma cáncer. Durante nuestra investigación sobre la formación catalizada por enzimas de nanofibrillas supramoleculares, [5-12] que descubierto inesperadamente que las nano-redes /hidrogel de un pequeño D-péptido forma selectiva en el espacio pericellular de ciertas células cancerosas debido a su sobreexpresión de ectophosphatases [12,13 ]. Debido a que D-péptidos resisten la digestión por proteasas, la nano-redes /hidrogel a base de D-péptido es estable y puede atrapar moléculas secretadas (Figura 1A-1C). Por lo tanto, la formación pericellular de nano-redes basadas en péptidos D /hidrogel ofrece una nueva oportunidad en el proceso de muestreo mediante el aprovechamiento de las diferencias biológicas entre el cáncer y las células normales.
(A) La desfosforilación del precursor se convierta en hydrogelator cerca la superficie de la célula (es decir, el espacio pericellular) por ectophosphatases. (B) El autoensamblaje de hydrogelators forman redes de nanofibras. (C) Ilustración de la secuestro del cáncer secretoma por Nanonets /hidrogeles formados en el espacio pericelular de células cancerosas. (D) Diagrama de flujo de la utilización de la nano-redes pericellular /hidrogel para recoger las proteínas en el cáncer de secretoma.
Nuestro estudio muestra que dentro de 2-4 h, la nano-redes pericellular /hidrogel no sólo recoge más del total de las proteínas secretadas a partir de células HeLa de medio acondicionado hace (por ejemplo, medios de comunicación cultivaron con células de cáncer de 24 horas), pero también reduce las variaciones de pre-análisis y permite el perfilado temporal de muestras secretoma cáncer. Como una técnica poderosa para la recogida rápida y selectiva de secretoma cáncer, el uso de nano-redes de D-péptido, por lo tanto, sirve como un método general de muestreo muy necesaria en el espacio pericellular, donde sustancias secretoras están en sus concentraciones más altas. Dentro de este enfoque utilizando nano-redes pericelulares, nuestra investigación de los perfiles temporales de secretoma cáncer también proporciona una visión de percepción en la naturaleza dinámica de secretoma cáncer, que puede ser una herramienta útil cuando se utiliza junto con otros métodos de cuantificación (por ejemplo, SILAC), y eventualmente desvelando biomarcadores de cáncer clínicamente válida para la detección y tratamiento del cáncer. Además, el enfoque establecido en el presente trabajo podría ayudar a desarrollar nuevos métodos para recoger las sustancias de señalización secretora (por ejemplo, los exosomas [14] y miRNAs [15])
in vitro
y
in vivo
, en última instancia, con lo que una nueva comprensión de la biología del cáncer y la atención clínica.
Procedimientos experimentales
bloques de construcción de nano-redes /hidrogel
sobre la base de nuestra investigación anterior sobre la formación de las nanofibras pericellular /hidrogel en las células cancerosas, [12] que utiliza un par de precursor /hydrogelator para la formación enzimática de pericellular nanoredes /hidrogel a través de auto-ensamblaje. El precursor de la hydrogelator es un naftaleno (Nap) tripéptido capsulado que consiste en D-amino de residuos de ácido y es fosforilada en el residuo de tirosina, Nap-D-Phe-D-Phe-D-Tyr (PO
3H
2) (1
p). Tras la desfosforilación, el precursor se convierte en Nap-D-Phe-D-Phe-D-Tyr (1), que auto-ensambla en la fase acuosa para formar un hidrogel. [16] La sobreexpresión de ectophosphatases de células cancerosas permite la auto montaje de 1 alrededor de las células para formar redes de nanofibras (es decir, Nanonets). En nuestro trabajo anterior, [12] hemos demostrado que la nano-redes pericelulares se forman en la superficie de células HeLa dentro de 2 h de incubación con 1
p (400 g /ml). Seguimos nuestro procedimiento anterior, disolviendo precursor de 1
p en ddH
2O con ajuste de pH a 7,4 por adición de NaOH 1N para producir la solución de reserva.
