Extracto
fibroblastos asociados al cáncer (CAF) juegan un papel crucial en la regulación de la progresión del cáncer, sin embargo, el factor determinante molecular que gobierna el papel regulador del tumor de la CAF sigue siendo desconocido. Utilizando un modelo de melanoma de ratón en el que se injertaron células de melanoma exógenos en la piel de dos líneas de ratones, donde la activación genética o inactivación de Notch1 señalización específicamente se produce en los fibroblastos del estroma huésped natural, hemos demostrado que la actividad de la vía Notch1 podría determinar el tumor de promoción o fenotipo tumoral de supresión en la CAF. CAF que porta elevada actividad de Notch 1 inhibió significativamente el crecimiento del melanoma y la invasión, mientras que aquellos con un Notch1 nula promovieron la invasión del melanoma. Estos hallazgos identifican la vía de Notch 1 como determinante molecular que controla la función reguladora de la CAF en el crecimiento del melanoma de la piel y la invasión, desvelando Notch1 señalización como una posible diana terapéutica para el melanoma y otros tumores sólidos potencialmente
Visto:. Shao H , R Kong, Ferrari ML, Radtke F, AJ Capobianco, Liu ZJ (2015) Notch1 Camino Actividad Determina la función reguladora de los fibroblastos asociados al cáncer en el crecimiento del melanoma y la invasión. PLoS ONE 10 (11): e0142815. doi: 10.1371 /journal.pone.0142815
Editor: Claudia Daniela Andl, Universidad de Vanderbilt, Estados Unidos |
Recibido: 18 Agosto, 2015; Aceptado: 27 Octubre 2015; Publicado: 12 Noviembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Shao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Programa de Bankhead-Coley Investigación del cáncer (Premio#09BN-11), la Asociación de cáncer de las mujeres y los fondos internos de la Universidad de Miami a la Z .. Liu
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
CAF son los fibroblastos del estroma que residen dentro y en las inmediaciones de la masa tumoral. Se derivan principalmente de fibroblastos inactivos locales activados y reclutados en circulación las células madre mesenquimales de médula ósea (MSC) [1,2]. CAF están involucrados en la regulación de la progresión del tumor mediante la obtención de factores solubles, de la matriz extracelular (ECM) [3] y los exosomas [4]. Su contribución a tumores malignos primarios y secundarios [5,6], así como la participación en la resistencia a fármacos y la recurrencia del tumor [7,8] hacer CAF objetivos potenciales para las intervenciones terapéuticas en el microambiente tumoral (TME). A pesar de la evidencia extensa apoyo a la función de regulación del tumor crucial de la CAF, cómo se determina el papel sigue siendo un misterio. Nosotros y otros observado anteriormente que la actividad de la vía Notch 1 se correlaciona inversamente con la de los fibroblastos. actividad de la vía de Notch es baja en la proliferación de fibroblastos, mientras que la alta en fibroblastos inactivos [9]. La pérdida de
Notch1
en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) resultó en la tasa de crecimiento celular y la motilidad más rápido, mientras que el crecimiento de células retardado de activación Notch1 y la motilidad de los fibroblastos humanos [9]. Por ello, la activación de Notch induce la detención del ciclo celular y la apoptosis en MEF [10]. En los modelos de xenoinjerto de ratón tumorales, co-implantado experimentales fibroblastos dérmicos humanos que llevan alta actividad Notch1 inhibió el crecimiento del melanoma y la angiogénesis [11], lo que demuestra que la activación Notch1 confiere un fenotipo de tumor supresor sobre CAF experimental. Estos resultados sugieren un papel crucial para la señalización de Notch en la función de los fibroblastos de gobierno. Sin embargo, los fibroblastos investigados en estos estudios anteriores no son reales o CAF natural. Aquí hemos utilizado nuevos modelos de ratón para explorar el papel de la señalización Notch 1 en la determinación de la función reguladora del huésped natural CAF en el crecimiento del melanoma y la invasión.
Materiales y Métodos
Ratones
Notch1
se describieron loxP /loxP
ratones [12].
ROSA
LSL-N1IC + /+ gratis (# 008159) y
FSP1
.
Cre
+/- ratones gratis (# 012641) fueron adquiridos de The Jackson Lab (Bar Harbor, ME). Todos estos ratones tienen un fondo C57BL6. La ganancia de la función de Notch 1 (GOF
Notch1:.
