Extracto
NRP-2 es un receptor de alta afinidad quinasa deficientes para ligandos que pertenecen a la clase 3 semaforina y las familias del factor de crecimiento endotelial vascular. NRP-2 se ha detectado en la superficie de varios tipos de células cancerosas humanas, pero su expresión y función en las células (GI) cáncer gastrointestinal queda por determinar. Hemos tratado de determinar la función de NRP-2 en la mediación de señales descendentes que regulan el crecimiento y la supervivencia de las células de cáncer gastrointestinal humano. En muestras de cáncer gástrico humano, se detectó la expresión de NRP-2 en los tejidos tumorales pero no en la mucosa normal adyacente. En 2,5 células CNDT, shRNA mediada desmontables NRP-2 expresión condujo a la disminución de la migración y la invasión in vitro (p & lt; 0,01). Focused análisis de genes-array demostró que la pérdida de NRP-2 reduce la expresión de un gen metástasis mediador crítico, S100A4. estado de los niveles y la función de β-catenina, un regulador conocido de S100A4, también se redujeron en los shNRP-2 clones. Por otra parte, desmontables de NRP-2 sensibilizado células CNDT 2.5
in vitro
a la toxicidad del 5-FU. Este efecto se asoció con la activación de las caspasas 3 y 7, la escisión de PARP, y regulación por disminución de Bcl-2.
In vivo
crecimiento de CNDT 2,5 células en el hígado de ratones desnudos se redujo significativamente en el grupo shNRP-2 (p & lt; 0,05). La administración intraperitoneal de NRP-2 siRNA-DOPC redujo la carga tumoral en ratones (p = 0,01). En conjunto, nuestros resultados demuestran que la derivada de células tumor NRP-2 media la supervivencia crítico de señalización en células de cáncer gastrointestinales
Visto:. Samuel S, Gaur P, F Fan, Xia L, Gray MJ, Dallas NA, et al . (2011) Neuropilina-2 mediada por β-catenina y la supervivencia en líneas celulares humanas de cáncer gastrointestinal. PLoS ONE 6 (10): e23208. doi: 10.1371 /journal.pone.0023208
Editor: Xin Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: Marzo 31, 2011; Aceptado: 12 de julio de 2011; Publicado: 20 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Samuel et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. RE " Bob "Fondo de Investigación del cáncer Smith (SS); Institutos Nacionales de Salud de subvención 5 T32 CA09599 (ND, PG, y DB); el Centro para la interferencia de ARN y ARN no codificante (GL-B, SA), y un proyecto de Subvención de Desarrollo de Programas formar el Fondo de Investigación del Cáncer de Ovario (GL-B, P); El William C. Liedtke, Jr., Presidente de Investigación del Cáncer (LE); Institutos Nacionales de Salud de subvención R01 CA112390 (LE). Estos proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Genentech, Inc. pagado por el salario y la infraestructura de investigación para sus empleados GP y AB, pero no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, o la preparación del manuscrito. Genentech, Inc. aprobó la publicación del manuscrito
Conflicto de intereses:. LE es un consultor para Genentech, Inc., que proporciona los anticuerpos NRP-2, y para Roche. GP y AB se pagaron empleados de Genentech en el momento del estudio. Una solicitud de patente ha sido presentada en relación con los anticuerpos anti-NRP de Genentech que se utilizaron en este manuscrito. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
Neuropilina-2 (NRP-2) es una glicoproteína transmembrana que se describió originalmente como un receptor para los mediadores de orientación axón, las semaforinas [1]. Posteriormente, se encontró que se expresa por las células endoteliales venosas y linfáticas y se identificó como un correceptor para los miembros de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [2], lo que sugiere un papel en la angiogénesis y linfangiogénesis [3]. NRP-2 expresión se ha informado sobre las células tumorales en el cáncer de pulmón [4], [5], neuroblastoma [6], cáncer de páncreas [7], osteosarcoma [8], y el cáncer de vejiga [9]. Sin embargo, la función de la NRP-2 en la membrana de células tumorales en cánceres humanos, incluyendo los de neuroendocrino gastrointestinal (GI) y el origen gástrico, permanece en gran medida sin definir. Anteriormente, hemos demostrado que NRP-2 se expresa en células de colon y cáncer de páncreas y que su expresión está involucrado en la promoción del crecimiento del tumor [10], [11]. El propósito del presente estudio fue determinar la función de NRP-2 en la mediación de señales aguas abajo que regulan el crecimiento y la supervivencia de las células cancerosas gastrointestinales humanos. Se encontró que el NRP-2 se sobreexpresa en muestras de cáncer gástrico humano y en células gástricas y carcinoides in vitro. Hemos dilucidado el papel de NRP-2 en las líneas celulares con la expresión más alta NRP-2. Se encontró que la pérdida de NRP-2 reduce los niveles de estado estable y la función de β-catenina en estas células. NRP-2 knockdown condujo a la disminución de la expresión de S100A4 y la disminución de la migración y la invasión de las células in vitro. Además, desmontables de NRP-2 sensibilizado CNDT 2,5 células in vitro a la toxicidad del 5FU. Estos resultados indican que NRP-2 media las funciones oncogénicas críticos en células de cáncer GI y que la inhibición de su expresión y la actividad podría ser explotada para el beneficio terapéutico en los pacientes con enfermedad metastásica.
