PLOS ONE: Necdin, un regulador negativo del crecimiento, es una novela STAT3 Gen Objetivo reducido regulado en Cancer

humano
Extracto

citoquinas y factores de crecimiento que implican vías de señalización STAT3 se activa con frecuencia constitutivamente en muchos tumores humanos primarios, y son conocidos por el papel de la transcripción que desempeñan en el control del crecimiento celular y la progresión del ciclo celular. Sin embargo, la medida del alcance de STAT3 en el control transcripcional del genoma en su conjunto sigue siendo una cuestión importante. Predijo que esta señalización STAT3 persistente afecta a una amplia variedad de funciones celulares, muchas de las cuales aún se conservan a caracterizar. Tomamos un enfoque amplio para identificar nuevos genes regulados STAT3 mediante el examen de los cambios en el perfil de expresión de genes en todo el genoma de microarrays, el uso de células que expresan STAT3 activada constitutivamente. Utilizando el análisis computacional, hemos sido capaces de definir los perfiles de expresión génica de las células que contienen STAT3 activada e identificar genes candidatos objetivo de una amplia gama de funciones biológicas. Entre estos genes se identificaron Necdin, un regulador de crecimiento negativo, como un nuevo gen STAT3 objetivo, cuya expresión es el regulado en el mRNA y los niveles de proteína STAT3 cuando es constitutivamente activa. Esta represión es dependiente de STAT3, ya que la inhibición de STAT3 usando siRNA restaura expresión Necdin. Un sitio de unión a ADN STAT3 fue identificado en el promotor Necdin y ambos EMSA e inmunoprecipitación de la cromatina confirmar la unión de STAT3 a esta región. Necdin expresión ha sido previamente demostrado que las reguladas en un melanoma y una línea celular de cáncer de ovario resistente a los medicamentos. Un análisis más detallado de la expresión Necdin demostró la represión de una manera STAT3 dependiente en el melanoma humano, próstata y líneas celulares de cáncer de mama. Estos resultados sugieren que STAT3 coordina la expresión de genes implicados en múltiples vías metabólicas y de biosíntesis, la integración de señales que conducen a cambios transcripcionales globales y la oncogénesis. STAT3 puede ejercer su efecto oncogénico por hasta la regulación de la transcripción de genes implicados en la promoción del crecimiento y proliferación, sino también por la reducción de la expresión de los reguladores negativos de los mismos procesos celulares, tales como Necdin

Visto:. Haviland R , Eschrich S, G Bloom, Ma Y, Minton S, Jove R, et al. (2011) Necdin, un regulador negativo del crecimiento, es una novela STAT3 Gen Objetivo reducido regulado en el cáncer humano. PLoS ONE 6 (10): e24923. doi: 10.1371 /journal.pone.0024923

Editor: Toshi Shioda, Hospital General de Massachusetts, Estados Unidos de América

Recibido: 21 Agosto, 2010; Aceptado: August 24, 2011; Publicado: 27 Octubre 2011

Derechos de Autor © 2011 Haviland et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Angela Musette Russo (http://www.russofoundation.com/), H. Lee Moffitt Cancer Center y el Instituto de Investigación (http://www.moffitt.org) y el Instituto Nacional del cáncer (NCI) subvención R01-CA115674 (http://www.cancer.gov/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

STAT3 es un factor de transcripción citoplasmática latente, inducida por una variedad de señales ascendentes, incluyendo factores de crecimiento, citoquinas y tirosina quinasas no receptor [1] - [7]. Tras la activación por fosforilación de la tirosina, STAT3 forma dímeros, que se translocan al núcleo y regulan la transcripción de genes diana. En condiciones fisiológicas normales, la actividad STAT3 está estrechamente controlada; sin embargo, las vías de señalización intracelulares que implican STAT3 frecuencia se activan constitutivamente en muchos diferentes tumores primarios humanos [8] - [15]. Nosotros y otros han demostrado que la activación constitutiva de STAT3 proporciona células cancerosas con proliferación y supervivencia ventajas [16] y aumenta la angiogénesis del tumor [17] y la metástasis [18]. Estudios recientes también han indicado que la activación de STAT3 contribuye a la evasión inmune tumor [19], [20]. Estos hallazgos indican que la señalización de STAT3 aberrante afecta a una amplia variedad de funciones celulares fundamentales a través de múltiples mecanismos.