FSP1
Cre
+/-
;
ROSA
LSL-N1IC + /+
) y la pérdida de la función de Notch 1 (LOF
Notch1:.
FSP1
Cre
+ /-
; + /+) líneas
Notch1
LoxP /LoxP fueron generados por el cruce
ROSA
LSL-N1IC + /+ y
Notch1
loxP /loxP + /+
con
FSP1
.
Cre
+/-
ratones, y cruzando posteriormente
FSP1
Cre
+/-
;.
ROSA
LSL-N1IC +/-
con
ROSA
LSL-N1IC + /+ ratones y
FSP1
.
Cre
+/-
;
Notch1
loxP /loxP +/- con
Notch1
loxP /loxP + /+ ratones
, respectivamente. GOF
ctrl (
FSP1
Cre
- /-
;. ROSA
LSL-N1IC + /+) y LOF
ctrl (
FSP1
Cre
- /-
;. Notch1
LoxP /LoxP + /+ ) ratones fueron utilizados como control. Los ratones se mantuvieron en las instalaciones de animales DVR en condiciones estándar. Los ratones fueron anestesiados para todos los procedimientos quirúrgicos por mezcla de ketamina /xilazina (100/10 mg /kg, IP), y los procedimientos de formación de imágenes por la inhalación de 3% de gas isoflurano, y se sacrificaron en la cámara de CO2. Cuidado de Animales institucional y el uso comité de la Universidad de Miami aprobaron todos los procedimientos con animales.
Ratón modelo de piel del melanoma
murino células de melanoma B16-F10 (ATCC
®, CRL-67345
TM), establemente transducidas con luciferasa 2 (Luc2) /lentivirus, se cultivaron con DMEM completo. Para los experimentos de injerto del tumor, 5 x 10
se inocularon 5 Luc2 células
+ /B16-F10 suspendidas en 0,1 ml de solución salina (
s
.
c
.
)
en la piel dorsal de 6 semanas de edad GOF
Notch1 vs. GOF
ctrl y 8 semanas de edad LOF
Notch1 vs. LOF
ctrl ratones. B-16-F10 se derivan de C57BL6 ratón y puede ser xenoinjertado en los ratones GOF, LOF y control creados que tienen un fondo C57BL6. Los ratones se sacrificaron en la semana 3 después del injerto. se pesaron los tumores resecados. el crecimiento del melanoma se evaluó basado en el peso del tumor y la positividad de Ki67 marcador de proliferación celular medida por inmunofluorescencia en las células tumorales, mientras que la invasión local del melanoma se evaluó por la evaluación histológica de secciones de tejido de melanoma resecado.
Histología, inmunofluorescencia (IF) &erio; Western blot
H & amp; E y se realizaron SI como se describe [11]. Anticuerpos reconocen activan Notch1, Hes1, Ki67, Luc (ab8925, ab71559, ab15580, ab81823, Abcam, Cambridge, MA), Hey-1, y FSP1 (GTX42614, GTX89197, GeneTex, Irvine, CA). Los núcleos se tiñeron con DAPI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Cuantificaciones son la media ± desviación estándar (DE) de los recuentos de 5 campo de la energía baja (LPF) por muestra del tumor para H & amp; E tinción, y 5 campo de alta potencia (HPF) por sección y la sección 5 /tumoral para la tinción SI. Por transferencia Western, las muestras de tejido de piel se homogeneizaron en un tampón RIPA (50 mM Tris-Cl, 150 mM de cloruro de sodio 1,0% NP-40, desoxicolato de sodio 0,5%, 0,1% SDS, pH 8,0, EDTA 1 mM y cóctel inhibidor de proteasa ( Roche)). La suspensión de tejido se hizo girar a 4 ° C durante 30 min. Se recogieron los sobrenadantes después de centrifugación a 13.000 rpm durante 15 min. La concentración de proteína se determinó utilizando Pierce
TM BCA Protein Assay Kit (# 23225). Western blot se llevó a cabo como se describe [11]. La expresión del mutante N1
IC (muN1
IC, 59Kd) y la supresión de Notch1 en la piel de ratones fueron detectados por dos anticuerpos diferentes contra el Notch1, respectivamente (ab8925 y ab52627, Abcam).
