Extracto
Introducción
En este artículo, se presenta 7 nuevos KRAS mutaciones genéticas descubiertas mientras retrospectivamente el estudio de la prevalencia y el patrón de mutaciones de KRAS en el tejido canceroso obtenida a partir de 56 pacientes con cáncer colorrectal esporádico Saudi de la Provincia del Este.
Métodos
ADN genómico fue extraído de los tejidos, colorrectales cancerosos y no cancerosos en parafina fijados con formol. El éxito de los productos de PCR y específicas fueron entonces bi-direccionalmente secuenciados para detectar el exón 4 mutaciones mientras Kits de detección Mutector II se utilizaron para la identificación de mutaciones en los codones 12, 13 y 61. El impacto funcional de las nuevas mutaciones se evaluó usando herramientas bioinformáticas y modelado molecular.
resultados
mutaciones del gen KRAS se detectaron en el tejido de cáncer de 24 casos (42,85%). De estos, 11 tenían exón 4 mutaciones (19,64%). 8 albergaban mutaciones diferentes todos los cuales, excepto dos altera la secuencia de aminoácidos de la proteína KRAS y todos, excepto uno eran novela según lo revelado por la base de datos cósmicos. Las nuevas mutaciones detectadas se encontró que eran somática. Una mutación se prevé que sea benigna. Las mutaciones restantes se predicen para provocar cambios sustanciales en la estructura de la proteína. De éstas, la mutación sin sentido Q150X es la segunda mutación truncar ser reportados en el cáncer colorrectal en la literatura.
Conclusiones
Nuestro descubrimiento de nuevos exón 4 mutaciones KRAS que son, hasta ahora, único a los pacientes con cáncer colorrectal Saudi puede atribuirse a factores ambientales y /o variaciones raciales /étnicos debido a diferencias genéticas. Alternativamente, puede estar relacionada con la escasez de estudios clínicos en las mutaciones distintas de las de los codones 12, 13, 61 y 146. Más KRAS de prueba en un gran número de pacientes de diferentes grupos étnicos, en particular más allá de los alelos de punto de acceso más comunes en los exones 2 y 3 se necesita para evaluar la prevalencia y explorar el significado pronóstico y predictivo exacto de las nuevas mutaciones descubiertas, así como su posible papel en la carcinogénesis colorrectal
Visto:. Naser WM, Shawarby MA, al-Tamimi DM, Seth A, al-Quorain A, Nemer AMA, et al. (2014) Novel KRAS mutaciones genéticas en el cáncer colorrectal esporádico. PLoS ONE 9 (11): e113350. doi: 10.1371 /journal.pone.0113350
Editor: Klaus Brusgaard, Hospital Universitario de Odense, Dinamarca
Recibido: 12 Junio, 2014; Aceptado: 22 Octubre 2014; Publicado: noviembre 20, 2014
Derechos de Autor © 2014 Naser et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue financiado por una beca de investigación sobre "K-ras, p53, EGFR y HER2 aberraciones genéticas en el cáncer colorrectal" del Decanato de la Investigación Científica de la Universidad de Dammam, Arabia Saudí (subvención#2011003). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores declaran que no existen intereses en competencia
Introducción
el desarrollo del cáncer (carcinogénesis) es un proceso de múltiples pasos que se cree que resulta de la acumulación de alteraciones genéticas en una sola célula durante la vida de un individuo. El número de genes que se encuentran asociados con diferentes tipos de cáncer está creciendo rápidamente. Los genes más frecuentemente activado son miembros de la familia de genes RAS, dos de los cuales (Harvey-H) y (Kirsten-K) se identificaron primero como homólogos a genes virales de transformación, mientras que el tercero (ANR) se identificó en un neuroblastoma humano . El producto del gen RAS es una proteína G localizado en la membrana monomérica de 21 kd que funciona como un interruptor molecular que une receptor y la activación de la tirosina quinasa no receptor a eventos citoplasmáticos o nucleares aguas abajo. Cada célula de mamífero contiene al menos tres distintas RAS Protooncogenes codificación estrechamente relacionadas, pero distintas proteínas. genes RAS pueden ser activadas por diferentes mutaciones puntuales, incluyendo aquellos codones que afectan a 12, 13, 61, o 113 a 117. La transducción de señales por las proteínas ras implica la hidrólisis de GTP, y la activación de mutaciones inhibir este proceso, el bloqueo de la proteína en el "on" señalización conformación [1]. La activación de mutaciones en estas proteínas RAS resultan en la señalización constitutiva, estimulando así la proliferación celular, y la inhibición de apoptosis.
