Extracto
El análisis de células individuales en suspensión ha permitido descubrimientos críticos en las pruebas de drogas, inmunología y la investigación con células madre. Además, un cambio de dos a tres condiciones de crecimiento dimensional afecta radicalmente el comportamiento celular. Esto ya dio lugar a nuevas observaciones sobre la expresión génica y las redes de comunicación y en mejores predicciones de respuestas de las células a su medio ambiente. Sin embargo, todavía es difícil de estudiar el tamaño y la forma de las células individuales que están suspendidos libremente, donde los cambios morfológicos son muy significativas. Aquí se describe un nuevo método para la monitorización en tiempo real para la cuantificación del tamaño celular y la morfología, en las células cancerosas vivas suspendidas individuales, no confinada en tres dimensiones. La precisión es comparable a la de los mejores microscopios ópticos, pero, en cambio, no es necesario para confinar la célula hasta el plano de la imagen. El primero aquí introducido
se hace posible magnetorotation celular
método (CM) por
nanopartícula inducida por la magnetización de células
. Mediante el uso de un campo magnético giratorio, la célula marcada magnéticamente es girado de forma activa, y el período de rotación se mide en tiempo real. Un cambio en la morfología induce un cambio en el período de rotación de la célula en suspensión (por ejemplo, cuando la célula se hace más grande que gira más lento). La capacidad de monitorear, en tiempo real, la hinchazón o la muerte celular, a nivel de una sola célula, se demuestra. Este método podría utilizarse para el análisis de la morfología de células individuales en tiempo real multiplexado, con implicaciones para las pruebas de drogas, el descubrimiento de fármacos, la genómica y el cultivo tridimensional
Visto:. Elbez R, McNaughton BH, Patel L, Pienta KJ , Kopelman R (2011) Nanopartículas celular inducida por la magneto-Rotación: Monitoreo de morfología, el estrés y la sensibilidad a los fármacos de una célula cancerosa individual suspendido. PLoS ONE 6 (12): e28475. doi: 10.1371 /journal.pone.0028475
Editor: Christina Chan, Universidad del Estado de Michigan, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Marzo, 2011; Aceptado: 8 de noviembre de 2011; Publicado: 13 de diciembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Elbez et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (NIH-R01-EB007977 (RK), NIH-R33CA125297-03S1 (RK) y NIH-R21EB009550 (RK)). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la heterogeneidad, es decir, la falta de uniformidad, que se encuentra en las poblaciones de células cancerosas y la diferenciación celular ubicua, ha llevado a un mayor interés en los estudios de células individuales [1] - [4]. Históricamente, se pensaba que un tumor que se originan a partir de las divisiones sucesivas de una única "célula madre", lo que lleva a la suposición de que todas las células de un tumor comparten el mismo código genético. Sin embargo, hallazgos recientes han alterado esta teoría, haciendo hincapié en la necesidad de herramientas que pueden monitorear y rastrear células individuales en un alto rendimiento de moda [5] - [8]. Actualmente, los ensayos estándar realizados sobre poblaciones de células hacen patrones individuales de difícil acceso, debido a los efectos de un promedio de [9]. La citometría de flujo, por ejemplo, se ha utilizado de forma masiva en los últimos 20 años, por su capacidad para llevar a cabo un análisis rápido en un número muy elevado de células en un momento (10000 células /s). análisis de punto de tiempo también puede realizarse usando esta técnica, pero no es posible hacer un seguimiento de cada célula individual.