Colección de Nanonets /hidrogeles o medio en el medio completo
3 × 10
5 de las células HeLa en 2 ml de medio MEM completo se sembraron en una placa de Petri de 35 mm. Después de 24 h de incubación, se retiró el medio, y las células se lavaron con 2 ml de medio completo MEM fresco una vez. Para la recogida de Nanonets /hidrogeles, 1 ml de medio MEM completo que contiene 1
p en 400 mg /ml (diluido a partir de una solución 20X de stock de 1
p en tampón de PBS, preparada inmediatamente antes de su uso) se añadió a reemplazar el medio de cultivo. Después de 2 h de incubación a 37ºC, el plato se colocó en una habitación 4 ° C durante 5 min. El plato se inclina y se agita para recoger los Nanonets /hidrogeles unifamiliares en medio. Utilizando una amplia pipeta de transferencia boca, recogimos el medio en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se centrifugó a 7500 rpm durante 1 minuto. El medio de suspensión se retiró cuidadosamente con una pipeta de 200 l para dar las Nanonets /hidrogeles (Fig 1D, también dos clips de vídeo (S1 vídeo y S2 de video) grabación de la colección de nano-redes y el medio se pueden encontrar en los archivos de soporte) para gel electroforesis. Para la recogida de medio, a las células se añadió 1 ml de medio MEM completo sin 1
p y las células se incubaron a 37ºC durante 2 o 24 h. 100 l del medio se recogieron después de la incubación. Para cada uno de los experimentos, la muestra se obtiene a partir del mismo lote de células. Tanto los Nanonets /hidrogeles y el medio se congelaron inmediatamente a -80ºC después de la recolección. El experimento de control adicional 2h_N no hay células y experimentos de perfiles dinámicos siguen el mismo procedimiento de recogida de nanoredes /hidrogel. Los detalles de estos experimentos se describen en el archivo S1.
SDS-PAGE
18 l de cada muestra se mezcló con tampón de carga de 12 l de 2X Laemmli. Las soluciones se mezclaron y se incubaron a 95 ° C durante 5 min. 15μL de la solución se utiliza para SDS-PAGE. Precast gel al 4-20% en Tris-HCl (10 bueno, 30 l) se utilizó. El gel se hizo funcionar a un voltaje constante de 200 V.
análisis de espectrometría de masas y la base de datos de búsqueda
Para el análisis de la masa proteica, el gel fue teñido por Coomassie. Cada carril se cortó en tres secciones con intervalos de peso molecular en: 250-80 (250-75); 80 a 40 (80 a 37); 40-10 kDa. Las bandas de gel fueron extirpados con el menor exceso de gel vacío posible, y se colocaron en un tubo de microcentrífuga con ddH
2O. Las muestras se almacenaron en tubos Eppendorf y se envían al Centro de Taplin Espectrometría de Masas (TMSF de la Escuela de Medicina de Harvard) para el análisis. Las imágenes del gel antes de la escisión de bandas de gel se presentaron (fotocopia y electrónicamente) junto con la muestra. La muestra preparada para la proteína espectrometría de masas es de 10 g por carril. Espectrometría de masas y la identificación de proteínas se realizaron mediante TMSF.
Todas las proteínas se identificaron mediante SEQUEST (el algoritmo de búsqueda de base de datos, http://thompson.mbt.washington.edu/sequest) a partir de los resultados de espectrometría de masas y predijo patrón de fragmentación del péptido. La información de salida SEQUEST fue proporcionado por TMSF, incluyendo secuencias de péptidos, XCorr (correlación cruzada), ΔCn (correlación delta), número de péptidos únicos y totales y los recuentos totales de espectro. Los archivos de resultados SEQUEST se convierten en PRIDE XML válido para su presentación a la base de datos a disposición del público por PRIDE convertidor PRIDE [17]. Los datos proteómicos de espectrometría de masas se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange a través del PRIDE [18] repositorio de asociarse con el identificador de conjunto de datos y PXD003924 10.6019 /PXD003924.
Resultados
Tiempo de la compatibilidad recogida y celular de las nano-redes
para seleccionar el tiempo óptimo de incubación para la recogida de las nano-redes, las células HeLa se incubaron con 1
p para 3 a 9 h, y la cantidad de tubulinas (un marcador de la autolisis de las células) [ ,,,0],19] en las nano-redes se comparó con el mismo volumen (20 l) de CM recogidos después de 24 h de incubación. Las nano-redes recogidos después de 3 ó 6 horas de incubación contienen menos que la tubulina recogido después de 24 horas CM (Figura A en la figura S1), lo que sugiere que las nano-redes recogidos dentro de las 6 h de incubación contienen menos proteínas que resultan de autolisis. En otro experimento, se prueba la viabilidad de las células después de la recolección nanonet (4 h de incubación con 1
p) y encontramos que el choque frío y la eliminación medio casi no inducir a cualquier cambio en la viabilidad de las células (Fig B en S1 figura). Estos resultados confirman que el choque de frío para recoger las nano-redes dentro de las 6 h de incubación con las células es adecuado para recoger el secretoma.
