Extracto
La selección de los pacientes con cáncer de pulmón para la terapia con inhibidores de la tirosina quinasa dirigidos a EGFR requiere la identificación de concreto
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mutaciones. En la mayoría de los pacientes con, muestras de tumores de carcinoma de pulmón inoperable limitada avanzada a menudo representan el único material disponible tanto para la tipificación histológica y el análisis molecular. Hemos definido un protocolo de próxima generación de secuenciación dirigida a
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exones 18-21 adecuado para el diagnóstico de rutina de este tipo de muestras clínicas. El protocolo fue validado en una serie no seleccionada de 80 pequeñas biopsias (n = 14) y la citología (n = 66) muestras representativas del material presentado habitualmente para la evaluación diagnóstica de tres centros médicos de referencia en Italia. Las muestras se evaluaron sistemáticamente para número de células tumorales y la proporción respecto a las células no neoplásicas. Se analizaron en lotes de 100-150 amplicones por corrida, alcanzando una sensibilidad analítica de 1% y la obtención de un número suficiente de lecturas, para cubrir todos los exones de todas las muestras analizadas. secuenciación de próxima generación se comparó con la secuenciación de Sanger. Este último identificado 15
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mutaciones en 14/80 casos (17,5%), pero no detectado mutaciones cuando la proporción de células neoplásicas estaba por debajo del 40%. secuenciación de próxima generación identificó 31
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mutaciones en 24/80 casos (30,0%). Las mutaciones se detectaron con una proporción de células neoplásicas tan bajas como 5%. Todas las mutaciones identificadas por el método de Sanger se confirmaron. En 6 casos de secuenciación de nueva generación identificado el exón 19 deleciones o la mutación L858R no visto después de la secuenciación Sanger, permitiendo que el paciente a ser tratado con inhibidores de la tirosina quinasa. En un caso adicional se identificó la mutación R831H asociada a la resistencia al tratamiento en un
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tumor de tipo salvaje después de la secuenciación de Sanger. secuenciación de próxima generación es robusto, rentable y mejora en gran medida la detección de
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mutaciones. Su uso debe ser promovido para el diagnóstico clínico de las mutaciones en las muestras con contenido de células tumorales desfavorable
Visto:. De Biase D, M Visani, Malapelle T, Simonato F, V Cesari, Bellevicine C, et al. (2013) Next-Generation Sequencing de cáncer de pulmón
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Los exones 18-21 Permite eficaz diagnóstico molecular de muestras de rutina pequeños (citología y biopsia). PLoS ONE 8 (12): e83607. doi: 10.1371 /journal.pone.0083607
Editor: Pan-Chyr Yang, Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán
Recibido: 18 Agosto, 2013; Aceptado: 5 Noviembre 2013; Publicado: December 23, 2013
Derechos de Autor © 2013 de Biase et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores confirman que este estudio fue apoyado por una subvención del Gobierno italiano MURST (concesión no. 20093XZC57_003) de GT. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El carcinoma de pulmón a menudo se presenta en etapa avanzada y es la causa principal de muerte relacionada con el cáncer en los países desarrollados (http://seer.cancer.gov/statfacts/html/lungb.html#survival). El descubrimiento en 2004 de que la activación de mutaciones somáticas en la tirosina quinasa
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gen crea el tumor sensible a los inhibidores de la tirosina cinasa (ITC) de tratamiento ha representado uno de los avance más significativo en el campo de la oncología molecular en la última década [1,2]. Los ensayos clínicos aleatorizados han demostrado respuestas del paciente a la ITC erlotinib (Tarceva, OSI Pharmaceutical) o gefitinib (Iressa, Astrazeneca) como tratamiento de primera línea en aproximadamente dos tercios de los pacientes con
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ha mutado tumores con tasas muy superiores a las los obtenidos con base de platino convencional quimioterapia [3-9].
