Extracto
Neuropilins, inicialmente caracterizados como receptores neuronales, actúan como co-receptores para factores de crecimiento relacionados con el cáncer y recientemente han participado en varias vías de señalización que conducen a la organización del citoesqueleto, la angiogénesis y la progresión del cáncer. A continuación, hemos tratado de investigar la capacidad de neuropilina 2 para orquestar la transición epitelio-mesenquimal de las células del cáncer colorrectal. El uso de siRNA específico para dirigir la expresión neuropilina-2, o la transferencia de genes, que primero observamos que la neuropilina-2 expresión dota HT29 y Colo320 para la formación de xenoinjerto. Por otra parte, neuropilina 2 confirió una forma fibroblástica similar a las células cancerosas, lo que sugiere una implicación de neuropilina 2 en la transición epitelio-mesenquimal. De hecho, la presencia de neuropilina-2 en líneas celulares de carcinoma colorrectal se correlaciona con la pérdida de marcadores epiteliales, tales como la citoqueratina-20 y E-cadherina y con la adquisición de moléculas mesenquimales como la vimentina. Además, hemos demostrado por los experimentos de resonancia de plasmón de superficie que la neuropilina-2 es un receptor para-factor de crecimiento transformante-β1. La expresión de la neuropilina-2 en líneas celulares de cáncer de colon fue en efecto se muestra para promover el crecimiento de la transformación de la señalización del factor-β1, que conduce a una fosforilación constitutiva de la /3 complejo Smad2. El tratamiento con inhibidores de la quinasa del receptor de TGF-tipo1 específicos restauró los niveles de E-cadherina y inhibido en la expresión de vimentina parte inducida por neuropilina-2, lo que sugiere que coopera NEUROPILINA-2 con receptor de TGF-tipo1 para promover la transición epitelio-mesenquimal de las células del cáncer colorrectal. Nuestros resultados sugieren un papel directo de NRP2 en la transición epitelio-mesenquimal y resaltar una diafonía entre neuropilina-2 y la señalización de TGF-β1 promover la progresión del cáncer. Estos resultados sugieren que la neuropilina-2 cumple con todos los criterios de una diana terapéutica para interrumpir varias funciones oncogénicas en tumores sólidos
Visto:. De Grandclement C, Pallandre JR, Valmary Degano S, E Viel, Bouard A, J Balland , et al. (2011) Neuropilina-2 expresión de TGF-β1 promueve mediada por epitelial a mesenquimal transición en células de cáncer colorrectal. PLoS ONE 6 (7): e20444. doi: 10.1371 /journal.pone.0020444
Editor: Cuelgue Thi Thu Nguyen, Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Noviembre 2010; Aceptado: 3 Mayo 2011; Publicado: 1 de julio 2011
Derechos de Autor © 2011 de Grandclement et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. API de Grant -chū 2008 del hospital Universitario de Besançon; CG recibió una beca de la francesa "nationale Agencia para la investigación tecnológica"; JRP recibió una beca del consejo regional de Franco Condado; una subvención de la "Ligue contre le cancer du Doubs" apoya este trabajo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Neuropilins (PNR) son glicoproteínas quinasa de tirosina no transmembrana descritos originalmente en el sistema nervioso. Neuropilina (PNR) de la familia consta de dos genes, neuropilina 1 (NRP1) y neuropilina 2 (NRP2). Durante el desarrollo del sistema nervioso, NRP1 y NRP2 juegan un papel crítico en la retracción del axón y orientación por clase de unión III semaforinas [1]. Inicialmente caracterizado como receptores neuronales, también se encontraron PNR que se expresa en las células endoteliales y, posteriormente, se demostrado que desempeñan un papel en el desarrollo del sistema vascular [2].
PNR mostrar una cola intracitoplasmática corto que no hace contener un dominio de quinasa. Las investigaciones iniciales de las vías moleculares NEUROPILINA dependiente sugirieron que neuropilins no pueden transmitir directamente las señales intracelulares. Esto dio lugar a la propuesta de que se requieren hetero-dimerización con otros receptores para mediar en la señalización neuropilina aguas abajo. Uno de estos complejos de co-receptores descritos hasta ahora implica el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) [3], [4], [5]. Además de la amplificación de la señalización de VEGFR, PNR puede interactuar con plexins para mediar clase 3 semaforina la transducción de señales a través de proteínas G relacionados con Rho, la modulación de la organización del citoesqueleto [6].