Resultados
Expresión de NRP-2 en líneas celulares de tejido de cáncer y gástricos humanos
Se evaluó primero la expresión de la proteína NRP-2 en tejidos incluidos en parafina de cáncer gástrico humano y mucosa normal adyacente por tinción con inmunoperoxidasa. En las muestras de cáncer gástrico representativos, proteína de NRP-2 se expresa en el epitelio de cáncer gástrico, pero no en el epitelio de la mucosa normal (Figura 1A). proteína de NRP-2 (~130 kD) se expresó de forma heterogénea a través de cinco de las seis líneas celulares de cáncer gastrointestinales analizados por Western Blot: AGS, CNDT 2,5, MKN74, NCI-N87 y KKLS (Figura 1B). CNDT2.5 (una línea celular humana carcinoide [12], [13]) y NCI-N87 expresan los niveles más altos de NRP-2 y por lo tanto se utilizaron para desmontables estudios posteriores. Como control, la preincubación del anticuerpo NRP-2 con el péptido inmunizante confirmó la especificidad del anticuerpo.
(A) Tinción inmunohistoquímica para NRP-2 expresión en secciones de tejido representativas (20x) de la mucosa gástrica humana normal y especímenes de cáncer gástrico (B) El análisis por inmunotransferencia de NRP-2 expresión en seis líneas celulares de cáncer gastrointestinal humano. Vinculina sirvió como control interno de carga. (C) Generación de líneas celulares estables con CNDT 2,5 NRP-2 caída. El análisis por inmunotransferencia de NRP-1 y -2 expresión en 2,5 células transfectadas con CNDT shcntr o shNRP-2 plásmidos (shNRP-2 clones; C6 y C10). Vinculina sirvió como control de carga. (D) los resultados del ensayo de MTT. Las tasas de crecimiento no fueron diferentes entre las células de control y NRP-2 clones desmontables. Las barras indican SEM. (E) Inicio: El número medio de células que migraron en un ensayo de cámara de Boyden. En pocas palabras: Imágenes representativas (10x) de los ensayos de migración. (F) Arriba: El número medio de células que invadieron en el ensayo de invasión de cámara BioCoat Matrigel. Parte inferior: Imágenes representativas (10X) de los ensayos de invasión
Efecto de NRP-2 expresión en la proliferación celular in vitro
Para entender la función de NRP-2 en el cáncer gastrointestinal, nos. primero examinado los efectos de NRP-2 silenciamiento en el crecimiento de las células 2.5 CNDT in vitro. Elegimos estas células porque expresan altos niveles endógenos de NRP-2. células CDNT 2.5 se transfectaron de forma estable con un control de shRNA (shcntr) o shNRP-2 (-2 shNRP) plásmido, y dos shNRP-2 clones transfectados con una marcada disminución en NRP-2 expresión de la proteína (C6 y C10, Figura 1C) eran seleccionado. shNRP-2 transfección no afecta a la expresión de NRP-1 en estas células, la verificación de la especificidad de la NRP-2 shRNA. A continuación, utiliza un ensayo MTT para determinar el efecto de NRP-2 caída en las tasas de crecimiento de las células in vitro. Los clones transfectados de manera estable con shNRP-2 no mostraron cambios en las tasas de proliferación en relación con la de las células shcntr transfectadas (Figura 1D).