Por otra parte, es especialmente importante que incluso una pequeña minoría de células, tales como células madre, cuyo comportamiento podría ser considerado como estadísticamente irrelevantes en comparación con la gran mayoría de la población, puede tener un impacto biológico y médico crítico. Por ejemplo, el uso de la
El imatinib
fármaco que se dirige el
proteína de fusión BCR-ABL Hoteles en pacientes con leucemia mieloide crónica (LMC) parecía primero en ser una de las terapias dirigidas más exitosos. Sin embargo, el tratamiento no elimina las células madre de LMC, y con la retirada de Imatinib la enfermedad reapareció [10], [11]. Como consecuencia, el enfoque en las variaciones de célula a célula también ha permitido importantes avances en la comprensión de la diferenciación celular, la respuesta al fármaco, los mecanismos de proteínas y dinámicas, así como de la importancia del papel desempeñado por las células madre, especialmente para las células madre del cáncer [12]. La metástasis se basa en las células cancerosas que circulan en la red vascular. Las células responsables de la propagación del cáncer a los sitios tumorales secundarios son extremadamente raros (unas pocas células por millón en la sangre), y que pasan por una etapa en circulación antes de completar otros tejidos. Por lo tanto, junto con el análisis de células individuales, tres ensayos dimensionales también permiten una mejor comprensión de la dinámica celular [13] - [15], por el estrechamiento de la brecha entre los
in vitro e
in vivo
comportamiento [7]. Sin embargo, todas las técnicas de análisis de células individuales anteriormente mencionados están restringidos por su confinamiento de la célula en dos dimensiones. Para superar esta limitación, empleamos un nuevo enfoque utilizando
celular magneto-rotación suspendida gratis (CM).
En concreto, se utiliza un
celular inducida por nanopartículas Magneto-rotación método
, donde el campo magnético de accionamiento y la célula de rotación son
fuera de sincronía
entre sí. Las células se incrustan con 30 nanopartículas magnéticas comerciales nm (Océano Nanotech®) y se hacen girar bajo un campo magnético externo de alrededor de 1 mT, en about100 Hz. Observamos que mil veces (1000 ×) campos más altos, del orden de 1T, se utilizan para la RM. Además, las nanopartículas magnéticas se han utilizado ampliamente en biología [16] - [20]. Así, el método CM está diseñado para ser biocompatible y no tóxico. La célula viva se hace girar
asíncrona gratis (ver complementaria Información S1) en suspensión, y su frecuencia de rotación es muy sensible a cualquier cambio morfología. Como se informó aquí, magneto-rotación no afecta a la viabilidad de la célula, y permite que se realice el análisis en tiempo real. Los cambios en la morfología celular se indican cuantitativamente por período de rotación de la celda individual. Las tendencias en la velocidad de rotación permiten la discriminación entre una célula sana, una célula o una célula moribunda hinchazón. Además, esta nueva técnica es fácilmente adaptable a cualquier microscopio set-up, es libre fluorescente de la etiqueta, y es compatible con la fluorescencia simultánea y /o otros métodos de imagen óptica y espectroscopia así como separación magnética y técnicas de enriquecimiento. Otros métodos utilizados para realizar un seguimiento de los cambios morfológicos de las células biológicas individuales incluyen Microscopía de Fuerza Atómica [21] (AFM) y pinzas ópticas [22] (OT). Estos métodos pueden ofrecer una mayor resolución, pero están limitados por la unión de las células a una superficie (AFM), o por el daño irreversible causado por captura láser (OT). Además, con OT, para cada línea celular, estudios de viabilidad tienen que hacerse para cada tipo de célula con el fin de evitar el daño solar, lo que limita su aplicabilidad [23]. El uso de voladizos También se ha informado para realizar un seguimiento de la masa de células vivas [24], pero no hay publicaciones todavía en las células cancerosas individuales en suspensión.
Resultados
Modelo para la rotación de magnéticamente células
Para comprobar que las células podrían ser manipulados magnéticamente, se los colocó en el centro de bobinas magnéticas con amplitudes de campo magnético de 1 mT, como se muestra en la Figura 1b marcado. Las bobinas mismos están adaptados a la plataforma de un microscopio con el fin de grabar vídeos (ver Figura suplementaria S4 y complementario del vídeo S1). Las células individuales giran a frecuencias que van desde 0,05 Hz a 2 Hz en esta configuración (mucho más bajo que los 100 Hz campos de prácticas, debido a que operan en el
asíncrono régimen
, ver más abajo). Centrándose una baja potencia, 1,45 mW láser HeNe a través del microscopio, la señal dispersada hacia adelante se graba con un fotodiodo [25]. La viabilidad de las células no se ve afectada por este láser de baja intensidad, como se muestra en Figura S3 y cuadros complementarios S1 y S2. Cuando la célula gira, se produce la modulación de rotación dependiente de la que se puede medir con el fotodiodo. Con el procesamiento de señales en tiempo real, el periodo de rotación de la célula y por lo tanto su tamaño /morfología se puede monitorizar en tiempo real.