Sin embargo, una secuencia de aminoácidos altamente conservada promover PNR cola intracelular unión al dominio PDZ de GAIP C-terminal interacción proteína-1 (GIPC-1) se informó recientemente que sugiere la posibilidad de que el PNR puede regular las funciones biológicas alternativas [7].
las múltiples funciones de PNR eran destacado recientemente por la identificación de papel PNR en la oncogénesis. Además de la presencia de los PNR en los vasos asociados al tumor, PNR se expresaron por una gran variedad de tumores, lo que sugiere un papel potencial de esta glicoproteína en la progresión del cáncer. De hecho, la expresión NRP2 fue encontrado en el osteosarcoma [8], el melanoma [9], el cáncer de pulmón [10], [11], tumores cerebrales [12], [13] cánceres de colon [14], el cáncer de páncreas [15], [16 ], [17], los cánceres de mama [18], leucemia mieloide [19], el carcinoma adenoide quístico salivales [20], hemangioma infantil [21], los tumores de ovario [22] y los cánceres de vejiga [23]. En el carcinoma de colon, NRP2 promueve directamente la progresión del tumor de una manera autónoma celular (ver revisión de expresión NRP2 en las células cancerosas en el cuadro S1). Se sugirió que NRP2 propiedades oncogénicas se basan en un aumento de la fosforilación VEGFR1 y una activación de la señalización de VEGFR1 /PI3K /Akt. [14] Sin embargo, las vías moleculares precisas impulsados por NRP2 y que participan en la oncogénesis siguen siendo en gran medida desconocido.
epitelial-mesenquimal transición (EMT) es uno de los mecanismos moleculares principales llevadas a cabo durante la oncogénesis para promover la progresión del cáncer. EMT se caracteriza por un deterioro del uniones de las células, la pérdida de las características epiteliales y la polaridad celular, lo que contribuye a la progresión del carcinoma. Además de la ganancia de marcadores mesenquimales, EMT dota de células de cáncer para la migración, invasión y la subsiguiente formación de metástasis [24]. Despites varios estudios relacionados con el papel de NRP2 en la progresión del cáncer, hay evidencia sustancial estableció una implicación de esta vía molecular en EMT.
Aquí, hemos utilizado líneas celulares de cáncer de colon transfectadas con NRP2 transgén o siRNA para investigar la implicación NRP2 en la EMT. Estos experimentos proporcionaron pruebas de que NRP2 dota líneas celulares de cáncer de colon para la formación de colonias y xenoinjerto. Por otra parte, una conversión de epitelial de forma similar a fibroblastos fue provocada por la expresión NRP2, así como la adquisición de vimentina y de EMT factores de transcripción específicos. A continuación, se analizó la influencia de NRP2 en la transformación del factor de crecimiento β1 (TGF-beta 1) de señalización que se cree que contribuye a la carcinoma en etapa tardía mediante la inducción de la EMT. Demostramos que NRP2 promueve una fosforilación constitutiva Smad2 /3 en líneas celulares de cáncer de colon. Por otra parte, siRNA dirigido NRP2 o el tratamiento con inhibidores farmacológicos de TGF-1 receptor de tipo 1 (TGFβRI) impidió Smad2 fosforilación 3 /y la EMT mediada por NRP2 de células de cáncer colorrectal. En conjunto, estos resultados sugieren que NRP2 coopera con TGFβRI para promover la EMT en el carcinoma colorrectal.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
líneas celulares humanas HT29, Colo320, SW620, MCF7 , Caki, A498, HEK293 fueron adquiridos de la American Type Cell Culture Collection y se cultivaron en RPMI1640 o DMEM (Lonza, Paris, Francia) suplementado con libre de suero de ternera fetal 10% de calor endotoxina inactivado (FCS), (Invitrogen, Cergy-Pontoise , Francia). Bes-PAC01, PAC03-bes, Bes-PAC04 y PAC05 Bes-líneas celulares (adenocarcinoma pancreático) fueron originalmente aisladas de los fluidos ascíticos derivados de cuatro pacientes con adenocarcinomas de páncreas, en nuestro hospital universitario. R3III línea celular fue proporcionado amablemente por Nathalie Labarrière, Inserm (Nantes, Francia). líneas celulares Jijoye y Raji (linfoma de Burkitt humano) fueron proporcionados por Diaclone (Besançon, Francia). Las líneas celulares utilizadas en este estudio fueron autentificados mediante el análisis de ADN (breve análisis de repeticiones en tándem), en línea con las recomendaciones de la ATCC (ver Tabla 1). análisis de repeticiones cortas en tándem (STR) es un método de biología molecular recomendado para identificación de la línea celular. Las líneas celulares utilizadas en este estudio fueron genotipados antes de la congelación y cada dos meses. análisis de STR se realizó con el Kit AmpFISTR Identifiler Amplificación por PCR (Applied Biosystems). Se analizaron Altura loci específicos incluyendo repeticiones en tándem en el ADN de las líneas celulares de cáncer. STR análisis mide el número exacto de unidades que se repiten para cada alelo (D7S820 8,20 significa que 8 y 20 repeticiones son identificadas en cada alelo del locus D7S820 para la línea celular Jijoye). Si aparece una variante que contiene una repetición parcial, esa unidad de repetición parcial se determina mediante un decimal seguido por el número de bases en la repetición parcial.