mayor cantidad y calidad de la secretoma recogida por el nanoredes
Para demostrar que nanoredes pericellular se acumula con rapidez proteínas secretoras, llevamos a cabo 3 parámetros experimentales para el mismo tiempo de incubación 2h: en primer lugar, las nano-redes pericellular recogidos a partir de células HeLa tratadas con 1
p en medio de cultivo completo (2h_N); segundo, el medio completo se incubaron con células HeLa (2h_CM) para la comparación; y finalmente, el medio completo se trató con 1
p y 0,1 U de fosfatasa alcalina sin células HeLa (2h_N sin células) como control. Sin procesamiento adicional, se aplica directamente electroforesis de las muestras. Las nano-redes auto-ensambladas se disocian para monomérica 1 tras la mezcla con tampón de carga de Laemmli. Debido a su pequeño peso molecular (643 Da), 1 corre fuera del gel y tiene poco efecto adverso en la tinción o el análisis de proteínas adicional de la gel. Como se muestra en la figura 2A, a pesar de ser enmascarada por proteínas de suero bovina (en su mayoría albúminas), tinción con plata de SDS-PAGE de los dos ensayos de 2h_N y 2h_CM revela que 2h_N tiene mancha oscura que 2h_CM hace. Image J [20] El análisis muestra que, en ambos ensayos, las bandas a 300, 160, y 13 kDa todos tienen obviamente mayor densidad en 2h_N que en 2h_CM, que ilustra que hay más proteínas en estas bandas en 2h_N (Fig 2B) . Sin embargo, la banda a 55 kDa, que consiste principalmente de albúmina bovina del medio de cultivo, tiene una mayor densidad en 2h_CM que en 2h_N en ensayo I y tiene una densidad similar en 2h_CM y 2h_N en el ensayo II. Estos resultados sugieren que las proteínas adicionales recogidos por los nano-redes son las proteínas de secreción a partir de células HeLa en lugar de las proteínas del suero del medio de cultivo. Como se muestra en la figura 2C, la espectrometría de masas en tándem de la proteína muestra más
péptidos totales
y
péptidos únicos
(péptido que sólo existe en una proteína en proteoma humano) en 2h_N (1995 y 963 (ensayo I), 1952 y 990 (ensayo II)) que en 2h_CM (1401 y 603 (ensayo I), 1593 y 714 (ensayo II)) y no hay células 2h_N (1209 y 784). Además, 2h_N también contiene considerablemente más
proteínas totales y
identificaron proteínas gratis (la proteína con 2 o más péptidos únicos) que 2h_CM y 2h_N no hay células no (figura 2D). Estos resultados están de acuerdo con la observación en el teñido con plata de SDS-PAGE que 2h N contiene más proteínas que colecciones CM.
(A) teñido con plata de SDS-PAGE que muestra las proteínas de HeLa secretoma obtenido de las nano-redes pericelulares después de 2 h de incubación de los precursores con las células (2h_N) y se recogió por centrifugación de medio acondicionado después de 2 h de incubación (2h_CM). Un pedazo de hidrogel (Gel) se carga para SDS-PAGE y se tiñó como el fondo. (B) Densidad relativa de las bandas de proteínas de 2h_N y 2h_CM en los dos ensayos con un peso molecular de 300, 160, 55 y 13 kDa. (C) De acuerdo a la proteína de LC-MS /MS, el número de péptido total y péptido único observados a partir de proteínas de la HeLa secretoma obtenido en 2h_N, 2h_CM, y las proteínas en 2h_N no hay células. (D) El número de proteínas totales y proteína identificada (número único péptido ≥2) [21,22] observadas a partir de proteínas LC-MS /MS en el HeLa secretoma obtenidos en 2h_N y 2h_CM en dos ensayos y proteínas en 2h_N no hay células. (E) Correlación de los éxitos de péptidos únicos de proteínas detectadas en 2h_N de los dos ensayos. (F) La correlación de los éxitos de péptidos únicos de proteínas detectadas en 2h_CM de los dos ensayos. (G) La comparación de las proteínas identificadas entre 2h_N y 2h_CM (las proteínas enumeradas son identificados en ambos ensayos de 2h_N o 2h_CM). HeLa secretoma reportado en la literatura [23] sirvió como referencia. Análisis (H) de las 122 proteínas identificadas en ambos ensayos de 2h_N. La información de localización subcelular de las proteínas se recogió de UniProt. gráficos (I) circular que representa perfiles funcionales moleculares de las proteínas en el secretoma recogidos por nano-redes pericelulares a partir de células HeLa 2h_N y medio de cultivo después de 2 h de incubación. 2h_CM Las propiedades secretoras predichas de las proteínas se analizaron por secretoma 2.0 y la clasificación funcional se analizó por PANTHER.