a) Esquema de la instalación completa. Una célula placa vivo Array®, con 100 micras pozos, se coloca en la plataforma de un microscopio, para lo cual se ha adaptado una serie de electroimanes. Tenga en cuenta que la célula no está pegada a la parte inferior del pozo. Bajo el objetivo × 60, el rayo láser se somete la dispersión hacia adelante desde la célula de rotación (15 a 20 micras), y las variaciones en la luz dispersada hacia adelante se capturan en tiempo real por un fotodetector, y se analizaron en un ordenador. b) Esquema de una célula de rotación colocado en el interior de las bobinas magnéticas: dos señales sinusoidales idénticos, con un desplazamiento de fase de 90 °, pasan a través de los dos pares de bobinas. El campo magnético aplicado y el momento magnético de la célula no están alineados, la creación de un par de torsión que impulsa la rotación de la célula. c) Período rotacional de una célula de una fijación en DMEM. El recuadro representa la señal sin procesar del fotodetector, que muestra la periodicidad más de una ventana de tiempo dada. El tratamiento de la señal da entonces el período de rotación (sección Véanse los métodos de la configuración óptica para la descripción del tratamiento de la señal). d) Leyenda de la configuración. Custom Helmoltz bobinas con NUNC de células vivas matriz de Placa en la platina del microscopio.
La célula se encuentra para exhibir un comportamiento de giro magnético muy similar a la de una micropartícula magnética (Complementario. Fig S1). Como se muestra por McNaughton et al. [26], y extendida al caso de partículas superparamagnéticas [27], existe una frecuencia crítica del campo magnético externo por encima del cual la partícula no gira sincrónicamente con el campo, es decir, la partícula no puede mantenerse más con la frecuencia de excitación. En este régimen asíncrono, el valor medio de la velocidad de rotación de la célula individual está dada por, donde es el par magnético y es el arrastre debido a las fuerzas de viscosidad. Aquí,
κ
es su factor de forma de Einstein,
V
el volumen y
η
el coeficiente de viscosidad. Observamos que es proporcional a la magnitud del campo magnético, el momento magnético de la celda y el volumen de los magnéticos
contenido
de la célula; Sin embargo, todos estos parámetros se mantienen constantes en los experimentos. Por lo tanto, en el régimen asíncrono, cualquier cambio en la forma o el volumen de la célula, es decir, en su volumen efectivo,, induce un cambio en la velocidad de rotación, dado por la fórmula anterior. Este modelo se ha perfeccionado para el caso de partículas paramagnéticas [28], [29], en el que el período de rotación, se encuentra que es proporcional al volumen eficaz, (esto es cierto en el régimen de rotación asíncrono; para una derivación completa , ver ref. 27 y ecuaciones en Información complementaria S1). Como puede verse a partir de esta dependencia, si el volumen aumenta, el período de rotación aumenta proporcionalmente. Lo mismo ocurre con el factor de forma, y, como consecuencia, se puede detectar cambios en la morfología.