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mutaciones se han convertido en biomarcadores "críticos" para seleccionar adecuadamente a los pacientes para el tratamiento ITC, y las directrices para el diagnóstico molecular han sido delineadas por las organizaciones profesionales, tanto en Europa como en los Estados Unidos [10, 11]. La mayoría - 80-90% - de la
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las mutaciones son pequeñas exón 19 supresiones o la mutación L858R en el exón 21, pero otra ITC sensibles
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mutaciones pueden ocurrir en los exones 12, 19 , 20, 21. las mutaciones asociadas con la resistencia a los ITC, como el T790M en el exón 20, también se puede desarrollar en pequeños sublclones de células tumorales y necesitan ser identificadas [1,2,8,12-23].
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tumores mutados son típicamente adenocarcinomas, donde las mutaciones pueden ser identificados en aproximadamente un cuarto de los casos, y en una mayor proporción de tumores de pacientes de Asia.
Los adenocarcinomas son ahora considerados como el subtipo más común de carcinoma de pulmón, que constituyen aproximadamente el 40% de todas las no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) [24] y el análisis molecular de
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exones 18, 19, 20, 21 se recomienda en todos los tumores de adenocarcinoma de pulmón o con un componente de adenocarcinoma [10]. Por lo tanto, la evaluación patológica de un carcinoma de pulmón ahora requiere tanto una subtipificación precisa por histológicos e inmunohistoquímicos estudios, así como la determinación de la
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estado mutacional para seleccionar los pacientes para la terapia de TKI. Esta evaluación en profundidad, obviamente, requiere cantidades adecuadas de tejido tumoral de buena calidad, como los obtenidos de la cirugía de resección [25].
Lamentablemente el 60% de NSCLC son la etapa alta localmente avanzado y /o inoperables tumores que ya han hecho metástasis a sitios distantes en el momento en que se detectan (http://seer.cancer.gov/statfacts/html/lungb.html#survival). Por lo tanto, en pacientes con tumores tales muestras muy limitadas - pequeñas biopsias o muestras de citología - suelen ser el único material disponible para la tipificación histológica y para el análisis molecular [26]. En estas muestras el tema de la muestra de pureza es decir, la proporción de material lesional a los "contaminantes" células benignas o no lesional es a menudo crítico [27,28]. secuenciación de Sanger, el método más ampliamente utilizado para la detección de la mutación no tiene suficiente sensibilidad analítica para identificar de forma fiable las mutaciones en las muestras con una baja proporción de células tumorales. Se puede dar resultados falsos negativos si el porcentaje de células neoplásicas es inferior a un umbral general de 50% que corresponde al 25% alelos mutados, suponiendo que la mutación es heterocigoto y que el
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sitio cromosómico 7p12 es dysomic [29 ]. Por lo tanto, los métodos alternativos - cada uno con sus propias ventajas y desventajas - se han propuesto para detectar
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mutaciones con el objetivo de lograr una mayor sensibilidad. Muchos se utilizan actualmente para el análisis molecular de muestras de rutina [30]. Estos incluyen fusión alta resolución (HRM) [31], polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) [32], mutante PCR específica de alelo [33], ácido nucleico peptídico Locked PCR de sujeción (PNA-PCR) [34,35], pyrosequencying [36], y la inmunohistoquímica con anticuerpos de EGFR específicos que detectan la mutación L858R y el exón 19 eliminación [37,38]. Algunos métodos de mutación específica como los brazos del escorpión (kits de mutación TheraScreen EGFR29 de QIAGEN Manchester [anteriormente DxS], Manchester, Inglaterra) [39] alcanzan una sensibilidad muy alta (~ 1%), pero no hay que subestimar las mutaciones pre-diseñados y requieren de un lugar cantidad significativa de ADN, no siempre está disponible en muestras limitadas [40,41]
el desarrollo de la próxima generación de secuenciación (NGS) métodos -. también conocidos como secuenciación paralela masiva ya que permiten el análisis paralelo de un gran número de moléculas de ADN - ha representado uno de los avances técnicos más importantes en la biología molecular [42]. Estos métodos han estado disponibles desde 2005 y están produciendo avances notables en oncología, incluyendo la definición de la secuencia de ADN de los tipos comunes de cánceres humanos [43].