Si bien los ensayos 2h_N tienen 161 y 181 proteínas identificadas, sólo 144 proteínas se identificaron en el 2h_N ninguna célula juicio, significativamente menor que los anteriores ensayos con células HeLa. Se espera que la falta de proteínas identificadas debido a que la ausencia de células HeLa en este experimento de control no resultaría en secretoma cáncer. Los ensayos 2h_CM, por otro lado, tienen 128 y 108 proteínas identificadas, que es ligeramente menor que 2h_N no hay células de prueba. Una posible explicación para la diferencia proteína única entre las nano-redes y CM podría ser el efecto de concentración potencial de nano-redes. Es posible que las nano-redes tienen cierta afinidad a las proteínas de baja concentración existentes en el espacio pericellular y medio. Este enriquecimiento de las nano-redes puede dar lugar a algunas proteínas identificadas en los resultados. Además, se analiza la superposición de las proteínas identificadas entre 2h_N ninguna célula, 2h_N y 2h_CM. La superposición media entre 2h_N no hay células y 2h_N es de 84 proteínas, 30% de proteínas (89, 30% para el trail I y 79 proteínas, 29% para el trail II). La superposición media entre 2h_N sin células y 2h CM es de 63 proteínas, 37% (60 proteínas, 37% para el trail I y 66 proteínas, 36% para el trail II). Este experimento de control adicional demuestra que a pesar de que las nano-redes pueden tener un efecto de concentración, las nano-redes formada en la superficie de células de cáncer todavía trampa suficiente secretoma para compensar la posible influencia de la enriquecimiento medio.
Para evaluar la pre-analítica variación entre los dos métodos, las nano-redes y CM, trazamos las proteínas identificadas en los dos ensayos (realizados por diferentes operadores) por el número de péptidos únicos (es decir, el número de iones primarios únicas) [24] de las proteínas. Como se muestra en la figura 2E y 2F, la regresión lineal de las proteínas identificadas en los dos ensayos de 2h_N tiene un
valor R 2 de 0,77, que es significativamente superior a la de los dos ensayos de 2h_CM (R
2 valor = 0,47), lo que indica la reproducibilidad entre los dos ensayos de 2h_N es mucho mayor que la de 2h_CM. Por otra parte, la comparación de la cantidad de péptido única de proteínas observadas en ambos 2h_N y 2h_CM indica que la mayoría de estas proteínas tienen péptidos más únicas detectadas en 2h_N que en 2h_CM, lo que confirma que las nano-redes pericelulares recogen más proteínas secretoras que CM hace.