caracterización magnética de las células
Para caracterizan, además, la magnetización de las células, se observó el localización de las nanopartículas después de la incubación, para determinar si se quedaron unidas a la superficie, consiguió interiorizado, y, si lo hicieran, si las nanopartículas son libres de moverse en el citoplasma o atrapados en vesículas (endosomas). Para ello, adjuntamos dyemolecules HPTS fluorescentes (8 - hidroxipireno - 1,3,6 - trisulfónico, sal trisódica) a nuestras nanopartículas, utilizando las fuerzas de atracción electrostática entre las partículas y los colorantes. HPTS es un colorante impermeable de membrana, y por lo tanto se necesita un vector para ser internalizado por las células. Siguiendo el protocolo estándar de la incubación, se lavaron las células tres veces en PBS, y se observaron las células bajo excitación a 450 nm con fluorescencia que se comprueba a 510 nm. Los resultados se muestran la figura 2a. Como podemos ver, las nanopartículas magnéticas son internalizados por la célula a través de endocitosis. Además, ni el núcleo ni el citoplasma muestra fluorescencia, lo que indica que las nanopartículas permanecen en las vesículas. Por otra parte, se evaluó el contenido de hierro de las células mediante la medición de plasma de acoplamiento inductivo (ICP) (véase la sección Métodos). Como era de esperar, el contenido de hierro aumenta con la concentración MNP en el medio de cultivo, y aparece la tendencia a ser lineal en la ventana de concentración que hemos utilizado (figura 2b). Para nuestros experimentos de rotación, se estimó que el contenido de hierro es de alrededor de 14 pg /célula. En comparación con la masa de una nanopartícula, esto significa que, en promedio, menos de 20.000 nanopartículas se han metido en la célula. Otros tamaños de nanopartículas magnéticas también se probaron (10 nm, 100 nm y 200 nm), pero internalización se maximizó para partículas con un diámetro de 30 nm (datos no mostrados).
a) de la fluorescencia de imagen (40 × ) de una células HeLa después de la incubación con nanopartículas magnéticas teñidos en una concentración de hierro extracelular de [Fe] = 12,5 ug /ml (0,22 mM). b) contenido en hierro celular en picogramos por célula. Las concentraciones de partículas en los medios de comunicación se dan en la concentración de hierro (valores barras de error representan la media +/- 0,5 * SD, n = 3).
Ensayo de citotoxicidad y sensibilidad a los fármacos
en este estudio, las células cancerosas cargados con nanopartículas fueron separadas magnéticamente y se volvieron a suspender en diferentes medios, tales como medio de cultivo (DMEM), DMEM con 5% de etanol, DMEM con 100 ug /ml de cisplatino o DMEM con 75% de agua deionifzed. Cada medio se utilizó para verificar los diferentes aspectos de este método: DMEM se utilizó como control, el etanol se utiliza como un agente citotóxico, cisplatino se utiliza para modelar un ensayo de drogas; También, para promover el estrés a través de la inflamación celular, se utilizó una gran proporción de agua DI, invirtiendo el equilibrio iónico entre el interior y el exterior de la célula. Tenga en cuenta que una gran concentración de sal en solución tiene el efecto opuesto en la célula, a saber, la reducción de la misma. Las células en suspensión fueron entonces pipeta en una matriz de Vivo Cell ™ placa (NUNC ™), donde la matriz tiene 100 micras pozos de ancho, que proporcionan compartimentos adecuados para células individuales para girar y ser analizados. señales de dispersión óptica (a partir de las células de rotación) se registraron y los cambios en el período de rotación se realizaron mediciones de los diferentes medios de comunicación (figura 3). Magneto-rotación se realizó bajo numerosas condiciones, con diferentes muestras de células; los siguientes resultados muestran ejemplos típicos de comportamiento de las células que se han reproducido varias veces en nuestro sistema.
a) en DMEM en una capa de agarosa b) En una mezcla de agua DI 75% y 25% DMEM c) En una mezcla de DMEM con 5% de etanol y d) para una célula viva en DMEM (círculos verdes) en comparación con una célula HeLa (cuadrados rojos) en DMEM con un 100 ug /ml de cisplatino. El eje Y es el periodo normalizado, y el eje X es el tiempo en segundos. Las líneas muestran tendencia entre los puntos conectados. Para cada gráfica, en las imágenes anteriores que, las imágenes inferiores muestran instantáneas de la célula hace girar a cada tiempo indicado, mientras que las imágenes esquemáticas en la parte superior de ella muestran las formas de células correspondientes (teléfonos fijado no se muestra). discos oscuros representan el citoplasma celular y la membrana, mientras que las manchas grises muestran las vesículas formadas en la superficie, en su caso.