Este es un estudio multicéntrico para evaluar la aplicación de NGS para el diagnóstico molecular de
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mutaciones en muestras limitadas de NSCLC, pequeñas biopsias y muestras de citología. En lugar de analizar algunos casos para un gran número de genes, hemos elegido para dirigir la secuenciación paralela a la
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mutación "puntos calientes". La atención se centró en
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análisis porque, como se mencionó anteriormente,
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mutaciones a menudo necesitan ser identificadas en el ADN extraído de muestras que son problemáticos para el diagnóstico molecular y al mismo tiempo son muy crucial para decidir el tratamiento del paciente. resultados de la secuenciación NGS se compararon con los de secuenciación de Sanger, el método actualmente en uso para el análisis molecular de rutina en los tres centros socio italiano en Bolonia, Padua y Nápoles, que participaron en el estudio.
Estamos motivado que en a pesar de su mayor complejidad en comparación con la secuenciación de Sanger (u otros métodos alternativos) NGS ofrece varias ventajas - alta sensibilidad analítica, la detección de la totalidad de la secuencia de nucleótidos de la región diana, la evaluación semicuantitativa de la alelo mutado, análisis de muchas muestras en una única ejecución (alto rendimiento) - que lo hacen ideal para el estudio del carcinoma de pulmón. Nuestros resultados indican que NGS se puede aplicar con eficacia para satisfacer las necesidades de los análisis de ADN de rutina, y que representa una alternativa práctica a otros métodos usados actualmente para detectar
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mutaciones.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Desde
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análisis mutacional es parte de la rutina de diagnóstico de rutina de los pacientes con CPNM la necesidad de la aprobación del comité de ética no era necesario para este estudio, de conformidad con las directrices éticas médicas de la Azienda Unità Sanitaria Locale di Bologna, Azienda Universitaria Policlinico Università degli Studi di Napoli Federico II, Azienda Universitaria Policlinico Università degli Studi di Padova y de acuerdo con la autorización general para procesar datos personales con fines de investigación científica de "The Italian Autoridad de Protección de datos "(http://www.garanteprivacy.it/web/guest/home/docweb/-/docweb-display/export/2485392). De acuerdo con estas directrices, se ha firmado un consentimiento informado por escrito integral para los procedimientos (aspiración con aguja fina, biopsias y resecciones quirúrgicas) que produjeron las muestras de tejido y para su estudio diagnóstico. Toda la información sobre el material humano se gestiona mediante códigos numéricos anónimos. Los datos clínicos y el seguimiento de la información no se utilizaron para este estudio. Todas las muestras fueron manejadas de acuerdo con la Declaración de Helsinki (http://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/).
La selección de casos y recogida de material tumoral para el análisis molecular
Ochenta muestras de NSCLC fueron seleccionados al azar de los pacientes que se sometieron a estudio diagnóstico en las secciones de Anatomía Patológica del hospital de Bellaria-Universidad de Bolonia y el hospital Maggiore de Bolonia, y en los Hospitales de la Universidad de Nápoles y Padua. Todos los pacientes tenían una indicación clínica para
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pruebas de mutación para el carcinoma de pulmón avanzado. Las células tumorales para el análisis molecular se obtuvieron a partir de diapositivas de citología en 66 casos y de las secciones incorporado (FFPE) parafina de tejido fijado en formalina en 14 muestras de biopsia. Ambas muestras de citología y biopsia se procesaron de forma rutinaria y diagnósticos realizadas en concordancia con los criterios estándar.