Efecto de NRP-2 expresión en la migración y la invasión
El efecto de NRP-2 RNAi sobre la motilidad del CNDT 2,5 células se examinaron utilizando ensayos de cámara de Boyden. El número de células que migraron a la cámara inferior fue significativamente menor en shNRP-2 células transfectadas (37 ± 5 por línea) que en las células shcntr transfectadas (140 ± 12 por línea) (P & lt; 0,001; Figura 1E, arriba). A la inversa, cuando las células con baja expresión endógena de NRP-2 (KKLS) fueron transfectadas transitoriamente con una expresión de ADNc de NRP-2 construir con el fin de sobreexpresar la proteína, la migración celular fue significativamente mayor (datos no mostrados).
invasión celular se evaluó usando el ensayo de cámara de Boyden modificada con membranas recubiertas con Matrigel. NRP-2 RNAi, inhibió la invasión de CNDT 2,5 células (64,4%; p & lt; 0,001; Figura 1F, parte superior). Sin embargo, debido a la invasión de las células en este ensayo es también una función del potencial migratorio de las células, es difícil desentrañar las contribuciones individuales. Como tal, dado que las diferencias entre los dos grupos es similar en ambos los ensayos, no podemos descartar la idea de que la reducción del número de células invasoras más que puede reflejar la disminución de la migración de los clones shNRP2.
Efecto de NRP- 2 caída en la expresión de los genes metastásicos conocidos
Desde la invasión y la migración están asociados con el fenotipo metastásico, se realizó un análisis conjunto de genes utilizando un microarray de la metástasis tumoral humano centrado que representa 113 genes que se sabe están involucrados en la metástasis. Represión de NRP-2 causó una reducción en el nivel de expresión de varios genes metastásicos (figura 2A). Muchos de los genes downregulated que eran sensibles a NRP-2 desmontables se sabe que están asociados con la degradación de la matriz extracelular y son altamente expresado durante la metástasis. Más notablemente, se observó que la regulación negativa de NRP-2 causó una reducción significativa (& gt; 95%) en la expresión de S100A4 (Figura 2A). Debido S100A4 era muy sensible a NRP-2 desmontables, nos centramos en este gen para estudios posteriores. El análisis de transferencia Western confirmó que la expresión de proteínas S100A4 se redujo significativamente después de NRP-2 desmontables (Figura 2B)
.
(
A
) imagen autorradiográfica de la membrana matriz que muestra la expresión diferencial de genes metastásicos en shcntr (
izquierda) y shNRP-2 (
derecha)
células. manchas circuladas indican la posición del gen S100A4. (B) La validación de S100A4 nivel de expresión de la proteína en las células mediante análisis de inmunotransferencia. La actina sirvió como control de carga. (C) Reducción del nivel de estado estacionario de β-catenina por NRP-2 caída. expresión β-catenina en shcntr y shNRP-2 células se determinó por inmunotransferencia. Vinculina sirvió como control de carga. (D) Verificación de la expresión de β-catenina reducida en shNRP-2 células por tinción de inmunofluorescencia. 2,5 células shcntr y shNRP-2 CNDT que crecen en portaobjetos de cámara se fijaron y se inmunotiñeron con anticuerpo anti-β-catenina (rojo). Los núcleos se counterstained con DAPI (azul). (E) Validación de la reducción de β-catenina en una segunda línea celular de cáncer gástrico caída NRP-2. células de cáncer gástrico NCI-N87 fueron infectadas con lentivirus que contenían shcntr o shNRP-2 constructos. El análisis por inmunotransferencia mostró una reducción en la expresión de β-catenina en desmontables células NCI-N87 NRP-2. La actina sirvió como control de carga. (F) Nivel de β-catenina en el citoplasmática (cito) y (Nuc) fracciones nucleares de shcntr y shNRP-2 células. HSP90 (citoplasmática) y LaminB (nuclear) sirvieron como controles de fraccionamiento.