Los plásmidos de expresión pcDNA
La influencia de NRP2 en la progresión de células de cáncer de colon se evaluó mediante la transferencia de genes NRP2 en la línea celular HT29. Hemos generado HT29
líneas celulares NRP2 utilizando dos plásmidos de expresión que codifican hNRP2 (pcDNA3.1-NRP2, proporcionado amablemente por M. Klagsbrun) y pCMV6-XL5-NRP2 (adquirido de Origene (Rockville, MD, EE.UU.). Control de las células HT29 se generaron utilizando vectores pcDNA3.1 o pCMV6-XL5. 1,5 × 10
6 HT29 células fueron sembradas en un 60 mm
3 frasco en 4 ml de medio y se incubaron durante 24 h. a continuación, las células fueron transfectadas de forma estable con 1 g de pcDNA3.1-NRP2 o pCMV6-XL5-NRP2 vectores de expresión o vectores de control utilizando el kit Effectene (Qiagen, Courtaboeuf, Francia) según las instrucciones del fabricante. las células transfectadas con los vectores pcDNA3.1 se seleccionaron con 0,8 mg /ml de geneticina (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Francia), 48 h después de la transfección.
pequeños ARN de interferencia
Uso de la herramienta de diseño web Ambion ARNsi, se identificó un potencial secuencia diana específica NRP2. NRP2 específica siRNA (sentido 5'-GGC AAA AAG TGG TCA ACG CTA ATT T-3 'y antisentido 5'-AAA AAT TAG TGC TGA CTT CCA TCG T-3') y scramble siRNA (sentido 5'-AAAGGAGGGGCATGCCACGTTGG- '5' AAAACCAACGTGGCATGCCCCTC-3 y anti-sentido 'secuencias 3) se hibridaron y clonaron en el sitio Bbs de la LTR 3' de pFIV-H1 vector /U6 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Sistema Biosciences, Mountain View, CA). Las secuencias se confirmaron mediante análisis BLAST NIH para no tienen una homología sustancial con las secuencias de otros genes de vertebrados. la producción sobrenadante lentiviral y la posterior infección de las células se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Sistema Biosciences, Mountain View, CA). Colo320 transfectadas de forma estable se seleccionaron con 3 mg /ml de puromicina (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Francia), 48 h después de la transfección.
La citometría de flujo
Anti-NRP2, anti-NRP1, anti-pSmad2 /3, anti-TGFß1, anti-TGFβR1 eran de Santa-Cruz Biotechnology (Heidelberg, Alemania). Anti-Smad2 /3 y anti-TGFRII, eran del sistema de RD (Lille, Francia). anticuerpos secundarios marcados con Alexafluor488 se adquirieron de Fluoprobes (Interchim, Montluçon, Francia). Se evaluaron diez mil células de cada muestra para la detección de fluorescencia utilizando BD FACSCanto citómetro. (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Francia) Para la tinción intracelular, las células se fijaron durante 20 min a 4 ° C en 2% de paraformaldehído. luego de tinción se realizó a temperatura ambiente durante 30 min en un tampón que contiene 0,4% de saponina y 5% de FCS. Tampón de lavado contenía 0,1% de saponina, 5% de FCS. Por citometría de flujo análisis, se calculó relativa intensidad de fluorescencia (RFI).