Todos los casos fueron procesados para la extracción de ADN luego del análisis patológico aseguró la presencia de al menos un centenar de células neoplásicas. La proporción de células neoplásicas /número total de células (es decir, el enriquecimiento de células tumorales) se estimó en todos los casos. También se evaluó el número total de células neoplásicas presentes en la muestra procesada para el análisis molecular. Se estimó como sigue: en una muestra dada se contaron las células neoplásicas en cinco campos uno milímetro cuadrado (1 mm
2) y la media de estas cinco valores calculados; entonces la media se multiplica por el área total (en milímetros) de la muestra - muestra para citología o la histología sección de la biopsia -. seleccionada para el análisis molecular
Para las células de muestras citológicas se rasparon de la zona seleccionada para el análisis después de retirar el cubre por inmersión del portaobjetos en xileno. Para el material FFPE, seis secciones 10 micras de espesor fueron cortadas de cada bloque seleccionado, seguido de una tinción de hematoxilina y eosina (H & amp; E) control deslizante. El área del tumor fue marcado en el control deslizante y el material tumoral se disecó manualmente bajo la guía microscópica de las correspondientes secciones de 10 micras utilizando una cuchilla estéril. Veinte muestras adicionales de ADN - previamente caracterizadas por la
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estado mutacional - se utilizaron para evaluar la reproducibilidad de la secuencia 454 en paralelo (véase más adelante)
extracción de ADN
Para Sanger. la secuenciación del ADN se extrajo de acuerdo con procedimientos estándar como se informó anteriormente [44-46]. Para garantizar un rendimiento máximo del ADN de NGS se siguieron dos protocolos distintos para citología y las biopsias. Se extrajo ADN de muestras citológicas usando MasterPure DNA Purification Kit (Epicentre, Madison, WI, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Para las muestras obtenidas a partir de biopsias de ADN se extrajo con el Alto Kit Pure PCR Template Preparation (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante.
Secuenciación
Ochenta muestras se ensayaron para
EGFR gratis (exón 18, 19, 20 y 21) utilizando Sanger y /o secuenciación de próxima generación. secuenciación de Sanger se llevó a cabo en las instalaciones de la patología molecular de las secciones de Anatomía Patológica del Hospital de Bellaria-Universidad de Bolonia (33 casos), del Hospital de la Universidad de Nápoles (29 casos) y de Padua (18 casos). la secuenciación de próxima generación de todos los casos se realizó en paralelo usando un GS-Junior secuenciador 454 de próxima generación en las instalaciones de Patología Molecular del Bellaria Hospital-Universidad de Bolonia, la sección de Anatomía Patológica, a partir de material de forma rutinaria procesado originalmente seleccionado de la sección de Anatomía Patológica de el hospital Bellaria y de las instituciones que presentaron en Padua y Nápoles. Los controles negativos y no hay controles de ADN plantilla se incluyeron en todas las carreras.
Sanger de secuenciación.
Las reacciones de PCR se realizaron con el kit de ADN polimerasa FastStartTaq (Roche Ciencias Aplicadas, Mannheim, Alemania), a partir de 15 a 50 ng de ADN. Los cebadores utilizados para la PCR se describen en la Tabla 1. Los productos de PCR fueron controladas en gel de agarosa al 2,5% y amplicones purificados usando Agencourt Ampure XP perlas (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EE.UU.). La secuenciación se llevó a cabo de acuerdo con procedimientos estándar utilizando el Kit de GenomeLab DTC (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.) y un secuenciador automático de ADN CEQ2000 XL (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.) en el Hospital Bellaria , utilizando el kit BigDye Terminator (versión 3.1; Life Technologies). y se ejecutan en el analizador ABI 3730 (Life Technologies) en el hospital de la Universidad de Nápoles y en el hospital de la Universidad de Padua
EGFR
Exon
Sanger de secuenciación 5'-3 '
NGS 5'-3'
a
Largo (pb)
EX18 FwCATgTCTggCACTgCTTTCCggCTgAggTgACCCTTgTC184Ex18 RvAgggACCTTACCTTATACACCgCCTgTgCCAgggACCTTACEx19 FwAgCATgTggCACCATCTCACAgCATgTggCACCATCTCAC182Ex19 RvATgAgAAAAggTgggCCTgACCCACACAgCAAAgCAgAAAEx20 FwAgCCACACTgACgTgCCTCTAgCCACACTgACgTgCCTCT208Ex20 RvCCTTATCTCCCCTCCCCgTATgCACACACCAgTTgAgCAgEx21 FwTgCAgAgCTTCTTCCCATgACCTCACAgCAgggTCTTCTC196Ex21 RvgCATgTgTTAAACAATACAgCCCACCTCCTTACTTTgCCTCCTTable 1. Los cebadores utilizados para la amplificación de los exones 18-21 EGFR
a cebadores para la secuenciación de próxima generación 454 están vinculados a una secuencia de 10 nucleótidos (MID) - Identificador múltiple., 4 nucleótidos de "unión" y 25 nucleótidos de " secuencia universal ", de acuerdo con las instrucciones del fabricante (no se muestra en la tabla). Ex, Exon; Fw, adelante; Rv, Reverse. Descargar archivo CSV CSV
454: Next Generation Sequencing.