Hasta la fecha, hasta reguladas expresión de numerosos genes diana STAT3 ha sido identificado, incluyendo VEGF [17], Bcl-2 , Bcl-xL [21], p21, ciclina D1 [22] y survivina [23]. Estos genes diana STAT3 en general se han identificado en una base individual, mientras que pocos estudios han intentado identificar un gran número de genes regulados STAT3 [24] - [28]. Tomamos un enfoque amplio para identificar nuevos genes regulados STAT3 implicados en la oncogénesis mediante el examen de los cambios en el perfil de expresión de genes en todo el genoma de microarrays, el uso de células que expresan STAT3 constitutivamente activa. La combinación de este enfoque con el análisis computacional de los resultados de microarrays, hemos sido capaces de definir el perfil de expresión génica de las células que expresan STAT3 activada y examinar el papel de STAT3 en tanto la regulación positiva y negativa de la expresión génica.

Camino y funcional el análisis demostrar que STAT3 tiene un papel importante en la regulación, tanto positiva como negativamente, una gran variedad de procesos celulares, además de la transcripción. STAT3 coordina la expresión de genes implicados en múltiples vías metabólicas y de biosíntesis, la integración de señales que conducen a cambios transcripcionales globales y la oncogénesis. Estos incluyen los genes que participan en la adhesión celular, la remodelación del citoesqueleto, nucleótidos, lípidos y metabolismo de las proteínas, así como la transducción de señales.

A través de análisis computacional de nuestros datos, hemos identificado Necdin, un regulador negativo del crecimiento, como una novela potencial gen diana STAT3. Necdin es un supresor de crecimiento potente que se expresa predominantemente en las neuronas post-mitótico [29] - [32]. expresión Necdin se ha demostrado que las reguladas en ambas líneas celulares de carcinoma y tumores primarios [33], lo que sugiere que la represión de la expresión Necdin puede tener un papel en la oncogénesis. Hemos comprobado que la expresión de mRNA Necdin se correlaciona inversamente con la actividad STAT3 en células que expresan STAT3 constitutivamente activo y que STAT3 regula directamente la expresión de Necdin a nivel promotor. Además, la expresión Necdin en líneas de células tumorales humanas es inversamente correlacionada con la activación de STAT3 endógeno. Nuestros resultados proporcionan más evidencia de un papel de Necdin como un objetivo fisiológico de STAT3, lo que demuestra que el análisis computacional de los datos de microarrays se puede utilizar para identificar los posibles genes diana STAT3 para una mayor investigación.

Resultados

La identificación de los posibles genes diana STAT3 utilizando el oligonucleótido microarrays

Para identificar potenciales nuevos genes regulados STAT3, hemos examinado globales patrones de expresión génica en líneas celulares que albergan STAT3 persistentemente activa. Perfiles de expresión génica en tales células es probable que sean representativos del perfil genético de una célula de cáncer con la expresión aberrante de STAT3, en comparación con la inducción de la actividad STAT3 transitoriamente utilizando estimulación exógena, tales como IL-6 o transfección transitoria [25].

ARN se cosechó de las células normales Balb /c-3T3 con bajos niveles de actividad STAT3 endógeno, para servir como un control. ARN también fue extraído de células Balb /c-3T3 transfectadas de forma estable ya sea con v-Src, conocidos para inducir la activación persistente de STAT3 [34], [35], o el mutante constitutivamente activo, STAT3-C [36]. Se recogieron muestras por triplicado, uno por cada uno de los tres pases consecutivos, y cada muestra de ARN se hibridó a un solo genoma del ratón Affymetrix GeneChip 430 2.0. Se utilizó el análisis de la importancia microarrays (SAM) [37] para identificar los genes expresados ​​diferencialmente entre células y células Balb /c-3T3 parentales transfectadas de forma estable ya sea con v-Src o STAT3-C. Se aceptaron todos los genes identificados por SAM como diferencialmente regulada por al menos 1,5 veces [38].