Ensayo de proliferación celular
La proliferación celular in vitro se analizó con la sal de tetrazolio 3- (4,5-dimetiltiazol-2- il) -2,5 difeniltetrazolio (MTT). Brevemente, 4000 células por pocillo fueron sembradas en 96 pocillos de micro-placas que contienen 100 l de medio por pocillo. Para el análisis, se añadieron 10 l de sustrato MTT (de un ml de una solución 5 mg /Stock en solución salina tamponada con fosfato) a cada pocillo, y las placas se dejan a las condiciones de incubación de tejidos estándares durante 2 horas adicionales. Las células se solubilizaron en 200 l de sulfóxido de dimetilo, y los análisis colorimétricos se realizaron (longitud de onda, 570 nm). Las placas se sometieron a ensayo cada 24 horas para los próximos 3 días consecutivos.
ELISA ensayo
Las células se incubaron en medio RPMI o DMEM-FCS al 1% durante 24 h. Entonces se contaron las células y 10000 células por pocillo fueron sembradas en 96-microplaca en 200 l DMEM-FCS al 0,1% durante 24 h. la producción de VEGF se evaluó en los sobrenadantes utilizando el kit de VEGF humano Elisa (Strathmann Biotec, Hamburgo, Alemania).
Análisis de citometría de flujo de ADN contenido
Las células se recogieron por tripsinización, se lavaron con PBS enfriado con hielo , se fijaron en 70% de etanol. Antes del análisis de ADN, las células se tiñeron con 50 mg /ml de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich, Lyon, Francia) y 2 mg /RNasa ml DNasa libre (Sigma-Aldrich, Lyon, Francia) durante 15 minutos a 37 ° C en la oscuridad. contenido de ADN se midió usando un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Francia) y se analizaron con el programa CellQuest.
experimentos de xenoinjerto
Los ratones desnudos se obtuvieron de Janvier (Le Genest St Isle, Francia), y se mantiene en nuestras instalaciones de animales de acuerdo con las directrices experimentales comité de ética animal. 1 × 10
6 células de HT29
ctrl, HT29
NRP2, Colo320
subcutánea si-ARN-NRP2 y Colo320
líneas celulares siRNA-ctrl resuspendidas en 100 l de PBS se inocularon en ratones desnudos y el crecimiento del tumor se monitorizó dos veces por semana en cada grupo. El volumen del tumor se calculó mediante la fórmula
V
= 1/2
a
×
b
2, donde
a
es el tumor más larga eje, y
b
es el eje más corto del tumor. Cuando los tumores alcanzaron 1 cm de diámetro, los ratones fueron sacrificados y los tumores fueron fijados en formol para el análisis inmunohistoquímico posterior.
Colonia ensayo de formación de
efecto de la expresión NRP2 en la formación de colonias in vitro se evaluó mediante suave ensayo de colonias de formación de agar. 5000 células por pocillo fueron sembradas en 500 l de 2% de medio de agarosa en una placa de 24 pocillos. Las células fueron incubadas a 37 ° C, 5% de CO2 y las fotos fueron tomadas después de 10 días de cultivo.
ensayo de invasión
La invasión se evaluó utilizando 96W QCM Invasión de ensayo (Millipore, EE.UU.). En pocas palabras, el mismo número (100000) de las células control (HT29
ctrl) o células que expresan NRP2 (HT29
NRP2) se volvieron a suspender en medio libre de suero fueron colocados en el compartimento superior de un estándar de 8 M poro cámara de Boyden. pozos bandeja del alimentador contenían medio exento de suero o medio de 10% de FCS. Después de 16 horas la invasión (37 ° C, 5% CO2), las células invasoras se incubaron con tampón de desprendimiento de las células, se lisaron y marcados con el colorante CyQuant GR. (96W Ensayo QCM, Millipore, Internacional). a continuación, la fluorescencia se evaluó con un lector de placas de fluorescencia (Cell Lab Quanta, Beckman Coulter) usando un conjunto de filtros de 480-520 nm.
tratamientos con células
señalización de TGF-β1 se inhibió mediante SD- 208 o SB-431542 (TGFRI inhibidor de la quinasa) diluido en DMSO (Sigma-Aldrich, Lyon, Francia). DMSO sirve como medio de control en todos los experimentos. En algunos experimentos Avastin (Farmacia del CHU Jean Minjoz, Besançon, Francia) se utilizó para inhibir el VEGF-A. TGF-β1 se adquirió de Sistema de RD (Lille, Francia).