Análisis de secuencias de
EGFR
exón 18, 19, 20 y 21 se llevó a cabo con el secuenciador 454 GS-Junior de nueva generación (Roche Diagnostics , Mannheim, Alemania), de acuerdo con protocolos establecidos (http://www.454.com/).
Brevemente, estos incluyen las siguientes etapas: amplificación por PCR de la secuencia diana, la purificación de los fragmentos amplificados, emulsión PCR, y la recuperación de los productos de la PCR de emulsión que a continuación se cargan en el Titanium PicoTiterPlate (Roche Diagnostics) de el instrumento 454 GS junior pirosecuenciación masiva en paralelo. Los cebadores para la ejecución inicial de amplificación se modifican con secuencias de cola universales y múltiples identificadores (MID) nucleótidos (Integrated DNA Technologies Inc, www.idtdna.com). Un par específico de secuencias MID identifica unívocamente cada muestra (secuencia diana).
En
EGFR
análisis de la mutación se definió el siguiente formato de flujo de trabajo, utilizando los cebadores que se muestran en la Tabla 1 para analizar los exones 18- 19-20-21. Aproximadamente 10 ng de DNA genómico fueron amplificados para cada exón. Todas las reacciones de PCR se realizaron usando un FastStart High Fidelity Taq polimerasa (Roche Diagnostic, Mannheim, Alemania). En cada serie de secuenciación se analizaron 100 a 120 diferentes secuencias diana para la pirosecuenciación paralelo. Esto nos permitió estudiar 25-30 casos por cada plazo, ya que los cuatro
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exones fueron evaluados en todos los pacientes, con un número putativo de aproximadamente 700 lecturas por objetivo, según las especificaciones del fabricante (http: //. www.454.com/)
Teniendo en cuenta que cada secuencia diana - exón y específica del paciente - se identifican de forma unívoca por un par específico de los MID, por lo menos 5 cebadores directos y al menos 6 cebadores inversos con los MID fueron únicas necesario analizar 30 casos en el mismo plazo (o viceversa por lo menos 6 cebadores directos y al menos 5 unidades inversas). Utilizamos los sistemas de la red por cada
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exón para identificar la asociación única entre las parejas MID y secuencias diana específicas (ver Figura 1). Tanto hacia delante como secuencias de la cadena inversa ( "lee") fueron evaluados después de la amplificación paralela del ADN diana. Las secuencias obtenidas se analizaron con el software amplicón variante Analyzer (AVA) (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). variaciones de nucleótidos sólo se observan en ambas cadenas se consideraron para la llamada mutacional. base de las llamadas ambiguos asociados a tramos de homopolímero de 4 pares de bases o ya no se consideraron mutados debido a las limitaciones de la química de pirosecuenciación que es utilizado por 454 NGS para el análisis de secuencias [47,48].