Efecto de NRP-2 caída en la expresión y localización de β-catenina
Debido a que S100A4 es un objetivo transcripcional directa de β-catenina, se analizó la expresión de β-catenina en las células desmontables NRP-2. expresión total β-catenina proteína fue significativamente menor en las células CNDT 2,5 shNRP-2 que en las células shcntr (Figura 2C). Para una confirmación adicional, shcntr y shNRP-2 clones se fijaron y se inmunotiñeron con anticuerpo anti-β-catenina (fluorescencia roja). En consonancia con los datos de Western blot, los niveles totales de β-catenina se redujeron significativamente en las células NRP-2 desmontables (Figura 2D). Para una validación adicional en una segunda línea celular de cáncer gástrico, NRP-2 fue derribado en células NCI-N87, que expresan un alto nivel endógeno de NRP-2, por estable shNRP-2 incorporación lentivirus mediada. Después de la verificación de NRP-2 desmontables (Figura 2E, el panel medio) en estas células, el nivel de β-catenina se evaluó mediante Western Blot. El nivel total de β-catenina se redujo significativamente en estas células NRP-2 desmontables (Figura 2E, panel superior).
Para determinar si la expresión β-catenina mediada por NRP-2 fue ligando dependiente o independiente de ligando, β-catenina estado se evaluó mediante análisis de transferencia Western en CNDT 2,5 células después del tratamiento con anticuerpos bloqueantes de NRP-2 (anti-NRP-2
B, que bloquea VEGF-C de unión, y pan-anti-PNR, que bloquea Sema unión a ambos bloques de NRP-1 y NRP-2 y también la unión de VEGF a través de impedimento estérico); anticuerpo anti-NRP1 sirvió como control (todos de Genentech, San Francisco, CA). En comparación con el control, no hubo diferencia en la expresión de β-catenina en las células tratadas con los anticuerpos de bloqueo, lo que sugiere que la señalización mediada por NRP-2 en estas células es independiente de ligando (datos no presentados).
β-catenina se sabe que ejercer su función por translocación desde el citoplasma al núcleo, donde se une a factores de transcripción tales como el factor de células T (TCF) /factor de unión potenciador linfoide y por lo tanto estimula la transcripción de genes diana. por lo tanto, se analizó la abundancia relativa de la proteína β-catenina en la citosólica y compartimentos nucleares en las células CNDT2.5 shNRP-2 y shcntr después del fraccionamiento celular. Como se muestra en la Figura 2F, NRP-2 knockdown condujo a una reducción significativa en el nivel de estado estacionario de la proteína β-catenina, tanto en el citosol y las fracciones nucleares de las células.
Efecto de NRP-2 desmontables en función de β-catenina
Para determinar si NRP-2 desmontables también afectó a la actividad de señalización de β-catenina, las células transfectadas CNDT 2,5 shcntr y shNRP-2 con el plásmido reportero TOPflash TCF o el FOPFLASH plásmido de control. TOPflash contiene un informador de luciferasa bajo el control de tres copias del elemento de unión TCF-de tipo salvaje aguas arriba del promotor mínimo de timidina quinasa y se regula específicamente por la señalización de β-catenina. En FOPFLASH, el elemento de TCF-unión está mutado. El ensayo de luciferasa demostró que la actividad del indicador se redujo de 2 veces en las células shNRP-2 en comparación con la actividad en las células shcntr (Figura 3A).
(A) Evaluación de la actividad de reportero TCF utilizando la β-catenin- TOPflash sensibles o reporteros FOPFLASH mutantes. Las actividades de luciferasa se midieron después de la transfección transitoria de los plásmidos informadores en shcntr y shNRP-2 CNDT 2,5 células (B) Aumento de la degradación mediada por proteasoma de β-catenina en shNRP-2 células. shcntr y shNRP-2 CNDT 2,5 células fueron tratadas con 30 mM MG132 o un volumen igual de DMSO (un disolvente para MG132) durante 2 horas. Los lisados celulares se analizaron por inmunotransferencia utilizando el anticuerpo anti-β-catenina ( 'φ', ningún tratamiento; 'Ub', ubiquitinated β-catenina). (C) Análisis de inmunotransferencia que muestra la restauración del nivel de β-catenina en las fracciones citoplasmáticas y nucleares después del tratamiento con 30 mM MG132 durante 2 horas. (D) La disminución de los niveles de GSK3 fosforilada en NRP-2 desmontables células. El análisis por inmunotransferencia de fosforilados GSK3 (en Ser-9) y GSK3. (E) La restauración de nivel de β-catenina después de bloquear la actividad de GSK3 en NRP-2 desmontables células. shcntr o shNRP-2 CNDT 2,5 desmontables células se trataron con concentraciones crecientes de LiCl durante 24 horas y se recogieron para el análisis de inmunotransferencia para detectar β-catenina.