Figuras 3a y 3b muestran dos casos de inflamación celular. Cell inflamación generalmente se produce debido a la presión osmótica creada ya sea por un desequilibrio iónico, como se mencionó anteriormente, o por la falta de nutrientes. De cualquier manera, la célula se expande para hacer frente con el desequilibrio de los productos químicos necesarios para el mantenimiento de su metabolismo. Para llegar a la disparidad iónico, se utilizó agua DI (figura 3b). También se observó que las células también se hinchaban cuando se coloca sobre una capa de agarosa (agarosa al 2% en agua DI) (figura 3b). en gel de agarosa es poroso, una propiedad que se utiliza en la electroforesis de proteínas, y esta propiedad podría estar en el origen de la hinchazón. De hecho, los nutrientes presentes en el medio de crecimiento, principalmente glucosa, pueden difundirse en el gel de agarosa, mientras que las células giran por encima de ella. Por tanto, las células se hinchan para equilibrar la concentración reducida de nutrientes disponibles en solución, como se observa por Goldberg et al. en las células corticales [29]. Dado que aumenta el volumen celular, el período de rotación aumenta. Alternativamente, la muerte celular se provoca cuando se coloca en una solución con 5% de etanol (figura 3c) o el uso de una concentración de 100 ug /ml de cisplatino en la solución (Figura 3D, línea roja que conecta puntos cuadrados). Sin embargo, los mecanismos de este tipo de muertes celulares son diferentes de los casos anteriores, desde vesículas aparecen en la superficie de la célula. En 5% de etanol, sólo se necesita alrededor de 30 minutos (Figura 3C) para vesículas que aparezcan, mientras que en el caso del tratamiento por el cisplatino en 100 ug /ml, se tarda varias horas. Contrariamente al caso de hinchamiento, son los cambios en la forma de la membrana celular que aumentan el volumen efectivo. Formación de ampollas y la formación de vesículas en la superficie de la célula indican que los contenidos de la celda son descompuestos y se separan en varias vesículas. A medida que continúa el proceso de la muerte, los tamaños de vesículas aumentan. Este tipo de fenómeno no sólo añadir al volumen, pero afecta críticamente el factor de forma de la célula. La combinación de estos dos parámetros, a saber, el
efectiva volumen
, es lo que se hace un seguimiento con magnetorotation, amplificando así el efecto de la formación de ampollas. Con el tiempo, la resistencia de la célula se vuelve tan alta, en comparación con el estado inicial de la célula, que el período de rotación de células se eleva drásticamente (por 550%), de una manera no lineal (véase las figuras 3c, línea roja en la figura 3D y véase la Fig. 4 para una comparación con las mediciones del microscopio). Así, tanto los mecanismos de muerte celular, aunque muy diferente, pueden ser observadas y diferenciado con Magnetorotation Cell.
a) Comparación de la sensibilidad entre microscopio y magneto-rotación en la medición de la muerte celular (células HeLa en DMEM, 5% de etanol) . En rojo es el área superficial normalizado medido con el microscopio, y en azul es el período volumen efectivo normalizado medido con Magneto-rotación utilizando información suplementaria S1. b) Comparación de la muerte celular mediante el seguimiento de la magneto-rotación y el ensayo de células vivas /muertas.
magnetorotation también se realiza de una célula sana (figura 3d, línea verde), en medio de crecimiento. En ausencia de un agente tóxico, el período de rotación no cambió significativamente (la desviación estándar del período de rotación era de 15%). Una prueba de control de la morfología fijo fue realizado por fijando las células en un vial de formaldehído 4% (1,5 ml) durante 10 min, bajo rotación vial de extremo a extremo (ver Figura S2, línea roja). Puesto que la membrana y el contenido de células fueron reticulada, la morfología de las células no cambió, bajo condiciones isotónicas, y por lo tanto, como se esperaba, el período de rotación no cambió. En comparación con una célula de una fijación, en el que el período de rotación es muy plana, por células vivas se observa que el período de rotación, con el tiempo, exhibe fluctuaciones significativas en tiempo corto. Esto puede ser el resultado del metabolismo celular, que todavía está activo durante la rotación. En general, esto demuestra que cuando el período de rotación es constante, que corresponde a una celda que no está cambiando de manera significativa en su volumen efectivo.