Superposición de los dos datos de microarrays Establece

Análisis de microarrays y la posterior SAM generan dos listas de expresados ​​diferencialmente genes: una lista de genes identificados expresados ​​diferencialmente entre las células de control Balb /c-3T3 y células transfectadas con v-Src, y la segunda lista comprende los genes expresados ​​diferencialmente entre las células de control Balb /c-3T3 y células transfectadas con STAT3-C. Los genes comunes a las listas son más propensos a ser regulada directamente por STAT3. Estos genes fueron identificados por las referencias cruzadas de los datos de las dos listas utilizando la función de Microsoft Excel BUSCARV

Mientras que las células transformadas v-Src tienen STAT3 constitutivamente activa, Src también estimula otras vías de STAT3-independiente [39]. - [42]. En contraste, los genes diana activadas por STAT3-C se limitan a la unión directa de la proteína activa a los sitios de consenso STAT3 en el ADN. Por lo tanto, utilizando células transfectadas de forma estable ya sea con v-Src o STAT3-C nos permitió controlar las variaciones clonales, así como la divergencia en las vías dependiendo del mecanismo de la activación de STAT3 señalización. El uso de microarrays múltiples replica en nuestro enfoque más aumentos confianza en los resultados. Esto nos permitió identificar un conjunto de genes comunes como objetivos de STAT3. Los datos fueron validados por la identificación de varios genes STAT3 reguladas previamente caracterizadas, incluyendo CCND1, p21 [22], VEGFA [17], y MCL-1 [43]. El más significativamente sobre-expresado (inducido) y bajo-expresada (reprimidos) genes se enumeran en la Tabla 1 y la Tabla 2, respectivamente. Una lista más amplia, incluyendo los 50 primeros significativamente sobre-expresados ​​y los genes expresados ​​bajo-se incluyen en las Tablas S1 y S2.
STAT3 putativo
Hasta la fecha, la mayoría de los estudios han examinado genes diana que están reguladas o sobre expresan STAT3 cuando está activo. STAT3 se ha demostrado para activar la transcripción de muchos genes implicados en la oncogénesis [8], la supervivencia celular [16], la progresión del tumor [23] y la metástasis [18]. STAT3 también ha sido previamente demostrado que reprimir la transcripción de un puñado de genes, incluyendo p53 [44] y el óxido nítrico sintasa [45] Sin embargo, nuestros resultados demuestran que STAT3 es capaz de reprimir la expresión de un número mucho mayor de genes. Este nuevo descubrimiento tiene el potencial de afectar profundamente la biología de las células que albergan STAT3 constitutivamente activa.

Uno de estos genes que parece ser reprimidos por STAT3 es el regulador de crecimiento negativo Necdin. Cinco Affymetrix probesets correspondientes a NDN se clasifican en la lista de las 12 principales probesets reprimidos más significativo (Tabla 2), lo que sugiere que Necdin se reprime de manera significativa cuando STAT3 es constitutivamente activa. Esto demuestra que el análisis computacional de los datos de microarrays se puede utilizar para identificar los posibles genes diana STAT3 para una mayor investigación.

Pathway Analysis revela funciones conocidas y nuevas de STAT3

Las micromatrices evaluar los cambios simultáneos en los niveles de transcripción en de forma individual, lo que resulta en una larga lista de genes que han cambiado de manera significativa los niveles de transcripción en comparación con las células control. Sin embargo, estos cambios en la expresión génica no se producen eventos independientes dentro de la célula, pero se controlan de manera coordinada y, a menudo están interconectados. Pathway Analysis es un método imparcial para determinar si los genes expresados ​​diferencialmente, y las proteínas que codifican, se enriquecen en vías particulares, dando una idea sobre el significado biológico de los cambios observados.

sometió la lista de genes expresados ​​diferencialmente en común entre el v-Src y STAT3-C células al MetaCore ™ Analysis suite (GeneGo) que expresan y los compararon con las vías biológicas conocidas en la base de datos metabase ™. El uso de este análisis hemos sido capaces de identificar las vías STAT3 conocidos, incluyendo la vía JAK /STAT y la vía /STAT angiotensina. Esto proporciona soporte para el uso de este tipo de análisis para identificar nuevas vías que también pueden ser regulados por STAT3
.
La adhesión celular y la remodelación del citoesqueleto se encontraban entre las vías más significativamente enriquecido identificados a partir de los genes expresados ​​diferencialmente (Tabla 3). El papel de STAT3 en la remodelación del citoesqueleto ha sido reportado anteriormente [46]. Análisis funcional de los genes que hemos identificado en los procesos de remodelación del citoesqueleto, indica que STAT3 regula genes implicados en la fosforilación de proteínas, de señalización (vías MAPKK y Ras), así como la respuesta a la hipoxia y la migración celular.