Western Blot análisis
En resumen, después de dos etapas de lavado, las células se recogieron y se solubilizaron en mM EDTA containing1 tampón de lisis, 1 mM NaF, 1 mM de vanadato y una completa de la tableta mini cóctel inhibidor de la proteasa (Complete Mini EDTA libre, por cada 10 ml de tampón de lisis, Roche, Francia). 30 g de lisados de células enteras se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida duodecyl de sodio y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno mediante electrotransferencia. Los blots fueron bloqueados durante 1 h en 5% de leche antes de la incubación con anticuerpos específicos como sigue: anti-NRP2 y anti-TWIST1 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania), anti-Smad2 /3 (amp I +; Sistema D, Lille, Francia), anti-vimentina, anti-Ecadherin, anti-TGFß1, anti-Smad2 /3, anti-pSmad2, anti-caracol (todos de Cell Signaling Technology, Danvers, EE.UU.). Todos los anticuerpos se diluyeron en solución salina Trisbuffered y 0,1% (v /v) de Tween-20 con adición de leche en polvo. las proteínas se transfirieron fueron detectados y cuantificados en un generador de imágenes de bioluminiscencia y software avanzado BIO-1D (Wilber-Lourmat, Marne-la-Vallée, Francia), después de la incubación de las transferencias con un rábano peroxidaseconjugated anticuerpo secundario apropiado (Beckman Coulter, París). Para algunos experimentos, el citoplasma y nucleares fracciones subcelulares se recogieron después de centrifugación diferencial en tampones adaptados; la presencia o ausencia de proteínas específicas subcelulares (por ejemplo, β-actina o la histona H1) atestiguan a la separación subcelular.
Co-inmunoprecipitación análisis
Las células se lisaron en PBS que contenía 200 mM de TRIS Hcl pH 7,4, mM NaCl 100, 1% v /v TritonX100 mM, DTT 1 mM, EGTA 15 mM, NaF 1, 1 mM de vanadato y una completa de la tableta de cóctel Mini inhibidor de proteasa (Complete Mini EDTA libre, por 10 ml de tampón de lisis , Roche, Francia). se añadieron conejo anti-TGFRI anticuerpos policlonales (Santa-Cruz Biotechnology) y IgG de conejo anticuerpos policlonales a los lisados a una dilución final de 1/100 y se incubaron durante la noche a 4 ° C. se añadieron perlas magnéticas de proteína-G (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Francia) a la mezcla y se incubaron durante dos horas adicionales a 4 ° C. Las proteínas se eluyeron a continuación por separación magnética y desnaturalizan. a continuación, Western-Blot se realizó utilizando anticuerpos contra NRP2 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania).
Análisis histopatológico y la tinción inmunohistoquímica de tejidos
Las muestras de tejido, obtenido a partir de xenoinjertos fueron fijadas en 4 % de formalina y embebidos en parafina. Entonces, los bloques se cortaron en serie en espesor de 4 micras. HES (hematoxilina eosina Safran) tinción se utilizó para evaluar la morfología. Una norma técnica de inmunohistoquímica se realizó utilizando un punto de referencia XT Ventana (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, Arizona) immunostainer con los siguientes anticuerpos primarios anti E-cadherina (Zymed, San Francisco, EE.UU.), anti-citoqueratina-20 ( Zymed, San Francisco, EE.UU.).
resonancia de plasmón superficial análisis
Diseño y fabricación de patatas fritas caseras compatibles con SPR (Surface Plasmon resonancia) se han realizado según lo publicado previamente con la ayuda de la MIMENTO plataforma tecnológica, Besançon, Francia [25]. Los chips NRP2 fabricados en este estudio consisten en el injerto covalente de entidades Fc-NRP2 en la auto ensamblado monocapa activado químicamente siguiendo el procedimiento de la construcción de chips de proteínas recientemente publicado [26]. Fc-NRP2 eran de RD Sistema (Lille, Francia). Este procedimiento conduce a una cobertura de 7,4 +/- 0,1 femtomol /mm
2 de NRP2. Las inyecciones de BSA (control -), VEGF (Control +) y TGFß1 se realizan a 250 nM en PBS-Tween 0,05%, pH 7,4. Biacore experimentos se realizaron con el aparato Biacore 2000 a 25 ° C con un caudal comprender entre 2 y 30 l /min.