Efecto de NRP-2 desmontables en la estabilidad de β- catenina
intracelulares niveles de proteína β-catenina se mantienen por un multiproteínico "complejo de destrucción" que contiene APC, axina y GSK3. En un complejo activo, GSK3 fosforila β-catenina, que inserte en ella para el reconocimiento por β-TRCP, polyubiquitinylation, y la posterior degradación por el complejo proteasoma. Se realizó inhibidores de estudios para evaluar la estabilidad de β-catenina en las células desmontables NRP-2. El tratamiento con MG132, un inhibidor del proteasoma, dio lugar a la restauración del nivel de la proteína β-catenina total en los desmontables células NRP-2 con el nivel en las células shcntr (Figura 3B). Además, el tratamiento con MG132 también restauró el nivel de proteína β-catenina total en ambos la citosólica y compartimentos nucleares en las células NRP-2 desmontables (Figura 3C).
modificaciones postraduccionales se sabe que juegan un papel crítico en la regulación del intercambio de β-catenina y β-catenina es fosforilada de forma secuencial por GSK3. Para investigar si la activación de GSK3 estuvo involucrado en la regulación a la baja de β-catenina, se analizó el estado de fosforilación de GSK3 mediante el uso de un anticuerpo contra el Ser-9 forma fosforilada de GSK3. Ser-9 fosforilación ha sido reportado para hacer GSK3 inactivo. Como se muestra en la figura 3D, Ser-9 fosforilación de GSK3 se redujo significativamente en las células shNRP-2, indicando que en estas células no se incrementaron los niveles de la proteína activa GSK3, que promueve la degradación de β-catenina. Para confirmar aún más la participación de la activación de GSK3 en la regulación de β-catenina, el efecto de cloruro de litio (LiCl)
, un conocido inhibidor de la actividad de GSK3, se analizó. LiCl se ha informado de inducir el inhibidor Ser-9 fosforilación de GSK3 mientras que no tiene efecto sobre otras proteína quinasas. Como se muestra en la Figura 3E, el tratamiento con LiCl estabiliza la proteína β-catenina en las células shNRP-2 de una manera dependiente de la dosis.
Efecto de NRP-2 desmontables en la quimiosensibilidad de las células de cáncer gastrointestinal in vitro
Dado el papel conocido de β-catenina en la mediación de la supervivencia celular, la hipótesis de que un nivel de β-catenina reducida en las células desmontables NRP-2 se traduciría en un aumento de la quimiosensibilidad de estas células. Para probar esta hipótesis, se realizó primero un ensayo de quimiosensibilidad in vitro con 5-fluorouracilo (5FU), que se utiliza como tratamiento estándar para los cánceres gastrointestinales. De acuerdo con nuestra hipótesis, por medio de la tinción de anexina V, CNDT 2,5 células shNRP-2 tratados con una dosis clínicamente relevante de 5FU demostraron un porcentaje significativamente mayor de células apoptóticas que hizo células shcntr (25,5% vs. 12,5%, respectivamente; p & lt; 0,05;. Figura 4A)
(a) ensayo de anexina V en shcntr y 2,5 células shNRP-2 CNDT después del tratamiento sin o con 5FU durante 48 horas. (B) Análisis de transferencia Western de marcadores de apoptosis en extractos celulares de shcntr y shNRP-2 CNDT 2,5 células tratadas sin o con 5FU. Vinculina y actina sirvió como control de carga.
Para confirmar el mecanismo de la muerte celular inducida por 5-FU-, se comparó la activación de mediadores de apoptosis en el shcntr CNDT 2.5 y células shNRP-2 tratados con 5-FU. La activación de la caspasa-3 y -7, las caspasas efectoras en la cascada apoptótica, y la escisión de la PARP sustrato de caspasa, que ejerce la actividad proapoptótico, se evaluaron por inmunotransferencia utilizando anticuerpos que reconocen específicamente sus productos escindidos. En consonancia con el aumento de la apoptosis en las células NRP-2 desmontables 5FU tratados, se observó un marcado incremento en los niveles de caspasa-3 activa y -7 en estas células, pero no en las células shcntr (Figura 4B). Asimismo, se observó escisión de PARP en células shNRP-2 5FU tratados, pero no en células shcntr 5FU tratados (Figura 4B). Además, se observó expresión significativa de la proteína antiapoptótica Bcl2 en las células shcntr CNDT 2,5; expresión Bcl2 estaba ausente en las células shNRP-2.