examinado también los genes regulados por STAT3 en la adhesión celular y demostraron que las proteínas implicadas en la adhesión célula-matriz y la adhesión célula-célula, la formación de adherencias en particular focal, se enriquecieron en particular cuando STAT3 es constitutivamente activa, así como varios genes en la adhesión celular integrina camino. Como tal, se muestra que el análisis computacional de los datos de microarrays puede identificar tanto las vías conocidas y novedosas regulados por STAT3.

Funciones de genes inducidos

Para determinar la clasificación funcional de los genes expresados ​​diferencialmente identificados por SAM, se realizó la anotación funcional utilizando la herramienta en la base de datos DAVID Bioinformática (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) [47], [48]. Una amplia gama de genes diana se altera por la activación de STAT3, incluyendo genes implicados en múltiples vías que regulan los procesos biológicos y celulares, de localización de proteínas y de transporte, así como el desarrollo de órganos y el sistema (Tabla 4). Los genes dentro de estas categorías (Tabla S3. Columna 'Affymetrix probeset IDs' se expande a la lista de todos los ID de probeset) incluyen muchos implicados en el crecimiento celular y el mantenimiento, tales como lípidos, nucleótidos y la síntesis de proteínas, el metabolismo y /o localización (incluyendo VLDLR, APOL6, AK5, MTAP, UPP1, POP5, NUPL1, SEC61B, VDP), así como la transducción de señales, todos los cuales son necesarios para promover el crecimiento y la proliferación celular.

STAT3 tiene un papel bien caracterizado en la regulación génica la transcripción, sin embargo, también mostrar a través de análisis funcional, que STAT3 controla la expresión de genes implicados en procesos celulares necesarios para el transporte de las proteínas y regular su localización subcelular. Esto apoya nuestra hipótesis de que STAT3 coordina múltiples vías dentro de la célula y revela que STAT3 ha efectos de amplio alcance, el control de múltiples vías celulares implicados en los procesos biológicos fundamentales. Nuestros resultados sugieren que STAT3 orquesta transcripción, traducción, transporte y localización que lleva a efectos amplio alcance sobre el crecimiento celular, la proliferación y la supervivencia.

A diferencia de los estudios previos de los genes diana STAT3, hemos demostrado que STAT3 regula una serie diversa de genes, tanto en una manera positiva y negativa. La mayoría de los genes regulados por STAT3 que han sido identificados hasta la fecha muestran una mayor expresión en células en las que se activa STAT3. Sin embargo, nuestros resultados también muestran que la señalización STAT3 causa la represión de muchos genes, incluyendo Necdin, que podría afectar profundamente a la biología de las células que albergan STAT3 constitutivamente activa.

activado constitutivamente expresión STAT3 Bloques Necdin mRNA

a continuación, establecemos a cabo para verificar el análisis computacional y confirmar si Necdin es, de hecho, un gen diana STAT3. NDN, el gen que codifica Necdin, un regulador negativo de crecimiento [31] y miembro de la familia MAGE de antígenos tumorales asociados al melanoma, fue identificado como el gen STAT3 reguladas un candidato. Cinco Affymetrix probesets correspondientes a NDN se clasifican en la lista de las 12 principales probesets reprimidos más significativo (Tabla 2). Cuando se compara con las células normales de control, el análisis de los datos de microarrays demostrado que la expresión NDN fue reprimida constantemente en las líneas celulares que expresan v-Src o STAT3-C, lo que indica que NDN es un gen STAT3 reguladas candidato en estas dos líneas celulares (Fig . 1A). La Figura 1B. confirma que la expresión de ARNm NDN es dramáticamente reducido regulado en el v-Src y STAT3-C células que expresan según lo medido por cuantitativos PCR en tiempo real.