por otra parte, 67 de las proteínas totales identificados en ambos ensayos de 2h_N (122 proteínas) y en ambos ensayos de 2h_CM (81 proteínas) (figura 2G) son idénticas (Tabla a en la Tabla S1). Mediante la exploración de la red de interacción proteína-proteína [25] de estas 67 proteínas (Fig S2), nos encontramos con que la mayoría de las proteínas (50; 75%) son actins, serpinas, colágenos, tubulinas y sus proteínas de interacción. A pesar de ser citosólica en origen, actins, tubulinas y serpinas están comúnmente presentes en la secretoma de células humanas, incluyendo las células de cáncer, [26,27], que está de acuerdo con la característica de la secreción de proteínas no convencional. [27] Además de estas 67 proteínas, 2H N contiene 55 proteínas adicionales (Tabla B en la Tabla S1), y 45 de ellos están los informes, asociados con la progresión de ciertos tipos de cánceres. Entre las 55 proteínas observadas sólo en 2h N, 50 de ellos han sido observados en el secretoma de otras células cancerosas. Sin embargo, sólo 27 de las 55 proteínas se han documentado en la secretoma de células HeLa (obtenidas de CM ultra-filtrado de células HeLa se incubaron con medio libre de suero). [23] Por otro lado, 2h_CM tiene sólo 14 proteínas adicionales, aparte de las 67 proteínas compartidos (Tabla C en la Tabla S1). Estos resultados indican que 2h_N es más sensible en la recogida de proteínas secretoras que 2h_CM. Curiosamente, sólo el 34,4% de las 122 proteínas identificadas en 2h_N son proteínas de secreción y la mayoría del resto son proteínas intracelulares, según la clasificación de UniProt. [28] Sin embargo, la predicción basada en la función muestra que más del 60% de las proteínas son proteínas de secreción, clásica (por SignalP [29]) y no clásica (por SecretomP [30]) (Fig 2H). Estos datos son similares a las pruebas de la observación de fluido corporal cuya secretoma contiene proteínas secretoras clásicos y no clásicos, así como las proteínas intracelulares. [31] Por otro lado, el perfil de proteínas de 2h_N sin células (Tabla I en S1 Tabla) sólo muestra 35% del total de proteínas secretoras predichos. Este resultado se corresponde en gran medida al hecho de que proteínas del medio de cultivo solamente se recogen sin interferencia de secretoma de células HeLa. A continuación, utiliza PANTHER [32] para analizar los datos de espectrometría de masas de proteínas de las muestras de 2h_N y 2h_CM. Mientras que los porcentajes de la mayoría de las categorías de las proteínas identificadas son bastante similares en las muestras de 2h_N y 2h_CM, las proteínas secretoma recogidos por nano-redes muestran porcentajes más altos de proteínas para catalítica, antioxidante, y las actividades de unión (Fig 2I). Los resultados anteriores confirman que las nano-redes auto-ensambladas actúan como un método más preciso y sensible para la recogida de secretoma cáncer que las CM.
proteínas totales de perfil temporal de secretoma cáncer registrados por nanoredes
El corto tiempo de incubación permite que las nano-redes pericellular para registrar la dinámica de secretoma cáncer. Como se muestra en la figura 3A, la incubación de las células HeLa en medio FBS-libre para diferentes periodos de tiempo y a continuación, cambiar el medio de FBS de libre medio que contiene 1
p para un 4 h adicional de incubación produce nanonet-recogido secretoma de HeLa Células. El experimento de control utiliza CM para recoger el secretoma de las células HeLa incubadas en medio FBS-libre durante 24 h. [33] De acuerdo a la proteína de análisis de espectrometría de masas de estas muestras (Figura 3B), las cantidades de péptidos totales y péptidos únicos disminución con respecto a la n_0 muestra a la muestra antes de N_8 se invierte la tendencia para la muestra N_12, que tiene una cantidad ligeramente mayor de péptidos que la muestra n_0. Aunque CM proporciona los datos acumulativos útiles de HeLa secretoma después de la norma 24 h de incubación, es obviamente incapaz de capturar el cambio dinámico de la cantidad de las proteínas en el secretoma durante 24 h de incubación.
(A) esquema que muestra la colección de nano-redes de células HeLa expuestas en medio FBS-libre para diferentes periodos de tiempo. Como control, CM se recogió a partir de células HeLa expuestas en-FBS libre medio durante 24 h. (B) Número de péptidos y péptidos únicos totales observados en n_0, n_4, N_8, N_12, y CM por la proteína espectrometría de masas. (C) Cantidad de proteínas totales y proteína única (número único péptido ≥2) [34,35] observado en n_0, n_4, N_8, N_12, y CM por la proteína LC-MS /MS. (D) El cambio en el número péptido único de varias proteínas esenciales en secretoma observados en las nano-redes. (E) El cambio en el número péptido único de varias proteínas representativas (recogida en las nano-redes) que tienen altos péptido hits únicos observados en la EM perfiles de proteínas.