Para garantizar que en una secuenciación de próxima generación dada 454 ejecuta una secuencia diana específica se asocia con un único par de MID se utilizó esquemas de la red; Se ilustran los pares MID para el exón 18 de EGFR; números romanos indican muestras de pacientes individuales. Ex, Exon; Fw, adelante; Rv, Reverse
Sensibilidad analítica
La sensibilidad analítica de nuestro formato de flujo de trabajo para la secuencia 454
EGFR
análisis mutacional se puso a prueba mediante dilución en serie (1:.. 1 , 1: 2, 1:10, 1: 100, 1: 1000) de ADN de un grupo de muestras que albergan un polimorfismo de nucleótido homocigotos G & gt; a en la posición 2470 de la
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secuencia (c2470 G & gt; a , CAG CAA, el exón Q787Q 20) en un charco de muestras que no albergan la sustitución de nucleótidos (c2470, CAG). Cada análisis se repitió al menos dos veces.
cantidad mínima de ADN de entrada en el umbral de sensibilidad analítica.
El ADN de entrada en el umbral de sensibilidad analítica se diluyó en serie en H
2O para determinar la cantidad mínima de ADN necesaria para la detección de mutaciones
454:.. Siguiente Generación de Secuenciación reproducibilidad
reproducibilidad entre ensayos (es decir, la consistencia de los resultados con el mismo protocolo en diferentes carreras) se ensayó repitiendo el análisis de la secuencia de ADN de 20 muestras que fueron previamente caracterizadas por su
EGFR
estado mutacional (11 casos de tipo salvaje y 9
EGFR
ha mutados queridos - 7 con una deleción en el exón 19, uno con la L858R y una con las mutaciones T790M).
Resultados
Rendimiento del protocolo de secuenciación de nueva generación 454
La sensibilidad analítica y definición del umbral de llamada mutacional.
La sensibilidad analítica de 454 NGS depende del número total de lecturas que se pueden obtener para una muestra dada. Siguiendo el protocolo de formato de la secuencia 454, que se dirige a un número putativo de aproximadamente 700 lecturas por amplicón, hemos probado una serie (1: 1, 1: 2, 1:10, 1: 1000: 100, 1) dilución de ADN con la c 0.2470 G & gt; una sustitución de nucleótidos en el sitio polimórfico 2470 de la
EGFR
secuencia de genes en un grupo de ADN humano sin la sustitución (c.2470 G)
el c.2470 G & gt. ; una sustitución se detectó consistentemente a una dilución 1: 100 sólo si al menos 10 c.2470 consensual G & gt; a de nucleótidos lee se obtuvieron después de paralelo 454 secuenciación. Esta observación se ilustra en la figura 2. Con una dilución 1: 100 de c.2470 G & gt; Se observó una DNA la sustitución de nucleótidos cuando el número total de lecturas fue 2,359, correspondiente a 23 c.2470 consensual G & gt; A secuencias (Figura 2D ). No se observó cuando el número total de lecturas era 750, que habría correspondido a 7 c.2470 consensual G & gt; A secuencias (Figura 2E). El c.2470 G & gt; A sustitución también no se observó con una dilución 1: 1000, incluso cuando el número total de lecturas analizado fue muy alta (entre 3.000 y 4.000), pero no lo suficiente para llegar a 10 c.2470 G & gt; A lee que habría requerido un total de 10.000 lecturas por amplificación (Figura 2F)
AF) el c.2470 polimórfica G & gt; se observó una sustitución con las siguientes diluciones de ADN no portadores del polimorfismo:. 1: 1 ( a), 1: 2 (B), 1:10 (C), 1: 100 (D), pero no a 1: 1000 (F). En 1: 100 dilución, el c.2470 G & gt; Se observó una sustitución cuando el número total de lecturas permitió detectar al menos 10 lee con el c.2470 G & gt; A cambio (esto significa que al menos 1,000 Total de Lecturas) (D). El c.2470 G & gt; Una sustitución no se observó cuando el número total de lecturas no fue suficiente para detectar al menos 10 lee con el c.2470 G & gt;. Un cambio (E) guía empresas
Sobre la base de estas observaciones que establecimos como criterios para definir una muestra mutados la identificación de la mutación en al menos 10 lecturas (i)
y
en al menos 1% del número total de lecturas analizado (ii). El requisito de 10 consensual lee hace que los criterios para la llamada mutacional más estrictas para las muestras que generan un total de lecturas inferiores a lo esperado, lo que garantiza la especificidad de los resultados.