A. Análisis de microarrays de los niveles de expresión de ARNm Necdin. Se aisló el ARN de las células Balb /c-3T3 que expresan establemente o bien pMvSrc o PRC-STAT3-C, se procesa y se hibridó a Affymetrix genoma del ratón 430 2.0 GeneChips. Con el fin de controlar la variación biológica y experimental, para cada línea celular, las células fueron cosechadas a partir de tres pasos consecutivos. En cada paso, cinco placas de 10 cm de células de crecimiento exponencial se agruparon para la extracción de ARN y el ARN se hibridaron con una sola GeneChip Affymetrix genoma del ratón 430 2.0. Los arreglos fueron digitalizadas y la fluorescencia se midió con un escáner Affymetrix GeneChip 3000 GeneArray y la imagen procesados ​​mediante el Software Operativo GeneChip (SMOC) versión 1.1 para producir CEL archivos que contienen datos de la sonda de nivel para cada GeneChip. Todos los experimentos de microarrays se realizaron por triplicado experimentos independientes, y se presentan los resultados para cada sonda establecido como media veces el cambio en la expresión del ARN. Se presentan los datos para dos probesets diferentes. La intensidad de señal de las células Balb /c-3T3 parentales se fijó a 100%. B. En tiempo real el análisis de PCR. RNA de muestras utilizadas para el análisis de microarrays se realizaron mediciones de la expresión de ARNm Necdin usando PCR en tiempo real con cebadores específicos del gen y la sonda marcada por fluorescencia (TaqMan Gene Expression ensayos, Applied Biosystems). la expresión del ARN se normalizó a 18S rRNA. n = 3 experimentos independientes. C. Western. las células NIH3T3 que expresan de forma estable v-Src se sembraron (2,5 × 10
5) en placas de 6 cm de cultivo de tejidos en medio completo 24 h antes de la transfección. Las células fueron transfectadas con cualquiera de 125 nM de control de siRNA o 100 nM o 125 nM STAT3 siRNA. A las 48 h después de la transfección, se recogió la proteína total y cantidades iguales de proteína total (100 ug) se cargaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 10%, a electroforesis y inmunotransferencia para Necdin (policlonal, Abcam ab18554), STAT3 fosforilados (p-STAT3, señalización celular 9131), STAT3 totales (Santa Cruz, sc-482) y anti-actina (monoclonales, proteínas Sigma A-4551).

represión de Necdin mRNA expresión es dependiente de STAT3

células NIH-3T3 que expresan de manera estable v-Src expresan altos niveles de STAT3 activo. Estas células v-Src 3T3 se trataron con control de siRNA o dos dosis diferentes de siRNA-STAT3 específico. Las células tratadas con el control de siRNA mantener altos niveles de STAT3 y tienen niveles bajos de expresión Necdin (Fig. 1C, carril 1). Como era de esperar, STAT3 siRNA expresión inhibe eficazmente de STAT3 total (Fig. 1C, carriles 2 y 3). En estas células la expresión de la proteína STAT3 se inhibió de una manera dependiente de la dosis, y la expresión Necdin se restauró de una manera consistente con caída STAT3 en esta línea celular. Estos resultados sugieren que la represión de Necdin depende de STAT3 activada.

STAT3 activada se une al promotor Necdin
in vitro

Para determinar si STAT3 regula directamente la transcripción Necdin, nos analizado la secuencia de la NDN promotor de ratón [32] para los posibles sitios de unión de STAT3. sitios consenso STAT3 se han definido como secuencias palindrómicas con la secuencia común 5'-TT (N
4-6) AA-3 '[49]. Nuestro análisis identificó varios sitios a lo largo candidato STAT3 los pares de bases 1500 de unión aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción. sondas de doble hebra de oligonucleótidos fueron generadas para todos los posibles sitios de unión y se ensayaron en un concurso EMSA (Fig. 2A) por su capacidad para competir por la unión de STAT3 en contra de una variante de alta afinidad del sitio de unión de STAT3 en el c-
fos
promotor (HSIE) [50]. El oligonucleótido que contiene el sitio de unión putativo en la posición -558 con respecto al sitio de iniciación de la transcripción se identificó como ser capaz de competir con mayor eficacia con la sonda HSIE (Fig. 2A, carril 9). Además, hemos probado la capacidad de cantidades crecientes de no radiactivo NDN /-558 oligonucleótido para competir con la sonda HSIE radiomarcado por la unión de STAT3 activada. Como se muestra en la Figura 2B, un gran exceso molar de NDN sin etiqueta /-558 es capaz de competir con
32P-HSIE de STAT3 vinculante.