Efecto de NRP-2 caída en el crecimiento in vivo de las células cancerosas gastrointestinales
Para examinar el efecto de NRP-2 caída en el crecimiento de células de cáncer gastrointestinales en vivo, se inyectaron 2,5 CNDT shcntr o shNRP-2 clones en los hígados (un sitio común para la metástasis del cáncer gastrointestinal) de ratones (10 animales por grupo) y la incidencia de tumores evaluado y el volumen del tumor. Todos los ratones eran de aproximadamente el mismo peso cuando sacrificado. la incidencia de tumores fue significativamente menor en los ratones inyectados con shNRP-2 clones que en los ratones inyectados con células shcntr (30% para shNRP-2 C6 y 10% para shNRP-2 C10 vs. 80% para shcntr; p & lt; 0,05, Fishers Exact Test, Figura 5A). Además, los tumores producidos por CNDT 2,5 shNRP-2 células fueron significativamente más pequeños (media del volumen del tumor de hígado de 38 ± 24 mm
3 y 14 ± 10 mm
3 para los dos clones, respectivamente) que eran tumores producidos por el control de células (media del volumen del tumor de hígado de 1.797 ± 880 mm
3; p & lt; 0,05; Figura 5B). Los datos representados incluye todos los 10 ratones en cada grupo, incluidos los que no desarrollaron ningún tumor (es decir, 7/10 y 9/10, respectivamente, en los dos grupos shNRP2 Vs 2/10 en el grupo de control). imagen representativa de todo el hígado con un tumor de cada grupo se muestra en el panel inferior. La caída de NRP2 en los tumores se confirmó mediante análisis de inmunotransferencia de NRP-2 en los tejidos tumorales de hígado de los ratones inyectados con CNDT 2,5 shcntr o 2 shNRP-C6 células (Figura 5C).
(A) Disminución de la incidencia de tumores y la media de volumen del tumor después de NRP-2 desmontables. la incidencia de tumores (10 ratones) después de la inyección de hígado con células CNDT 2,5 shcntr o uno de los dos shNRP-2 clones. (B) Inicio: volúmenes de los tumores hepáticos finales en los ratones inyectados con shcntr y shNRP-2 clones. En pocas palabras: Imágenes representativas de tumores. (C) El análisis por inmunotransferencia de NRP-2 en los tumores de los ratones inyectados con CNDT 2,5 shcntr o 2-C6 shNRP células [ 'T1'; Tumor#1; «T2»; Tumor#2]. β-actina sirvió como control de carga.
Efecto de la dirección in vivo de NRP-2 sobre el crecimiento de las células cancerosas gastrointestinales
A continuación, se examinó el efecto de la administración in vivo de NRP-2 dirigido siRNA utilizando 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (NRP-2 siRNA-DOPC) nanoliposomas neutrales [10], [14] sobre el crecimiento de xenoinjertos de cáncer gastrointestinal en ratones. CNDT 2,5 células fueron cultivadas como s.c. xenoinjertos, y NRP-2-siRNA tratamiento DOPC se inició el día 7 en ratones con tumores visibles (15 ± 1,5 mm
3). El tratamiento consistió en la inyección intraperitoneal dos veces por semana con 5 mg CNTR siRNA-DOPC o NRP-2 siRNA-DOPC. El volumen medio de los tumores en ratones tratados con NRP-2 siRNA-DOPC era menor que la de los ratones tratados con CNTR secuencias de siRNA-DOPC (264,4 ± 19,4 mm
3 vs. 751,3 ± 150,6 mm
3, respectivamente; p = 0,01; Figura 6A). Además, los ratones tratados con NRP-2 siRNA-DOPC mostraron una reducción significativa de la masa tumoral en comparación con la masa tumoral en los ratones tratados con CNTR secuencias de siRNA-DOPC (160 ± 18 mg vs 459 ± 102 mg, respectivamente; p & lt; 0,05; figura 6B). La tinción inmunohistoquímica de tejidos tumorales confirmó que NRP-2 expresión se redujo en los tumores de ratones tratados con las secuencias de NRP-2 siRNA-DOPC comparación con los tumores de los ratones tratados con CNTR secuencias de siRNA-DOPC (Figura 6C) guía.