La bioluminiscencia formación de imágenes de IVIS
D-luciferina se inyectó por vía intraperitoneal 15 minutos antes de la imagen (150 mg /kg). Todo el cuerpo de los ratones anestesiados fueron escaneados utilizando IVIS 200B (PerkinElmer, Waltham, MA) con una captura de 1 minuto, binning medio. señal de bioluminiscencia se cuantificó y se expresa como la emisión de luz total dentro de la región de interés (fotones /s).
Lentivirus y la transducción de células
Luc2
+ /vector lentiviral se construyó insertando
Luc2
ADNc en
pLenti6 gratis (Invitrogen) vectores. Producción de lentivirus y la transducción de células se realizaron como se describe [13].
El análisis estadístico
Los datos fueron analizados estadísticamente utilizando de Student de dos colas
t-test y expresó
como la media ± desviación estándar. Los valores se consideraron estadísticamente significativas cuando
p Hotel & lt; 0,05
Resultados
activación Notch1 en la CAF suprime el crecimiento del melanoma
La expresión de proteínas de fibroblastos específica. -1 (FSP1, también llamado S100A4) está generalmente restringido a fibroblastos [14,15].
FSP1
.
Cre
ratones fueron utilizados con éxito para crear alelos nulos en los fibroblastos para el tipo II de receptores TGF [16], los receptores EP4 [17], y PTEN [18]. Hemos creado el 1
er par de GOF
Notch1 vs. GOF
ctrl ratones. GOF
Notch1 ratones eran viables hasta empleado en los experimentos de injertos de piel melanoma plazo de dos meses. Su apariencia corporal y tejido de la piel histología, incluyendo la dermis, donde residen principalmente fibroblastos de la piel, parecía normal (Fig S1 A).
Para examinar el papel de la CAF con alta actividad Notch 1 en la regulación del crecimiento de melanomas, 5 x 10
se inocularon células 5 + /B16-F10 Luc2 sobre la piel del GOF
Notch1 vs. GOF
ctrl ratones. En este modelo, los componentes celulares de toda estroma tumoral, incluyendo la CAF, se componen de células huésped naturales. metástasis tumoral se controló por todo el cuerpo IVIS de exploración en la semana 3 inoculaciones tumorales puesto. tumores de la piel fueron resecados, ponderan y se sometieron a análisis inmunohistoquímico después de IVIS de exploración
.
SI tinción de secciones de piel retratada confinado y elevada expresión de N1
IC en los núcleos de FSP1
+ fibroblastos de GOF
Notch1 ratones en comparación con GOF
ctrl ratones (figura 1A), pero no en las células musculares de la piel adyacentes (en particular, las células musculares presentan autofluorescencia todavía no hay señales nucleares fueron detectables). Del mismo modo, la expresión HEY1 se incrementó en los núcleos de FSP1
+ fibroblastos de la piel de ratones GOF
Notch1 relación con GOF
ctrl ratones (Fig S1B). Por otra parte, la expresión de la proteína N1
IC mutante codificado del gen (muN1
IC: PLAGAS dominio truncado N1
IC, 59 Kd, (
ROSA
LSL -N1IC + /+
, The Jackson Lab:#008159)) en la piel de ratones GOF
Notch1 fue confirmada por Western Blot (figura 1B). Estos resultados demostraron eficiente expresión específica mediada por Cre de N1
IC y la activación de la vía de Notch en los fibroblastos de la piel.
A. Imágenes representativas muestran la expresión de N1
IC en los núcleos (puntas de flecha apuntando) de FSP1
+ fibroblastos de la piel de GOF
Notch1 vs. GOF
ctrl ratones. B. Expresión de los transgenes codificados muN1
IC (59 Kd) en la piel de GOF
Notch1 ratones se detectó por Western Blot. ß-actina se utilizó como control de carga. C. el crecimiento del melanoma se retarda en GOF
Notch1 ratones (n = 8 /grupo). se muestran cinco imágenes representativas de los tumores resecados /grupo. D. sustancialmente menor Ki67
+ células tumorales (Luc2
+) por HPF en el melanoma de GOF
Notch1 que los ratones GOF
ctrl. E. actividad proliferativa de las células de melanoma (Ki67
+) es particularmente bajo en la zona (marcado) adyacente a la CAF (FSP1
+) en ratones GOF
Notch1. Cuantificaciones son conteos de 5 HPF por sección y la sección 5 /tumor. Los datos fueron analizados estadísticamente utilizando de Student de dos colas
t-test
y se expresan como la media ± SD.