A. La competencia EMSA. Los oligonucleótidos para las hebras sentido y antisentido de todos los sitios de unión de STAT3-putativos en el promotor Necdin se hibridaron y se usaron para competir por STAT3 unión con el oligonucleótido HSIE
marcado con 32P usando 5 ug de extracto nuclear de células Balb /c-3T3 estable transfectadas con v-Src como fuente de STAT3 activada. Un sitio de unión a ADN STAT3 candidato en el promotor de ratón se identificó Necdin (posición -558, con relación al sitio de iniciación de la traducción). La alta afinidad de unión a oligonucleótido STAT3, HSIE se utilizó como control positivo. * "Supershifting" se logró utilizando anticuerpos anti-STAT3 añadió a la reacción para confirmar la presencia de STAT3 en el complejo. B. Competencia EMSA. 3T3 v-Src extracto nuclear se incubó con cualquiera de
32P marcado con doble cadena de oligonucleótidos HSIE (carriles 1 y 2) o con, de tipo salvaje no marcada NDN /-558 oligonucleótido en un 10 a 10
3 veces exceso molar (carriles 3-5) antes de añadir oligonucleótido HSIE
32 P-etiquetados, para competir con HSIE para la unión de STAT3. SS, supershift con anticuerpos anti-STAT3. C. EMSA. extracto nuclear 3T3 v-Src se incubó con los siguientes oligonucleótidos de doble cadena
32P marcados con: HSIE (carriles 1 y 2), NDN /-558 (carriles 3 y 4), con y sin anticuerpos anti-STAT3. ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina D. (CHIP). Se utilizaron células Balb /3T3 que expresan v-Src STAT3 constitutivamente activa para el chip. En pocas palabras, después de la reticulación histonas al ADN por formaldehído durante 10 min, se recogieron las células y se sonicaron para cizallar el ADN para una longitud media de 200 a 1.000 pares de bases. Una parte de este material se usó como control positivo para PCR (de entrada). La muestra restante se incubaron con anticuerpos anti-STAT3 durante la noche y luego inmunoprecipitadas usando proteína A-agarosa anti-IgG o. El complejo de histona-DNA fue inversa reticulado después de varios pasos de lavado, y las muestras se sometieron a PCR usando cebadores específicos que rodean el sitio de unión a STAT3 candidato en la posición -558 en el promotor NDN.

A a continuación se utilizó el doble de oligonucleótidos de ADN de cadena
32P-radiomarcado correspondiente a la /-558 secuencia de NDN identificado en el promotor NDN en un EMSA para detectar el ADN vinculante STAT3. La sonda NDN, así como la sonda de control positivo, Hsie, se incubaron con 5 ug de extracto nuclear de las células v-Src 3T3 y se sometieron a electroforesis en gel nativo. Como se muestra en la Figura 2C, STAT3 activado se une a la secuencia de alta afinidad en el oligonucleótido HSIE (carril 1), así como a la secuencia derivada del promotor NDN (carril 3). Para confirmar que STAT3 está contenido en el complejo de proteína de unión a los oligonucleótidos, el extracto nuclear se pre-incubaron con anticuerpos anti-STAT3 antes de añadir la sonda radiomarcada (bandas "supershifted", carriles 2 y 4). NDN /-558 muestra una débil actividad de unión a ADN STAT3 en comparación con el artificial de alta afinidad STAT3 elemento de unión a HSIE y la adición de anti-STAT3 anticuerpos bloquea parcialmente la unión de la sonda radioactiva. Esto podría resultar si el sitio de reconocimiento de anticuerpos y ADN dominio de unión de STAT3 se encontraban en las proximidades, haciendo que el anticuerpo para obstruir parcialmente la unión de STAT3 a la sonda.