La cantidad mínima de ADN de entrada en la analítica umbral de sensibilidad
la cantidad de ADN requerido para detectar c.2470 G & gt; a de ADN en el umbral de sensibilidad analítica de 1% (1: 100 c.2470 G & gt; a la dilución de ADN). se disminuyó en serie a partir de 10 ng , para determinar el ADN de entrada mínima necesaria para detectar la sustitución de nucleótidos. Una cantidad mínima de 2 ng de ADN era suficiente para obtener consistentemente ADN amplificable y detectar el c.2470 G & gt; A sustitución. Teniendo en cuenta que cada célula diploide humano contiene 7 pg de ADN, 2 ng de una dilución 1: 100 de c.2470 G & gt; A de ADN en el ADN c.2470_G corresponde a la detección de aproximadamente 4 células mutadas en un total de 200 células sin la mutación, en el supuesto de que la mutación es heterocigoto y
EGFR
dysomic.
reproducibilidad
.
para evaluar la reproducibilidad de la secuencia 454 en paralelo se utilizó 20 muestras de ADN previamente caracterizadas por su
EGFR
estado mutacional: 11 eran
EGFR
tipo salvaje, 7 tenían una deleción del exón 19, y uno cada uno tenía una mutación L858R-exón 21 y una mutación T790M-exón 20. Cada muestra se repitió dos veces con 454 NGS y en todos los casos se confirmó el estado mutacional. En las muestras que albergaban
EGFR mutaciones
el porcentaje de lecturas variadas mutado en promedio 2,6% (variación media del 1,45%, rango 0. 6% - 8,6%)
El diagnóstico anatomopatológico y la evaluación microscópica de. celularidad tumoral en no pequeñas muestras de carcinoma de pulmón de células
se estudiaron Ochenta casos. diagnósticos patológicos se resumen en la Tabla 2. Cincuenta y seis de los 80 casos fueron lesiones pulmonares primarios diagnosticados como adenocarcinoma (n = 33) o NSCLC no especificado (NOS) (n = 23). Veintidós muestras fueron de metástasis tumorales: 18 en los ganglios linfáticos, 2 en la pleura, y 2 en el hueso. Dos muestras de citología fueron preparados a partir de derrame pleural.
Diagnóstico muestras de biopsia
Número de células neoplásicas
a
enriquecimiento de células tumorales
N = 1414 Adenocarcinoma848-42,504 (mediana: 11.828) 15-80% (mediana: 60,0%)
9 primaria
5Metastasis (LN 3, hueso 2)
Citología SamplesDiagnosisNumber de células neoplásicas
b
tumor de células enrichmentN = 66190-730,000 (mediana: 11.200) 5-80% (mediana: 42,5%) 38 Adenocarcinoma952-228,150 (mediana: 3.956) 10-80% (mediana: 32,5%)
24Primary
12Metastasis (LN 10, pleura 2)
2 derrame pleural
28 NSCLC190-730,000 (mediana: 18.000) 5-80% (mediana: 50,0%)
23Primary
5 Metástasis (LN 5)
SamplesDiagnosisNumber total de células neoplásicas
a
,
b
células tumorales enrichmentN = 80190-730,000 (mediana: 17.400) 5 -80% (mediana: 50,0%) 52 Adenocarcinoma848-228,150 (mediana: 5.000) 10-80% (mediana: 45,0%)
33 primaria
17Metastasis (LN 13, pleura 2, hueso 2)
2 derrame pleural
28 NSCLC190-730,000 (mediana: 18.000) 5-80% (mediana: 50,0%)
23Primary
5 Metástasis (LN 5)
Tabla 2. datos Clinicopathological de muestras analizadas
a
Número de células neoplásicas se evaluó en todas las 14 muestras de biopsia.;
b
Número de células neoplásicas se evaluó en 39 de 66 muestras de citología; estimación cuantitativa de la proporción de células neoplásicas se realizó en todos los 80 casos. LN, de ganglios linfáticos; CPNM, no pequeñas carcinoma de pulmón. CSV Descargar
Los resultados de la evaluación de la celularidad del tumor se resumen en la Tabla 2 y se ilustran en la Figura 3. La proporción de células neoplásicas /se evaluó en todos los casos CSV número total de células (es decir, el enriquecimiento de células tumorales). Los porcentajes de células neoplásicas variaron de 5 a 80% (media de 45,2%, la mediana 50,0%). En 35 muestras de la proporción de células neoplásicas fue de menos de 40%. En medio de los casos la proporción de células neoplásicas fue de menos de 50%. El número total de células neoplásicas en la muestra sometida a
EGFR
análisis mutacional se estimó en 53 casos. Que oscilaba entre 190 y 730.000 (media de 68.147, la mediana 17.400). Una estimación numérica de enriquecimiento de células tumorales y del número total de células neoplásicas analizadas con respecto a
EGFR
estaba disponible mutación en todos menos en dos casos con resultados discrepantes entre Sanger y secuenciación de próxima generación (ver más abajo).