Tiempo-cuantitativa real PCR (RT-qPCR)
El ARN total se extrajeron usando el kit RNeasy mini (Qiagen, Courtaboeuf, Francia) y la transcripción inversa usando hexámeros aleatorios y virus de la leucemia murina de Moloney la transcriptasa inversa (Life Technologies, Rockville, MD, EE.UU.). Las muestras duplicadas fueron sometidos a RT-qPCR. mRNA se cuantificaron utilizando cebadores se enumeran a continuación:. NRP2 (Hs00187290_m1), Snail1 (Hs001955991_m1), TGF-β1 (Hs00171257_m1), Gli1 (Hs00171790_m1), TWIST1 (Hs00361186_m1) (Applied Biosystems)
ABL mRNA de cada muestra se cuantificó como control endógeno de ARN interno. la expresión del ARNm relativa se calculó utilizando el método Delta-Delta-Ct y se utilizaron las células no tratadas como calibrador.
preparación de diapositivas y microscopía confocal
Las células se extendieron sobre portaobjetos de cámara Labteck (Sigma-Aldrich, Lyon, Francia) y se trató posteriormente con los reactivos apropiados. Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% y se permeabilizaron con 0,1% Triton X100. Después de 20 minutos de bloqueo en suero bovino fetal al 20% y lavado, las células se tiñeron con los anticuerpos apropiados Pilas de imágenes confocales se recogieron con un escaneo láser confocal Olympus FV1000 microscopio. Los núcleos celulares se contratiñeron con DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol). Para la cuantificación de la fluorescencia, la relación de intensidad de fluorescencia se calculó en cada condición. Relación de intensidad de fluorescencia se calculó en la división de la fluorescencia nuclear por la fluorescencia citoplasma a la membrana. La intensidad de fluorescencia de las células 50 se ha analizado en cada condición.
Smad ensayo indicador
Hemos utilizado el ensayo indicador de TGF-β de SABiosciences (Qiagen, Courtaboeuf, Francia) para la cuantificación de TGF -β-inducida de señalización SMAD2 /3. La cuantificación de la luciferasa de luciérnaga se realizó utilizando un sistema de ensayo de indicador Dual-Luciferase (Promega Co, Madison, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todas las transfecciones se realizaron por triplicado utilizando el kit de Lipofectamine. (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Francia). Después de 24 h de la transfección, el medio se cambió y las células se trataron por 50 ng /ml de TGF-β1 durante 24 horas adicionales. Los resultados se presentan como la relación entre el
luciferasa de luciérnaga y la actividad
Renilla luciferasa
actividad (Ren /Luc) para cada condición. Entonces, se informó de los valores a los valores de control negativo.
El análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media más o menos el error estándar de la media (SEM). Grupo comparaciones se realizaron mediante Estudiante
t
prueba. Las diferencias se consideraron significativas a
p
. & Lt; 0,05
Resultados
NRP2 expresión en líneas celulares de cáncer humano
En primer lugar, trataron de examinar la expresión de glicoproteína NRP2 en diversas líneas celulares de cáncer. El análisis de inmunofluorescencia confirmó que NRP2 se expresa en la membrana de varias líneas celulares de cáncer humano (Figura 1A). Las células humanas endoteliales de la vena umbilical (HUVEC), aislado de la vena umbilical humana normal, se utilizaron como control positivo para la expresión NRP2. Se observó expresión NRP2 en la membrana de 2 de 3 líneas celulares de cáncer de colon (SW620, Colo320, pero no HT29). NRP2 también se expresó en todas las líneas celulares de cáncer renal probados (HEK 293, Caki, R3III y A498), en dos de las cuatro líneas celulares de cáncer de páncreas (Bes-PAC03 y Bes-PAC04, derivado de líquido ascítico del paciente en nuestro instituto), en NCIH441 de pulmón línea celular de cáncer y en 5637 la línea celular de cáncer de vejiga (Figura 1A). línea de células de cáncer de mama MDAMB231 expresó NRP2 mientras que ninguna tinción NRP2 fue encontrado en células de linfoma de Burkitt líneas (Raji, Jijoye) (Figura 1A).
A, España citometría de flujo análisis de la expresión en NRP2 líneas celulares de cáncer humano.
B, tinción inmunohistoquímica de NRP2 en los tejidos de colon humano y los tejidos mamarios (marrón). parafina de tejidos fijados con formol se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con el anticuerpo anti-humano NRP2. Micrografías representativas fueron tomadas en un aumento del original x1000; NRP2 se expresa en la membrana de los carcinomas de colon y de mama humanos, mientras que no se expresa en los tejidos sanos.