el crecimiento del melanoma en GOF
Notch1 ratones fue significativamente retrasados en comparación a la de GOF
ctrl ratones (figura 1C). Consistentemente, hubo sustancialmente menos Ki67
+ células tumorales (Luc2
+) en los tejidos de melanoma de GOF
Notch1 que de GOF
ctrl ratones (Figura 1D). La actividad proliferativa (Ki67 positividad) de células de melanoma era particularmente débil cuando adyacente a CAF (Fig 1E), lo que sugiere que CAF llevar alta actividad Notch1 en GOF
ratones Notch1 podrían liberación del factor (s) supresor tumoral. Estos resultados demostraron que la activación Notch1 confiere un fenotipo de tumor supresor sobre CAF.
activación Notch1 en CAF suprime melanoma invasión
Desde propagación de las células de melanoma debe interactuar con fibroblastos localizados en la dermis de la piel (y en la proximidad de melanoma injertado), los fibroblastos puede tener un impacto significativo en la difusión melanoma. A continuación, estudiamos el efecto de la CAF en la invasión y la metástasis de melanoma en ratones GOF
Notch1. Melanoma invasión local se evaluó por la evaluación histológica de secciones de tejido de melanoma resecado. H & amp; E tinción de los tejidos de melanoma resecado de manifiesto que el 83,3% de los melanomas tenía invasión local en los tejidos adyacentes de la piel en ratones GOF
ctrl en comparación con el 22,2% en GOF
Notch1 ratones (Figura 2A). Sin embargo, la exploración de IVIS de todo el cuerpo y los órganos cosechados, incluyendo pulmón, el hígado, el bazo, el riñón y el fémur, no dió señales luminiscentes medibles (datos no mostrados), lo que sugiere que no hay metástasis a distancia se produjo en el momento de nuestro ensayo. SI revelado que la CAF en cápsula del tumor presentaba menor actividad proliferativa (células menos Ki67
+ /FSP1
+) en GOF
Notch1 que en GOF
ctrl ratones (Figura 2B & amp; 2C). Estos datos indican que la CAF en GOF
Notch1 ratones son menos apoyo a la invasión del melanoma.
A.
Izquierda
: disminución de la invasión tumoral en GOF
Notch1 en comparación con los ratones GOF
ctrl.
Derecho
: dos representantes de H & amp; E imágenes de las secciones del tumor (n = 8 /grupo). líneas discontinuas indican los límites del tumor. Las flechas apuntan a la invasión de células tumorales. Porcentaje de la invasión se basa en los resultados de H & amp; E tinción en los campos de baja potencia (LPF) de cada sección del tumor. B. Los fibroblastos de la cápsula del melanoma tienen una menor actividad proliferativa (menos Ki67
+ /FSP1
+ células) en GOF
Notch1 que en los ratones GOF
ctrl. C. La cuantificación de Ki67
+ fibroblastos /HPF en la cápsula del melanoma de GOF
Notch1 (barra de color negro) vs.
ctrl (barra blanca) ratones GOF. Los resultados son los recuentos de 5 HPF por sección y la sección 5 /tumor. Los datos fueron analizados utilizando
t-test
y se expresan como la media ± SD.
Null
Notch1 Hoteles en CAF no afecta el crecimiento del melanoma de Student de dos colas
Para estudiar el papel de la CAF con nula Notch 1 en la regulación del crecimiento y la invasión del melanoma, creamos las 2
nd par de LOF
Notch1 vs. LOF ratones
ctrl. ratones LOF
Notch1 también eran viables en todos los experimentos de injertos de piel melanoma y su apariencia corporal y tejido de la piel histología parecían normales (Figura S2A).