a) muestra de citología de una mujer 72 años con adenocarcinoma metastásico a un nodo linfático mediastinal (mayo Grumwald Giemsa, aumento de 200X, 600X inserción); la proporción de células neoplásicas en la muestra es 35%; El análisis de ADN era de tipo salvaje después de la secuenciación de Sanger, pero NGS mostró dos
EGFR
mutaciones (G721W, R831H) (caso 57 de la tabla 5). B) muestra de biopsia de un hombre de 65 años de edad con adenocarcinoma metastático al hueso (cuerpo vertebral) (hematoxilina y eosina, aumento de 200X, 600X inserción); la proporción de células neoplásicas en la muestra es 5%; El análisis de ADN era de tipo salvaje después de la secuenciación de Sanger, pero NGS mostró la L858R
EGFR
mutación (caso 80 de la tabla 5).
EGFR estado mutacional
secuenciación de Sanger .
Los resultados de la secuenciación de Sanger se resumen en las Tablas 3, & gt; se identificaron 4 y 5 y se ilustra en las figuras 4 y 5. Las mutaciones en 14 de 80 casos (17,5%) utilizando la secuenciación de Sanger. Se identificaron un total de 15 mutaciones: 10 eran exón 19 supresiones, 3 eran L858R (exón 21), uno era G719A (exón 18) y uno era una mutación T790M (exón 20). En un caso hubo una doble mutación T790M y L858R. Se encontraron mutaciones en 9 de 52 (17,3%) casos diagnosticados de adenocarcinoma y en 5 de 28 muestras (17,8%) de citología que no podría estar más lejos subtipificados y fueron diagnosticados como NSCLC. Fueron encontrados en 3 de 14 (21,4%) muestras de biopsia y en 11 de 66 (16,7%) muestras de citología secuenciación de Sanger detectaron mutaciones en un amplio rango de número de células neoplásicas. Una deleción del exón 19 (del L747-A752) fue identificado en la muestra con el menor número de células neoplásicas en nuestra serie (190 células neoplásicas). Sin embargo, en todos los casos en que detecte la secuenciación Sanger
EGFR mutaciones
la proporción de células neoplásicas en la muestra fue & gt; 40% (Tabla 3, las Figuras 4 y 5)
muestras de biopsia
número de casos mutados
total de mutaciones observado
Las mutaciones observadas en las muestras con & gt;. 40% de las células neoplásicas
mutaciones observadas en las muestras con & lt; 40% de las células neoplásicas
Sanger (%) guía empresas
NGS (%)
Sanger
NGS
Sanger
NGS
Sanger
NGS
N=14 3 (21.4)
una página 6 (42,9)
b
494
una página 8
b
01
Del Ex19
2
2
2
2
2
2
0
0
L858R
1
2
1
2
1
1
0
1
Other MutS.
1