Se realizaron entonces estudios de inmunohistoquímica para determinar si NRP2 se expresa en la membrana de varios parafina embebido humana espécimen de cáncer. NRP2 se expresó en 3 de 10 carcinoma de colon, carcinoma 5 de 15 de mama y 4 de 12 carcinoma de páncreas. De nota, NRP2 no se detectó en los cánceres de próstata (n = 10) y el linfoma de células B (n = 10) (datos no mostrados). Por otra parte, la tinción inmunohistoquímica mostró que NRP2 se expresa en la membrana de carcinoma de colon humano y el carcinoma de mama, mientras que no se expresa en los tejidos malignos no (Figura 1B). Nuestros resultados son concordantes con los informes publicados anteriores. De hecho, en un estudio reciente, Gray et al observó que NRP2 no era detectable en la mucosa colónica no maligno pero era evidente en 10 (83%) de 12 de adenocarcinoma de colon adyacente y en cinco (71%) de siete metástasis hepáticas por tinción IHC. Por otra parte, en otro estudio, la expresión NRP2 se encontró en 5 de 6 pacientes (83%) líneas de células pancreáticas de uso común [15] y en 7 de cada 11 (64%) especímenes quirúrgicos de adenocarcinoma pancreático por tinción IHC [14]. Por último, en el cáncer de mama, Yasuoka et al informaron de expresión NRP2 en 60 de los 113 carcinoma invasivo de mama (53,1%) [18]. A partir de estos diversos estudios, parece que NRP2 parece ser específica de varios tejidos tumorales, mientras que ninguna expresión de esta glicoproteína se observa comúnmente en los tejidos sanos, confirmando que NRP2 es una diana atractiva para las terapias innovadoras anti-tumorales (véase la Tabla S1 para revisión NRP2 de expresión en los cánceres).
para estudiar el papel preciso de NRP2 en la progresión del cáncer, decidimos generar líneas celulares de cáncer de colon que expresan o no NRP2, mediante la transferencia de genes o NRP2 NRP2 siRNA. Por lo tanto, NRP2 se transfectó en células HT29 y un siRNA se utilizó para derribar la expresión NRP2 en Colo320. La citometría de flujo se realizaron experimentos para confirmar la modulación de la expresión NRP2 en HT29 y Colo320 (Figura 2A). No se observó una modulación de la expresión NRP1 en HT29 o Colo320 células transfectadas. las células de cáncer renal Caki-1 se utilizaron como control positivo para la tinción NRP1. NRP2 presencia en HT29
ctrl, HT29
NRP2, Colo320
siRNA-ctrl, Colo320
siRNA-NRP2 estaba controlada por el Western Blot (Figura 2B)
.
Se analizaron las células transfectadas para NRP1 y NRP2 expresión mediante citometría de flujo (
Un
) o por el Western Blot (
B Opiniones). Por citometría de flujo análisis, se calculó intensidad de fluorescencia relativa (RFI). células Caki1 y HUVEC se utilizaron como control positivo para NRP1 y tinción NRP2 respectivamente.
C, España proliferación de las células HT29 y Colo320, según la expresión NRP2 se evaluó mediante ensayos de MTT. 4000 células se dejaron en cultivo durante 24, 48 o 72 horas antes del análisis. expresión NRP2 se asocia con un mayor proliferación en células de cáncer de colon. Los datos representan las medias de triplicados de más o menos el error estándar (SE) de un experimento representativo de tres realizados. (
**, P & lt; 0,01). D,
experimentos MTT similares se reproducen en la presencia de bevacizumab (0,25 y 1 mg /ml, 72 h). Se han usado HMEC-1 en las células endoteliales microvasculares como un control positivo para la bioactividad de bevacizumab. De hecho, el bevacizumab disminuye significativamente la proliferación HMEC-1, mientras que hay una disminución de la proliferación celular se observa con HT29
células cancerosas NRP2 y Colo320. La experiencia se realizó 3 veces, y en cada período por triplicado.