Para evaluar la exactitud del método con respecto a las modificaciones efectivas de volumen, se compararon las tendencias en el volumen efectivo (proporcional al período de rotación) con los de la superficie, como se estima a partir de imágenes de microscopía (el área superficial de ser un indicador estándar del factor de la morfología celular /forma). Con un software de imágenes (Adobe Photoshop), se estimaron las áreas superficiales de las células a intervalos regularmente espaciados. Como puede verse en la figura 4a, magneto-rotación es tan eficaz como una configuración de microscopio óptico para la observación de cambios pequeños. Sin embargo, los cambios más grandes, magneto-rotación amplifica la respuesta, en comparación con la configuración de microscopio óptico. Cualquier pérdida significativa del contenido magnético tarda varios días, de acuerdo con Arbab et al. [30]. Por lo tanto su impacto en la interpretación de los resultados, después de varias horas, puede ser ignorada. Además, la velocidad de rotación constante de una célula de control magnetizado tiende a confirmar que la pérdida de contenido magnético no es significativo sobre el lapso de tiempo de la medición. De lo contrario, el momento magnético de la célula disminuiría la crítica, y la célula se frenaría considerablemente, lo que no es el caso (figura 3d). Por lo tanto, podemos suponer con seguridad que el volumen efectivo de la célula es de hecho proporcional al período de rotación. Magneto-rotación también puede ser comparado a Live /Dead ensayos de células. Las células se prepararon siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Antes de pipetear a la microplaca, añadimos 2,0 l de calceína y 5,0 l de yoduro de propidio (PI) a una muestra que contiene células de 1 ml. Las células se dejaron sentarse en la incubadora durante 10 min, y luego se resuspendieron en DMEM con 5% de etanol y la misma cantidad de colorantes, después de lo cual, se pipeteó y girar. Como puede verse en la figura 4b, la célula se somete a cambios de morfología bien antes de la fluorescencia PI se puede ver, y por el tiempo de la muerte celular (PI definido) se produce, el período de rotación se ha ralentizado por un factor de aproximadamente 2. Esto no sólo espectáculos que el método magneto-rotación 'se compara bien con los ensayos fluorescentes, pero también muestra que es más sensible. No es sorprendente ver la velocidad de rotación ralentizar
bien antes
uno está siendo capaz de detectar la fluorescencia de los tintes PI. De hecho, los tintes PI sólo se abren camino en el citoplasma después de que las paredes de las células se han destruido. Sin embargo, mucho antes, otros procesos se llevan a cabo, una de ellas es la formación de ampollas en la superficie de la célula, un fenómeno que células magneto-rotación puede controlar con precisión, lo que no es el caso para el ensayo de MTT por ejemplo.
Efectos de la magneto-rotación sobre la viabilidad celular y la división
para investigar la capacidad de la instalación para monitorear la muerte celular, sin causar la muerte celular, se realizaron varias pruebas de viabilidad (la exposición al láser, a corto plazo y largo efectos a largo plazo de la rotación en la viabilidad, la división celular y clonogenicidad).
en primer lugar, probaron el efecto de la incorporación de nanopartículas magnéticas [amarilla (RHS) y rojo (en el centro) bares en la Figura 5A], y de la presencia de un campo magnético, sobre la viabilidad celular [red (centro) y azul (LHS) bares en la Figura 5A]. Se realizó la prueba de viabilidad en tres poblaciones diferentes de células HeLa. Después de una hora a 37 ° C, con una humedad y CO
2 de control, un recuento de células se hizo usando azul tripán. No hubo diferencia significativa en la viabilidad entre los tres grupos de células (Figura 5A). Esto muestra que ni la constitución de las partículas ni la rotación bajo un campo magnético afecta la viabilidad de células sobre la escala de tiempo de una hora. De hecho, el mismo tipo de nanopartículas de óxido de hierro magnético se utilizan con bastante frecuencia [16], [30] para magnetophoretically ciertas poblaciones de células separadas de las poblaciones heterogéneas, así como durante las exploraciones de MRI en pacientes (para la mejora del contraste), sin causar daño a las células . En las pruebas de viabilidad anteriores, la intensidad del campo y las concentraciones de partículas magnéticas se fijan a propósito a valores más altos (0,5 mT y 40 ug /ml) que los descritos en este documento para magnetorotation (0,1 mT y 25 ug /ml), con el fin de mantener un margen de seguridad en el protocolo.