La unión de STAT3 a la NDN Promotor
in vivo

para determinar si STAT3 podría obligar a la promotora Necdin en células intactas, se realizaron ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (cHIP) en células 3T3 v-Src utilizando un anticuerpo específico de STAT3. Como se muestra en la Figura 2D, PCR produjo Necdin ADN promotor se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-STAT3 en la región del sitio de unión putativo STAT3--558, pero no en un lugar de control sobre el promotor NDN. La especificidad de esta interacción de unión se demuestra por la falta de señal generada cuando un anticuerpo de control se utiliza (IgG anti-conejo). Estos datos proporcionan evidencia de que STAT3 puede unirse directamente al promotor Necdin en células 3T3 v-Src intactas.

Dado que tanto los ensayos de EMSA y el chip sugieren que STAT3 tiene la capacidad de unirse al promotor NDN tanto
In Opiniones y vitro
in vivo
, esta es una prueba más de que el control de la expresión NDN por STAT3 se produce a través de un evento de unión directa en el promotor y que la regulación de genes se produce principalmente a nivel de la transcripción.

Expresión Necdin es reprimido en células de melanoma humano

a continuación examinó si la baja regulación de Necdin se produjo en células tumorales humanas con STAT3 activada. La expresión de Necdin se ha demostrado previamente para ser reprimidos en las células de melanoma [51] por lo que hemos examinado si esto tenía una correlación con la actividad STAT3.

fosforilación de STAT3, STAT3 ADN vinculante actividad y los niveles totales de STAT3 se ha demostrado que aumento de las células A375 de melanoma de una manera dependiente de la densidad en ausencia de ligando [52]. células A375 se sembraron a aumentar la densidad y se dejaron crecer durante 72 h. Los extractos nucleares se prepararon y se analizaron por EMSA. La Figura 3A muestra que el ADN de unión de STAT3 aumenta con la densidad celular como se esperaba. A continuación, analizó la proteína total mediante Western blot para la expresión Necdin. Figura 3B muestra que la expresión de STAT3 total y la fosforilación de STAT3 está regulado de una manera dependiente de la densidad. Por el contrario, a medida que aumenta la activación de STAT3, la expresión Necdin es el regulado a nivel de proteínas

Las células A375 se sembraron a diferentes densidades (Fig 3A y 3B:.. 1, 2.5, 5 o 7,5 × 10
5 células; la figura 3C:. 10
5 y 10
6 células) en placas de 10 cm y se cultivaron durante 72 h. Se recogieron los extractos nucleares y proteínas totales. A. EMSA. extractos nucleares de las células A375 se incubaron con STAT3 específico HSIE
32 P-etiquetados oligonucleótido de doble cadena. B. blot occidental. extractos de proteínas totales fueron cosechadas a partir de células A375 chapados en diferentes densidades y cantidades iguales de proteína total (100 ug) se cargaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 10%, a electroforesis y se inmunotransfirieron para Necdin, STAT3 fosforilados (p-STAT3) y proteínas totales STAT3 . C. blot occidental. células A375 se sembraron a dos densidades diferentes (10
5 y 10
6 células) y se dejaron adherir durante la noche. Las placas sembradas a 10
6 células se trataron después con DMSO o CPA-7 (20 umol /L) y todas las células se cultivaron durante otras 48 h. La proteína total se cosechó y se analizó por transferencia Western. Por densitometría, las imágenes fueron escaneadas digitalmente y la densidad óptica de las bandas se cuantificaron utilizando Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD) y se normalizaron para controlar. La relación de pSTAT3 de STAT3 total se calcula para carriles individuales.

Para confirmar que la represión de la expresión Necdin es STAT3-dependiente, se sembraron células A375 a alta densidad, y se dejaron adherir durante la noche antes de ser tratados con DMSO o la STAT3-inhibidor CPA-7 (20 umol /L) durante 24 h [53]. El análisis de transferencia Western muestra que cuando las células A375 se sembraron en placas a baja densidad (10
5 células), la expresión Necdin es alta, mientras que los niveles de STAT3 activados son bajos (Fig. 3C, carril 1). Células sembradas a una densidad elevada (10
6 células), (Fig. 3C, carril 3) muestran mayores niveles de p-STAT3 y la disminución de la expresión de Necdin. El tratamiento de células A375 de alta densidad con CPA-7 para 24 h inhibe la activación de STAT3 (Fig. 3C, carril 2), y los niveles de Necdin en estas células se restauran a niveles altos, comparables a células cultivadas en placas a baja densidad.