N1
IC y Hes1 fueron indetectables en FSP1
+ fibroblastos de la piel de LOF
ratones Notch1 mientras que un poco detectable en la piel de LOF
ctrl ratones (figura 3A, la figura S2 B). N1
IC también era indetectable en los fibroblastos en la cápsula de melanoma en LOF
ratones Notch1 (células de melanoma expresan altos niveles de N1
IC como se informó anteriormente [13], que sirve como un control interno para N1
IC expresión), pero marginalmente detectable en LOF
ctrl ratones (figura 3B). Estos datos indican el estado inactivado de la señalización Notch 1 causada por
Notch1
deleción en fibroblastos de LOF
ratones Notch1 vs estado del nivel basal de señalización Notch 1 en fibroblastos de
ctrl ratones LOF. Además, el análisis de transferencia Western validado eliminación exitosa de Notch1 en los fibroblastos de la piel de ratones LOF
Notch1. La expresión de larga duración de Notch 1 (271Kd) fue indetectable en LOF
ratones Notch1, aunque hubo una ligera presencia de N1
IC (120 kD) (Figura 3C). Los niveles marginales de N1
IC en la piel de LOF
ctrl ratones se atribuyen a la presencia de N1
IC en los no fibroblastos en el tejido de la piel.
A. vs. indetectable marginalmente detectable expresión N1
IC en los fibroblastos de la piel de LOF
Notch1 vs. LOF
ctrl ratones. Las puntas de flecha apuntan a la tinción nuclear de N1
IC en los fibroblastos. B. No detectable vs. detectable N1
IC como se ha señalado por la flecha en fibroblastos de la cápsula en el melanoma LOF
Notch1 vs. LOF
ctrl ratones. C. No detectable de longitud completa de la proteína Notch 1 (271Kd) y una ligera cantidad de N1
IC (120 Kd, lo que probablemente fue presentado en los no fibroblastos) en el tejido de la piel de LOF
ratones Notch1 se exhibió por análisis de Western Blot . ß-actina se utilizó como control de carga. D. crecimiento del melanoma es comparable en LOF
Notch1 y LOF
ctrl ratones (n = 8 /grupo). Cinco imágenes representativas de tumores /grupo se mostraron. E. Los números de Ki67
+ células tumorales son comparables en LOF
Notch1 (barra de color negro) y LOF
(barra blanca) ratones ctrl. Cuantificaciones son conteos de 5 HPF por sección y la sección 5 /tumor. Los datos fueron analizados estadísticamente utilizando de Student de dos colas
t-test
y se expresan como la media ± SD.
Para investigar el papel de la CAF con la actividad baja o nula en la regulación de Notch1 la progresión del melanoma, 5 x 10
se inocularon 5 Luc2 células
+ /B16-F10 (
s
.
c
.) en la piel dorsal de 8 semanas de edad LOF
Notch1 vs. LOF
ctrl ratones. injerto de piel melanoma y la medición de crecimiento tumoral, la invasión y la metástasis se llevaron a cabo de forma idéntica como se describió anteriormente. Los tamaños de los injertos de tumor resecado de LOF
Notch1 son comparables a la de LOF
ctrl ratones (Fig 3D). Consistentemente, no hubo diferencia significativa en el número de Ki67
+ células tumorales (Luc2
+) dentro de los tejidos de melanoma (Figura 3E) en LOF
Notch1 vs. LOF
ctrl ratones. Estos resultados mostraron que la CAF en LOF
ratones Notch1 tiene poco efecto sobre el crecimiento de piel no melanoma.
CAF promueve la invasión de melanoma en LOF
ratones Notch1
Por el contrario, el melanoma injertado había aumentado tasas de invasión locales en LOF
Notch1 (75%) ratones que en LOF
ctrl (30%) ratones (Fig 4A) como evaluada por evaluación histológica de secciones de tejido de tumor resecado, lo que indica que CAF promover la invasión de melanoma en LOF
ratones Notch1. Consistentemente, los fibroblastos que rodean al tumor en LOF
ratones Notch1 exhibieron una actividad más fuerte (más Ki67
+ /FSP1
+ células) que en LOF
ctrl ratones (Figura 4B), lo que sugiere que la CAF son más activo y puede favorecer la invasión de melanoma en LOF
ratones Notch1. No es sorprendente, sin metástasis distante era detectable en ambos grupos de ratones (datos no mostrados), ya que la incidencia de metástasis espontánea de las células B16 injertados es muy baja en el modelo de melanoma murino singénico. Se necesita típicamente la resección del tumor primario con el fin de la formación de metástasis a distancia que se produzca [19]. Alternativamente, puede ser insuficiente para un ciclo completo de la metástasis que se completará dentro del marco de tiempo (3 semanas) de nuestros experimentos. En general, nuestros resultados demuestran que la supresión de
Notch1 Hoteles en CAF aumenta su efecto regulador sobre la invasión de melanoma.