a) células HeLa viabilidad después de la incubación con nanopartículas y la rotación bajo un campo magnético giratorio. Todas las células provienen de la misma línea celular, y se cultivaron a la vez, cada uno por 4 días. células HeLa se cultivaron hasta alcanzar 70% de confluencia, y la primera muestra constituyeron el grupo de control (RHS). Los otros dos grupos, se incubaron con nanopartículas magnéticas, se originaron del mismo lote de células, las células cultivadas en presencia de 40 ug /ml en DMEM, hasta alcanzar 70% de confluencia. Cada grupo estaba compuesto de dos muestras que contenían 50.000 células cada uno. Mientras que la segunda muestra no se hizo girar, el tercero (control) se puso bajo un campo de 0,5 mT y hace girar a una frecuencia de excitación de 100 Hz (LHS). Durante el experimento, las células se mantuvieron a 37 ° C, con 5% de CO
2 y la humedad control. Para cada grupo, n = 3. Los valores representan la media +/- S.D.. b) magnético células HeLa viabilidad antes y después de la exposición al láser. Las células HeLa se incubaron con nanopartículas magnéticas, durante 48 horas, siguiendo el protocolo descrito antes. En una placa de 96 pocillos, se pipeta 150 ul de cada conjunto de células. medición de control (azul) se realizó después de las células se lavaron, se separan y se resuspendieron en medio fresco a 37 ° C. No expuestas (rojo) y las células expuestas (verde) se mantuvieron en la platina del microscopio para 120 min a temperatura ambiente. Cada pocillo contenía 25.000 células. Los valores representan la media +/- 0,5 * s.d. n = 3. c) células HeLa viabilidad durante magneto-rotación a 37 ° C, con control de humedad y CO2 5%. Las células HeLa se pipeta en una matriz de células vivas (NUNC ™). Las células atrapadas en los 100 um pocillos se contaron usando calceína. Tanto para el control y los grupos de células giradas, n = 4. muerte de la célula se controló usando yoduro de propidio. Las desviaciones estándar se encuentran dentro de los puntos.
Otra posible preocupación hemos abordado es el efecto de la exposición al láser sobre la viabilidad de la célula (figura 5b). La prueba de viabilidad no muestra ninguna muerte celular significativa y ninguna diferencia significativa después de dos horas, entre las células de control y células magnéticas que fueron expuestas al láser. Tanto la interacción de las células con la luz y la posible interacción de las nanopartículas magnéticas con el láser no afectan a la viabilidad de las células.
Finalmente, se investigó el posible impacto de la rotación física de las células en su viabilidad. De hecho, con el fin de controlar con precisión los efectos de toxicidad, la rotación de células tiene que ser inofensivo. Figura 5c Destinatarios de este último punto. La comparación de la tasa de mortalidad de las células giratorios y la tasa de mortalidad de las células no magnéticos, no se encontraron diferencias estadísticas en las dos tendencias (n = 4, p = 0,245 & gt; 0,05, F = 1,65 & lt; 5,98 = F
crit ). Además, como se observó (datos no presentados) y como se describe en otras publicaciones [30], las células que contienen nanopartículas magnéticas pueden ser subcultivadas. Además, para evaluar la clonogenicidad de las células, se realizó un ensayo clonogénico en células fueron giradas primera magnéticamente durante 24 horas en una incubadora, y luego dejar de crecer en agarosa durante tres semanas. No se encontraron diferencias significativas entre las muestras de control y las muestras rotadas (n = 3, t = 1,37 & lt; 2,77 = t
de crítico, p = 0,24 & gt; 0,05 = p
crit, ver Figura S3).
por último, también a prueba el efecto de la magneto-rotación en la división celular. La pregunta era: ¿qué magneto-rotación impide la división celular inmediata? Para investigar los efectos a corto plazo, rotamos células en agarosa durante 72 horas, y se comparó el crecimiento celular con otros dos controles (no marcados y las células marcadas magnéticamente en ausencia de campo magnético). No se encontraron diferencias entre los dos grupos diferentes de células marcadas magnéticamente (ver Figura suplementaria S4). Esto también descarta cualquier hipertermia magnética potencial sucediendo durante la rotación.