Categorías de las proteínas siguen siendo globalmente equilibrada
A pesar de ciertas proteínas individuales en los secretomas muestran una variación considerable, las categorías funcionales de las proteínas en el secretoma siguen siendo bastante constante. Utilizamos PANTHER para analizar los datos de la LC-MS /MS de estas muestras con tiempos de pre-incubación de 0 a 12 h (Figura 4A, Tabla H en la Tabla S1). Los porcentajes de cada categoría de proteínas identificadas permanecen casi constantes. Ocho de diez categorías (Fig 4b) de la secretomas muestran la misma tendencia en temporales cambios de la cantidad de proteínas inicialmente disminución seguida de aumento de más adelante. La actividad de unión de factores de transcripción y proteínas antioxidantes muestran diferentes respuestas a la privación de nutrientes (es decir, FBS medio libre): proteínas antioxidantes aumentan después de un intervalo corto (4 h) de la privación de nutrientes; proteínas de unión a factores de transcripción aumentan después de un intervalo medio (8 h), de la privación de nutrientes. Curiosamente, estos dos tipos de actividades comparten líneas de base comparativamente bajos en términos de su pequeña cantidad de proteínas. Debido a la tendencia general de la composición de las proteínas es que se mantiene constante a FBS-privación, la gran variación de las distintas categorías de pequeñas cantidades de proteínas es poco probable que sea causada por los intentos de mantener Proteostasis
.
(A) Temporal gráficos circulares representan los perfiles funcionales moleculares de cáncer de secretoma recogido después de la privación de FBS para diferentes períodos de tiempo: 0 (n_0), 4 (n_4), 8 (N_8) y 12 h (N_12). (B) El gráfico representa comportamientos temporales de diferentes categorías de secretoma cáncer en base a las funciones de la molécula, durante el FBS-privación de diferentes períodos de tiempo (0, 4, 8 y 12 h) y la incubación en medio condicionado durante 24 h. (C) La trama ilustra la gama fluctuante (que se muestra como la desviación estándar) del comportamiento temporal de secretomas categorizados.
Para entender mejor los perfiles temporales de secretoma durante FBS-privación, también incluimos el resultado de 24 h de incubación en medio condicionado (CM) como la referencia (Fig 4B). Como se muestra en la figura 4B, la cantidad de proteínas en el CM está cerca de la cantidad promedio de proteínas en los secretomas durante los cambios temporales (de 0 a 12 h). Este resultado implica que las actividades celulares globales es probable que permanezcan equilibrados durante la privación de FBS. Además, estos resultados indican que 4 h de incubación con las nano-redes conduce a la perturbación mínima de la secretoma. Para entender el cambio temporal de la secretoma de una manera más precisa, también calcular las cantidades relativas de proteínas (S3-S7 higos) y valores de desviación estándar en cada categoría de las proteínas. Como se muestra en la figura 4C, la distribución de las desviaciones estándar de los cambios temporales de cada categoría de proteína difiere entre las categorías de proteínas. Por ejemplo, mientras que el valor de la desviación estándar de las proteínas secretadas en la categoría de la actividad molecular estructural y de unión es mayor que 20, el valor de desviación estándar de las proteínas secretadas en la categoría de la actividad del factor de transcripción antioxidante y de unión a proteínas es inferior a 5. Esta distinción en la distribución indica que la medida de las respuestas a FBS-privación varía entre cada categoría de proteínas secretoras. Estos resultados, por lo tanto, proporcionan una visión útil para el funcionamiento de las células cancerosas en la privación de nutrientes.
Los cambios relativos de proteínas en cada categoría funcional
El cambio relativo de la cantidad de proteínas, en el por otro lado, muestra un perfil cambiante imparcial de secretoma mediante el uso de la diferencia definida entre cada punto de tiempo, dividido por los resultados de un grupo de control (24 h de incubación en medio FBS-libre) durante todo el período de tiempo experimental. El resultado del cambio relativo (valor RC) para cada secretoma se calcula utilizando la siguiente fórmula:. La comparación del patrón de cambio temporal basado en el valor de RC para 69 proteínas seleccionadas con perfiles cambiantes de manera significativa se ilustra en la figura 5. Dado que ciertas proteínas pueden pertenecer a más de una categoría, la información sobre la categoría funcional de cada proteína se incluye en el mapa de calor. El rango total de los valores de RC (de -86% a 100%) refleja las tendencias generales de la secreción estable de células de cáncer durante el estímulo de FBS-privación. Varias proteínas exhiben un valor RC grande (PCBP1, Aldh7a1, PRMT1, CALD1, etc.). Este fenómeno se debe probablemente al pequeño número de péptidos únicos detectados en el control. Este resultado indica, además, que el uso de nano-redes en lugar del CM es un método más potente y adecuado para recoger secretoma cáncer.