A.
izquierda: aumento de la invasión del melanoma en la piel de LOF
Notch1 vs. LOF
ctrl ratones (n = 8 /grupo).
Derecho
: dos representantes de H & amp; E se muestran las imágenes de las secciones del tumor por grupo. líneas discontinuas indican los límites del tumor. Las flechas apuntan a la invasión de células tumorales. Porcentaje de la invasión se basa en los resultados de H & amp; E tinción en LPF de cada sección del tumor. B. Null Notch1 CAF, que rodean los tumores presentan una mayor actividad proliferativa como más Ki67
+ /FSP1
+ células son detectables en LOF
Notch1 que en LOF
ctrl ratones. C. La cuantificación de Ki67
+ fibroblastos /HPF en cápsulas de melanoma LOF
Notch1 (barra de color negro) vs. LOF
ctrl (barra blanca) ratones. Cuantificaciones son conteos de 5 HPF por sección y la sección 5 /tumor. Los datos fueron analizados estadísticamente utilizando de Student de dos colas
t-test
y se expresan como la media ± SD.
Discusión
El injerto de células B16-F10 sobre la piel de GOF
ratones
Notch1 y LOF Notch1 ofrecen modelos de melanoma murino singénico únicas para descifrar papel de Notch1 señalización en el gobierno de la función reguladora del tumor de la CAF en TME en el que la totalidad de los componentes celulares del estroma tumoral se componen de células huésped naturales . Nuestros resultados definidos Notch1 señalización como un interruptor molecular que controla la función de regulación del tumor de la CAF. Al activar este interruptor ON OFF molecular y puede conferir propiedades inversamente tumor-supresores y promotores de tumores en la CAF. Por lo tanto, la señalización Notch puede ser manipulado para poner en práctica la terapia de señalización Notch-dirigida para el melanoma, y potencialmente otros tumores sólidos. De este modo, se abre una nueva vía para apuntar TME por cualquiera de reprogramación y la conversión de la CAF de "promotores tumorales 'a' 'supresores de tumores a través de la activación de la vía de Notch 1 terapéutica o explotar directamente Notch mediador (s) aguas abajo, es decir, WISP1 [11]. Aunque hay numerosas opciones para la activación de la vía de Notch 1 en la CAF, como el uso de terapia génica o novedoso método de edición genoma, CRISPR /o Cas9 CRISPR /CPF1, para introducir
N1
IC
, o la aplicación de vía de Notch compuesto activador, que puede ser identificado a través de un método de selección de alto rendimiento similares [20], la activación de Notch1 señalización específicamente en CAF, mientras que no aumenta al mismo tiempo la actividad de Notch en células de melanoma, plantean un reto terapéutico, como la función biológica de la señalización de Notch es dependiente del contexto celular [21], y la alta actividad de Notch es oncogénico al melanoma [13]. No está claro cómo la señalización de Notch está regulada diferencialmente en células de melanoma y la CAF en un solo microambiente. También queda claro si Notch /ligandos participan en la comunicación celular entre las células fibroblastos-melanoma. Dado que una fracción significativa de CAF en el tejido tumoral se derivan de las células madre mesenquimales (MSC), una estrategia alternativa es el desarrollo de terapias basadas en células por la administración dirigida de las células terapéuticas, es decir, fibroblastos autólogos MSC derivadas de pre-ingeniería '
ex vivo de búsqueda: 'ya sea a llevar a una alta actividad Notch1 usando los métodos descritos anteriormente o sobreexpresan WISP1, en el tejido tumoral. Los fibroblastos que expresan una alta actividad de Notch tienden a someterse a la detención del ciclo celular [9,10]. Este carácter hace MSCD-SF llevar a una alta actividad de Notch más atractivo como células terapéuticas, debido a que no se expandirán irresistiblemente después de su homing a tejido tumoral y finalmente son aprobados por las células inmunes. Por lo tanto, se pueden aplicar repetidamente a los pacientes para mejorar la eficacia terapéutica
.