volúmenes (A) del tumor después de la administración de sicntr y siNRP-2 liposomas. Los ratones desnudos (7 por grupo) fueron s.c. inyectados con 1 x 10 células 2.5
6 CNDT. Los ratones con tumores visibles eran estratificado y se trató con 5 g de siRNA liposoma conjugado (inyecciones i.p.) dos veces por semana. NRP-2-siRNA DOPC-tratamiento condujo a una disminución significativa en el crecimiento del tumor en comparación con cntr siRNA DOPC-tratamiento (264,4 mm
3 vs 751,3 mm
3, respectivamente; *
p =
0,01). (B) Inicio: Al final del experimento, s.c. tumores se extirparon y se pesaron. El peso del tumor fue significativamente menor en NRP-2-siRNA-DOPC ratones (media, 160 mg) tratados en comparación con los ratones tratados con siRNA DOPC CNTR (media, 459 mg; *
p
= 0,01). En pocas palabras: Imágenes representativas de tumores (C) El análisis por inmunotransferencia de NRP-2 en los tumores de los ratones tratados con CNTR-siRNA DOPC o NRP-2-siRNA DOPC
Discusión
Neuropilina. -2 (NRP-2) es conocido tradicionalmente para funcionar como un correceptor nonsignaling para la clase 3 semaforinas y miembros de la familia VEGF [1], [2]. Aunque la expresión de NRP-2 se pensó originalmente para ser limitado a las neuronas, los estudios han demostrado que la NRP-2 se expresa en las CMLV, células endoteliales, y células tumorales. NRP-2 se informó de interactuar con VEGFR2 y VEGFR3 y aumentar la supervivencia y migración de células endoteliales linfáticas [15] y vascular. estudios funcionales recientes de Caunt y colegas han demostrado que el bloqueo de NRP-2 en un modelo de metástasis de pulmón preclínica impedido metástasis tumoral mediante el bloqueo de la formación de vasos linfáticos asociados a tumores [16].
La expresión de NRP-2 ha sido detectado en las células tumorales de las muestras de pacientes de muchos tipos de tumores, incluyendo glioblastoma, neuroblastoma, y melanoma. Nuestro laboratorio y otros han demostrado que derivados de células tumorales NRP-2 juega un papel en el crecimiento del tumor [10], [11]. Hemos tratado de aclarar aún más el papel funcional de los mecanismos de señalización que median la función de NRP-2 en células de cáncer GI, incluyendo gástrico y células carcinoides NRP-2 y. Se demuestra en este estudio que NRP-2 es altamente expresado por las células tumorales en los tejidos de carcinoma gástrico y por líneas celulares de cáncer gastrointestinal, pero no es detectable por inmunohistoquímica en mucosa gástrica normal. Los mecanismos por los cuales NRP-2 niveles están regulados al alza en los cánceres gastrointestinales siguen sin estar claros. Curiosamente, Tsukamoto et al [17] encontró que el 40% de los pacientes con cáncer gástrico analizada tenía una ganancia en 2q33 (la región en la que se encuentra el gen NRP-2) por la matriz de análisis de hibridación genómica comparada (CGH), lo que sugiere número de copias aberraciones ( CNA) de esta región.
Hemos utilizado un enfoque de interferencia de ARN mediada por shRNA para suprimir NRP-2 expresión en células de cáncer gástrico para investigar los cambios fenotípicos resultantes, incluyendo proliferación, migración, y las actividades invasivas. Desmontables de NRP-2 no afectó a la proliferación de las células CNDT 2,5 in vitro; Sin embargo, la pérdida de NRP-2 reduce el crecimiento de xenoinjertos de tumores
in vivo
. La discrepancia entre
in vitro
y
in vivo
crecimiento inhibición puede ser debido a las respuestas mediadas por NRP-2 a partir de células en el microambiente tumoral en el sitio del tumor
in vivo
que no sean apreciables en un
in vitro
sistema.
In vitro
estudios demostraron además que no había una marcada inhibición de tanto la migración y la invasión de las células. El uso de genes asociados a metástasis en un análisis de microarrays de ADNc, se identificaron S100A4, un gen clave metástasis mediador, para ser regulados a la baja de manera significativa después de NRP-2 silenciamiento. S100A4 ha sido previamente vinculado a la metástasis en varios sistemas experimentales [18], [19]. Estudios recientes han demostrado que S100A4 también puede contribuir a la progresión del cáncer mediante la mejora de las funciones de supervivencia celular. Mahon et al [20] han demostrado que S100A4 knockdown sensibiliza a las células de cáncer de páncreas al tratamiento gemcitabina, además de activar las caspasas y PARP, lo que resulta en un aumento de la apoptosis y la detención del ciclo celular. Hemos observado que la regulación a la baja de NRP-2 en células de cáncer gástrico chemosensitized las células a tratamiento 5FU. Se necesitan más estudios para determinar si NRP-2 media las funciones prosurvival en células de cáncer gástrico a través de S100A4.