De 0 a 4 h, 42 de los 69 proteínas (que se muestra en color rojo a azul ) exhibir valores de RC positivos (figura 5), lo que sugiere un aumento de la cantidad de la proteína en respuesta a la falta de nutrientes. Después de otras 4 h, la tendencia general se convierte en una disminución de la secreción, como se evidencia por los valores negativos de RC de 38 de 69 proteínas (que se muestran en color gris a negro). Durante los períodos de tiempo cotizadas de 8-12 hy 12-16 h, la secreción también insinúa un patrón similar, ya la disminución de la cantidad de secreción exhibe valores negativos para RC 46 y 39 de las 69 proteínas, respectivamente, a lo largo de estos dos períodos. Un análisis categorizado (Fig 5) de secretoma cáncer revela que la mayoría de las proteínas dentro de la misma categoría funcional comparten rara vez una tendencia común de los perfiles temporales de secreción tras la estimulación. Sin embargo, para las proteínas multifuncionales (es decir, pertenecen a diferentes categorías funcionales), sus perfiles temporales por lo general presentan tendencias similares en todo el tiempo de estimulación. Por ejemplo, las proteínas agrupan en categorías funcionales de tanto la actividad de unión y catalítica, como MCM2, DHX9, DHX15, SNRNP200, todos muestran una disminución de la abundancia para el primero 4 h y posterior aumento para el resto de FBS-privación; pero otras proteínas en una sola de estas dos categorías (ya sean vinculantes o categoría catalítica) casi no muestran características comunes. Este personaje es aparentemente único de proteínas "multifuncionales". Por ejemplo, GCN1L1, PSMD2, y IQGAP1, que pertenecen a ambas actividades catalíticas y enzimáticos, exhiben la misma cantidad de aumento de la secreción de las primeras 4 h, siguen por disminución. Este fenómeno no se conocía previamente, y sin duda merece estudios adicionales.
El cambio dinámico de ciertas proteínas específicas
Dado que los cambios dinámicos de la secretoma de las células cancerosas han sido hasta ahora inalcanzables, a pesar de que contiene gran importancia información, se analizan los cambios en la abundancia de varias proteínas esenciales en las muestras de n_0 a N_12. Al comparar el número de accesos de péptidos únicos de estas proteínas ayuda a establecer sus perfiles temporales (Figura 3D y 3E). Como se muestra en la figura 3D, la cantidad de alfa-actina 2 (ACTA2) y beta-actina (ACTB) muestran poco cambio con el tiempo (0-4 h (n_0) a 12 a 16 h (N_12)) y la cantidad de alfa-tubulina 1A (TUBA1A) y 2A beta-tubulina (TUBB2A) sólo cambian ligeramente con el tiempo, de acuerdo con la observación de que actins y tubulins tienen una presencia constante en el secretoma de células de mamífero. [26,27] por el contrario, la cantidades de colágeno alfa-1 (XII) (COL12A1) y fibronectina (FN1) disminuyen drásticamente, es decir, el colágeno alfa-1 (XII) desaparece de n_4 a N_12, y la fibronectina está ausente en N_8 y N_12. La cantidad de dos enzimas, la serpina H1 (SERPINH1) y piruvato quinasa (PKM), también disminuye significativamente de n_0 a N_12. Estos resultados sugieren que, para hacer frente a la inanición inducida por FBS-privación, las células HeLa disminuyen significativamente o posiblemente reabsorben las proteínas de la matriz extracelular y las enzimas secretadas para mantener Proteostasis. [36] que también examinó varias proteínas con altos péptido hits únicos ( Fig 3E). En particular, la cantidad de plectina (PLEC) sufre el mayor cambio desde n_0 a N_12. Si bien es probable para el propósito de mantener Proteostasis la disminución de plectina de n_0 a N_8 por las células HeLa, el aumento repentino de plectina en N_12 indica una liberación aliviado de exosoma, [37] acordar las células de cáncer de comportamiento hambre que intentan manipular tumor microambientes (es decir, estimulan estroma y células endoteliales) para ayudar a su progresión [38,39] Hay otra observación interesante:., mientras que la cantidad de todas las otras proteínas disminuir en un cierto grado en al menos una muestra de nano-redes, la cantidad de piruvato