E,
análisis citométrico de flujo del contenido de ADN de las células de cáncer de colon transfectadas. expresión NRP2 está asociada con un número mayor de células en fase S. Los datos representan resultados de un experimento representativo de 3 expresaron como la media de ensayos por duplicado (*,
P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01, ** * P & lt;. 0.001)
NRP2 promueve la proliferación tumoral
Nos aprovechamos de las líneas celulares anteriores para estudiar el papel de NRP2 sobre la proliferación del cáncer y el crecimiento in vitro de tumores en vivo. La proliferación se vigila por medio de ensayos de MTT. HT29
NRP2 células mostraron una tasa de proliferación superiores a los 24, 48 y 72 h en comparación con HT29
ctrl (Figura 2C). Por el contrario, NRP2 desmontables utilizando siRNA, modula negativamente la proliferación de la línea celular tumoral Colo320 (Figura 2C). Estos experimentos mostraron que la expresión NRP2 aumenta la proliferación línea celular de cáncer de colon in vitro (la significatividad en cada punto de estos ensayos de MTT tiempo se indica en la Tabla S2). Para confirmar la influencia de NRP2 sobre la proliferación celular, hemos evaluado en dos experimentos adicionales a la duplicación de los tiempos de HT29
ctrl, HT29
NRP2, Colo320
siRNA-ctrl y Colo320
siRNA-NRP2 cáncer Células. las células que expresan NRP2 HT29
NRP2 y Colo320
siRNA-ctrl tenía un tiempo de duplicación de 8 y 11 horas, respectivamente, mientras que los tiempos de NRP2 que carecen de células duplicar HT29
ctrl y Colo320
siRNA-NRP2 eran 13 y 14 horas. Desde PNR son co-receptores de VEGF, que supervisó la producción de VEGF-A en HT29 y culturas Colo320 para Elisa. Estas células producen niveles bajos de VEGF-A. NRP2 expresión no influyó en la producción de VEGF (Figura S1). Por otra parte, el bevacizumab mAb neutralizante, se sabe que inhibe la proliferación de la línea celular endotelial microvascular HMEC-1 [27], se utilizó para abordar el papel potencial de VEGFA en el crecimiento de células tumorales mediada por NRP2. Estos experimentos mostraron que VEGFA neutralización no influyó HT29 mediada por NRP2 o proliferación Colo320. (Figura 2D)
Además, NRP2 es un receptor funcional para 3F semaforina, que fue descrito como un inhibidor de la angiogénesis, la progresión tumoral y la metástasis [28]. experimentos de transferencia Western mostraron que HT29
ctrl y HT29
NRP2 expresar el mismo nivel de 3F semaforina, mientras que no semaforina 3F se encuentra en las células Colo320, lo que sugiere que la proliferación del tumor mediada por NRP2 no implica 3F semaforina (Figura S2) . Entonces, la distribución del contenido de ADN nuclear fue estudiada por citometría de flujo en HT29
ctrl, HT29
NRP2, Colo320
Colo320
células de cáncer de siRNA-NRP2 siRNA-ctrl y. expresión NRP2 se asoció con un número mayor de células en fase S (Figura 2E). privación de suero en medio de cultivo indujo un aumento en la fracción de subG1 sólo en condiciones negativas NRP2 (datos no mostrados). En conjunto, estos resultados mostraron que la expresión NRP2 en el carcinoma colorrectal promueve la proliferación de células de cáncer y la supervivencia.
ablación NRP2 usando siRNA inhibe la formación de xenoinjerto
El papel preciso de NRP2 en la progresión del cáncer se caracterizó primero
in vivo
. Para examinar el efecto de la expresión NRP2 en
in vivo
el crecimiento del tumor, se inoculó un número igual (1,10
6 células por ratón) de HT29
NRP2 o HT29
ctrl por vía subcutánea en ratones desnudos. la incidencia de tumores y el volumen se evaluaron cada dos semanas. Los tumores aparecieron en todos los ratones inoculados con células HT29
ctrl y HT29
NRP2. NRP2 mejora de forma significativa el crecimiento del tumor in vivo (Figura 3A) en. Para confirmar estos resultados, decidimos investigar si la orientación NRP2 utilizando siRNA podría inhibir la formación de tumores. Mientras 1.10
6 Colo320
células siRNA-ctrl inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos inducida por el injerto de tumores en todos los ratones, la inhibición NRP2 utilizando siRNA impidió Colo320 injerto en todos los animales que sugiere un papel crítico de NRP2 en los primeros eventos que contribuyen a un tumor formación (Figura 3B) .La influencia de la inhibición NRP2 usando siRNA específico en Colo320 tumorigenicidad se confirmó
in vitro
. Para este propósito, las células Colo320 se trataron con NRP2 siRNA o ctrl siRNA y se cultivaron en un ensayo de agar blando. NRP2 caída en Colo320 disminuyó el número de colonias observadas en los experimentos de agar blando (Figura 3C). Desde HT29 no forma colonias en cultivos de agar blando, decidimos investigar la influencia de NRP2 sobre la invasión y la migración HT29.