A diferencia de los efectos inhibitorios de la CAF en GOF
ratones Notch1 en tanto el crecimiento del melanoma y la invasión, la CAF en LOF
ratones Notch1 promueven locales invasión, pero no el crecimiento del melanoma de la piel. El mecanismo para tales efectos distintos de la CAF en GOF
ratones Notch1 vs. LOF
ratones Notch1 sigue sin estar clara. Posiblemente, las propiedades de crecimiento e invasión de melanoma están regulados por diferentes factores solubles y señales microambientales creado por la CAF. Supresión de
Notch1 Hoteles en CAF puede dar lugar a cambio de un conjunto de factores solubles y señales microambientales, que afecta preferentemente o suficientemente invasión del melanoma, pero no la propiedad de crecimiento. Por otro lado, los factores solubles y señales microambientales creado por la CAF, que determinan la propiedad del crecimiento de melanomas, pueden no ser invertidas exactamente entre GOF ratones
Notch1 y LOF
Notch1. La vía de Notch1 es hiper-activa a través de la expresión de N1
IC mutante en CAF de GOF
Notch1 ratones, que es diferente de la activación canónica, inducida por ligando Notch1 donde eliminación de Notch1 puede inversamente espejo. Esto podría explicar por qué la CAF en GOF
Notch1 ratones con retraso del crecimiento de melanomas, mientras que la CAF en los ratones LOF
Notch1 no promueven el crecimiento del melanoma. Por otra parte, otras isoformas Notch pueden compensar la pérdida de Notch1 en la CAF de LOF
ratones Notch1. Se requieren estudios adicionales para examinar los perfiles completos de factores solubles y señales microambientales determinados por diferentes CAF (CAF de GOF
Notch1 los ratones frente a la CAF de GOF
ratones Ctrl y la CAF desde LOF
Notch1 los ratones frente a la CAF de LOF
Ctrl ratones).
Otro hallazgo interesante es todavía inexplicable las tasas de invasión espontáneos distintos de células B16-F10 injertados sobre GOF
Ctrl (83,3%) frente a LOF
Ctrl ( 30%) ratones, posiblemente debido a los diferentes antecedentes genéticos de dos líneas de ratones. fibroblastos derivados de MSC de estas dos líneas de ratones de control también presentan diferentes fenotipos de regulación tumorales
in vitro
. Los fibroblastos de GOF
Ctrl ratones inducidos células de melanoma para formar esferoides mientras que los de LOF
Ctrl ratones no lo hicieron (observación no publicada).
En resumen, nos permite descubrir la vía de Notch 1 como determinante molecular que controla el papel regulador de la CAF en el crecimiento del melanoma y la invasión. Nuestro estudio pone de relieve la vía Notch1 como una diana terapéutica potencial para ser manipulado para reprogramar y convertir CAF para actuar como supresores de tumores. Estos resultados justifican el futuro estudio para dilucidar los mecanismos moleculares de la función reguladora del tumor determinado Notch1-en la CAF.
Apoyo a la Información
S1 Fig.
una apariencia imágenes representativas de GOFNotch1 y GOFCtrl. histología tejido de la piel parece normal como se examinó por H & amp; E en la semana 6. B, la expresión elevada de HEY1 en fibroblastos de la piel de los ratones en comparación con ratones GOFNotch1 GOFCtrl. Las puntas de flecha apuntan a HEY1 nucleares localizados en los fibroblastos. Anticuerpo reconoce Hey-1 fue adquirido de GeneTex (GTX42614)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0142815.s001 gratis (PDF)
S2 Fig.
una apariencia imágenes representativas de LOFNotch1 y LOFCtrl. histología tejido de la piel parece normal como se examinó por H & amp; E en la semana 6. B, la expresión Hes1 es indetectable en los fibroblastos situados en la cápsula del melanoma en ratones LOFNotch1 pero ligeramente detectable en la cápsula de los ratones del melanoma LOFCtrl. Las puntas de flecha apuntan a Hes1 nucleares localizados en los fibroblastos. Anticuerpo reconoce Hes1 fue adquirido de Abcam (ab71559)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0142815.s002 gratis (PDF)
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Omaida C . Velázquez (Universidad de Miami) para colaboraciones útiles, las consultas y discusiones.