IL-6 reprime la expresión Necdin en células de cáncer de próstata humano

IL-6 actúa como un factor de crecimiento autocrino en el cáncer de próstata [54] y se ha relacionado con la progresión de los tumores [55]. IL-6 señales se transmiten a través de la vía JAK-STAT de los receptores en la superficie celular de los genes diana en el núcleo, que implica la fosforilación y la activación de STAT3 [56]. por lo tanto, se examinó si la activación de STAT3 a través de IL-6 dio lugar a la estimulación represión de la expresión Necdin en las líneas celulares de cáncer de próstata DU145 y PC3. Estas líneas celulares albergan los bajos niveles de STAT3 constitutivamente activa [57], [58], que puede ser inducida aún más por la estimulación con IL-6. Las células fueron suero de hambre durante 3 h antes del tratamiento con IL-6 (10 nmol /L) durante 12 o 24 h. La proteína total se preparó y se analizó por transferencia Western. La Figura 4A muestra que la IL-6 dio lugar a la estimulación aumento de la actividad STAT3 dentro de las células y demostró correspondiente baja regulación de la expresión Necdin a IL-6 de la estimulación, en ambas líneas celulares. Esto confirma que la IL-6 es capaz de reprimir la expresión Necdin a través de STAT3 en células de cáncer de próstata.

A. Western blot. La proteína total a partir de células DU145 y PC3 tratadas con IL-6 (10 nmol /L) durante 12 o 24 horas se analizó por transferencia Western. proteína B. total se extrae de las células MCF-7 MDA-MB-468, MDA-MB-231 y y se sometió a análisis de transferencia Western. C. MCF-7 células se sembraron y se dejaron adherir durante la noche antes de ser transfectadas transitoriamente con control (GFP), pMvSrc o pRc /CMV-STAT3-C plásmidos usando Lipofectamine PLUS. La proteína total se recogió a las 48 h post-transfección y se sometió a análisis de transferencia Western. Para densitometría, las imágenes fueron escaneadas digitalmente y la densidad óptica de las bandas se cuantificaron utilizando Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD) y se normalizaron para controlar.

Necdin expresión se correlaciona con STAT3 actividad en el cáncer de mama humano Las células

Desde EGFR y Src vías de señalización contribuyen a la activación de STAT3 en los cánceres de mama [15], [34], se evaluaron los niveles de expresión Necdin en líneas celulares de cáncer de mama humanas con diferentes niveles de actividad STAT3 endógeno. La Figura 4B muestra que los niveles de proteína p-STAT3 fueron altas en MDA-MB-468 células, ligeramente inferior en MDA-MB-231 y muy bajos en células MCF-7. expresión de la proteína Necdin inversamente correlacionada con los niveles de p-STAT3, que se expresa en un nivel bajo en MDA-MB-468 y 231 células MDA-MB-, pero exhibió mucho más alta expresión en células MCF-7.

Para probar la hipótesis de que constitutivamente activado STAT3 tiene un papel causal en la supresión de la expresión Necdin en las células tumorales, se examinó si la activación transitoria de la señalización STAT3 puede regular a la baja la expresión Necdin. células MCF7 expresan altos niveles de Necdin (Fig 4C, carriles 1 & amp;. 4), sin embargo cuando se transfectaron transitoriamente con v-Src o STAT3-C durante 48 h, la expresión de proteínas Necdin se inhibe. Esto demuestra que incluso un aumento de 2 veces en la activación de STAT3 transitoria en estas células es suficiente para reprimir eficazmente la expresión de Necdin. (Fig 4C, carril 3 & amp;. 6)

Discusión

el perfil transcripcional de una célula que expresa STAT3 constitutivamente activa se prevé que sea muy diferente en comparación a una celda donde STAT3 está bajo una regulación estricta. Nuestra hipótesis inicial era que STAT3 promueve cambios generalizados en los patrones de expresión génica global, incluyendo objetivos tanto directos como indirectos. Tomamos un enfoque amplio mediante el estudio de los cambios globales de expresión génica utilizando el análisis de microarrays en células que expresan STAT3 activada constitutivamente.