Discusión
inocuidad del método
El uso de nanopartículas magnéticas y campos magnéticos alternos se ha asociado comúnmente con la hipertermia , un proceso en el que las nanopartículas de vibración dentro de las células producen calor, con el tiempo de matar las células marcadas a través de un aumento de la temperatura. Como consecuencia de ello, la capacidad de rotar células a través de la internalización de nanopartículas magnéticas similares y la aplicación de un campo magnético giratorio, es decir, alternando en dos direcciones al mismo tiempo, sin causar daño a la célula ha sido una preocupación, aunque somos el uso de campos mucho más bajos por un orden de magnitud, y frecuencias en los rangos de unas pocas docenas Hz en lugar de unos pocos 100 kHz [31], [32].
Nuestra primera preocupación era entonces para asegurar que la rotación en sí mismo no mató a las células. Nuestros resultados muestran que la viabilidad de las células se conserva mientras se hacen girar. También la exposición a un láser (débil) (con el fin de captar una señal de dispersión de la célula de rotación) no tiene ningún efecto sobre la viabilidad celular a corto plazo, como se muestra en la figura 5b. Sin embargo, la presencia de un láser no es necesario, y la señal también se puede analizar a través de una cámara, la eliminación de cualquier riesgo mucho tiempo que una exposición a largo plazo a un rayo láser podría causar.
Nuestros resultados también muestran que la la internalización de nanopartículas magnéticas no causa ningún efecto sobre la viabilidad celular, y que sólo afecta a la división celular mediante la reducción de la tasa de crecimiento durante un corto tiempo, más de un número limitado - a lo sumo 3 - de ciclos celulares, antes de llegar a las tarifas normales. De hecho, nuestras células marcadas magnéticamente han sido subcultivadas con éxito en placas de Petri, y se observó ninguna diferencia en la viabilidad (ver información S1) o en las tasas de proliferación después de tres ciclos de división (datos no mostrados). De acuerdo con los datos publicados anteriormente [33], también encontramos que las células marcadas magnéticamente crecieron a un ritmo más lento que las células no marcadas con, hasta tres ciclos de división, y desde ese punto en adelante, las tasas de crecimiento fueron de nuevo a normal (ver información complementaria S1 ). También, como se ha mencionado, de acuerdo con Arbab et al. [30] la presencia de nanopartículas magnéticas de células internalizado no causa efectos nocivos a largo plazo sobre la viabilidad de las células (en un período de 5 a 7 ciclos de división, es decir, más de varias semanas).
La presencia de una campo magnético giratorio, y las rotaciones de frecuencia sub-hertz inducidas que fueron inducidos en las células marcadas magnéticamente no tener un impacto a largo plazo sobre la división celular, como se muestra en nuestro ensayo clonogénico y por el recuento de células, después de las células de rotación de 24 a 72
horas.
por lo tanto, nos han demostrado que para cualquier magnetorotation muerte celular observada fue la consecuencia de un entorno tóxico inducido deliberadamente. Además, esperamos que ya que las células no mueren como resultado de la rotación, el crecimiento celular, y los estudios críticos de latencia incluso se pudo realizar (trabajo en progreso). Vale la pena señalar que la división celular se ha observado durante la rotación (ver video S3), y no parecen células que giran a tener una tasa de división diferente en comparación con las células no giratorias marcadas magnéticamente (véase la información S1) Con todo, la diferencia en la tasa de crecimiento observada durante la rotación puede ser sin duda asociada con el etiquetado de las células con nanopartículas, y no el impacto de rotación en sí.
Este estudio presenta una diferencia importante en la viabilidad celular en comparación, por ejemplo, a la
célula electro-rotación
método, que utiliza el cytolplasm no uniformidad para inducir un dipolo eléctrico.