Un examen más detallado de la regulación mediada por S100A4 NRP-2 demostró que los niveles de estado estable y la función de β-catenina, un regulador transcripcional directa de S100A4, se ve comprometida en los desmontables células NRP-2. Un gran cuerpo de datos apoyan la contribución de la activación de la vía de señalización de β-catenina en el desarrollo y progresión de cánceres. La activación de la señalización /β-catenina Wnt se encuentra en aproximadamente 30% de los cánceres gástricos [21]. En un estudio reciente, Wang et al [22] han propuesto la estabilización de β-catenina como un modo de acción para la función oncogénica mediada por ATDC en el cáncer de páncreas. Utilizando un modelo de ratón transgénico, Oshima et al [23] han demostrado que la cooperación de la señalización de Wnt y la prostaglandina E
2 (PGE
2) vía provoca el desarrollo del cáncer gástrico. El sostenido β-catenina activación de la vía observada en las células NCI-N87 debe ser independiente de mutaciones en los genes APC y β-catenina porque esta línea celular no alberga mutaciones inherentes en cualquiera de estos genes. El mecanismo por el cual NRP-2 silenciamiento afecta a esta vía sigue siendo poco clara.
Una posible limitación de nuestro estudio es que hemos analizado el crecimiento de NRP-2 desmontables células de cáncer gástrico como tumores primarios, pero no evaluó la metástasis de tumores. Dada nuestra observación de que estas células han disminuido la migración y la invasión después de NRP-2 desmontables, el
in vivo
potencial metastásico de estas células necesidades explorarse en el futuro. Otros estudios también son claramente necesarios para dilucidar el mecanismo potencial subyacente a la atenuación de la vía de β-catenina por NRP-2 silenciamiento. Esto sigue siendo un problema sin resolver y es objeto de una investigación en curso en nuestro laboratorio.
NRP-2 está emergiendo como una nueva diana terapéutica. Dado el papel de NRP-2 en la migración de células tumorales y la invasión, la orientación NRP-2 ofrece un nuevo enfoque potencial para inhibir el crecimiento y la supervivencia de células de cáncer en pacientes con enfermedad metastásica. Además, debido a NRP-2 parece tener funciones distintas de la de la familia VEGF de los receptores, la orientación NRP-2 es poco probable que tenga el mismo resultado que la orientación VEGF. Hemos encontrado que el tratamiento de células de cáncer gastrointestinal con bevacizumab no tiene ningún efecto sobre la expresión de β-catenina (datos no mostrados). Orientación de NRP-2, por tanto, pueden complementar y ampliar los efectos antitumorales de terapias que se dirigen a VEGF, tales como bevacizumab.
Hemos encontrado que la expresión de β-catenina mediada por NRP-2 observada en este estudio es independiente de ligando. Esta señalización NRP2 independiente de ligando es novedoso sin embargo; el mecanismo (s) de la mediación de este fenómeno aún no se ha entendido. En la actualidad, sólo podemos especular sobre el mecanismo (s) que participan, en base a las documentadas por otros receptores de membrana. (I) Es concebible que en células tumorales la expresión aumentada de NRP2 en los resultados de la superficie celular en la activación independiente de ligando de NRP2 señalización mediada mediante la unión a VEGFR /plexin NRP2 espontánea. (Ii) Alternativamente, la señalización de NRP2 independiente de ligando podría también ser activado a través de homo-dimerización (o heterodimerización con NRP1) como en el caso de muchos otros receptores de membrana. PNR son conocidos para formar homo o hetero-multímeros incluso en ausencia de ligando a través de la membrana de dominio proximal c. (Iii) Una tercera posibilidad invoca activación a través de diafonía vía con otros receptores de la membrana, pero esto plantea la cuestión de cómo se activan los receptores postulados. En cualquier caso, las proteínas que se asocian con NRP2, incluyendo neuropilina interacción de proteínas (NIP) /synectin, es probable que sean clave para la señalización independiente de ligando.