mutaciones oncogénicas KRAS son frecuentes en prácticamente todos los tipos de cáncer, lo que hace KRAS uno de los genes más frecuentemente mutado en los cánceres humanos [ ,,,0],2]. Los oncogenes RAS, junto con el gen supresor de tumores p53, son los genes que se encuentran más consistentemente para ser mutado en el cáncer colorrectal [3] - [4] en el que las células epiteliales del progreso colon y recto de pequeño adenoma a través de gran adenoma, y finalmente se convierten adenocarcinoma [3].
Numerosos estudios han informado de la frecuencia de las mutaciones del gen KRAS en el cáncer colorrectal. La serie más grande fue el estudio "Rascal" de 2721 casos de cáncer colorrectal reportar una incidencia de 37,7% [5]. frecuencias comparables se informó posteriormente [6] - [8]
El objetivo de este artículo es dar a conocer siete nuevas mutaciones KRAS y abrir la puerta para pruebas adicionales del gen KRAS en un gran número de pacientes con el fin de evaluar el. prevalencia y explorar el significado pronóstico y predictivo exacta de las mutaciones descubiertas, así como su posible papel en la carcinogénesis colorrectal. Las nuevas mutaciones fueron descubiertos mientras retrospectivamente el estudio de la prevalencia y el patrón de mutaciones de KRAS en el tejido canceroso obtenida a partir de 56 pacientes con cáncer colorrectal esporádico saudí de la Provincia Oriental, y correlacionar estos con características clínicas, y p53, EGFR (factor de crecimiento epidérmico) y HER2 ( factor de crecimiento epidérmico humano receptor2) expresión de la proteína, y el estado mutacional del gen EGFR. No era nuestra intención de explorar todas las posibles mutaciones de KRAS que se pueden encontrar en el cáncer colorrectal, por lo que sólo se centró en las mutaciones que comúnmente están involucrados en esa enfermedad. El descubrimiento de nuevas mutaciones llegó por casualidad mientras se realiza el estudio. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio sobre el patrón de mutaciones del gen KRAS en pacientes con cáncer colorrectal Saudi.
Materiales y Métodos
Ética declaración
El estudio fue aprobado por el Comité Permanente de Ética de la Investigación en Seres Vivos (SCRELC) que es el IRB de nuestra institución (número de aprobación: IRB-2014-01-324). No fue posible obtener su consentimiento informado por escrito de los participantes ya que la mayoría de los pacientes se perdieron durante el seguimiento. Este tema fue discutido con el comité el que coincidió en que, de acuerdo con las "Directrices para la Ética Práctica de la Investigación" [9], el consentimiento no es necesario en este estudio retrospectivo como la información utilizada por los autores ya era accesible al público e hizo no revelar la identidad del paciente. Por otra parte, el estudio realizado ningún riesgo para los participantes.
Cincuenta y seis casos de carcinoma colorrectal esporádico de los pacientes de Arabia Saudita fueron recuperados de los archivos del Departamento de Rey Fahd del Hospital de la Universidad de Patología. Los casos fueron seleccionados al azar en base a la disponibilidad de los datos clínicos y los bloques de parafina de tejido representativo, suficiente para llevar a cabo los procedimientos requeridos, así como la historia familiar negativa para el cáncer colorrectal. El marco de tiempo cubierto fue de 11 años (1998-2008).
Datos clínicos y patológicos
clínica y patológica de datos que incluye el tipo histológico, grado y estadio del cáncer que se obtuvieron de los registros de los pacientes . Los datos clínicos y patológicos se clasificaron utilizando criterios de la OMS [10].
La tinción inmunohistoquímica
La tinción inmunohistoquímica se realizó para EGFR, HER2 y p53 en 4 secciones de parafina micras de espesor cortadas de bloques de carcinomatosa colorrectal tejido. La tinción se realizó en un Benchmark Ventana automatizado immunostainer de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Ventana Medical Systems Inc., Estrasburgo). Fuentes y diluciones de los anticuerpos primarios utilizados en el estudio se muestran en la Tabla S1. Las secciones immunostained se examinan bajo un microscopio de luz y evaluados de forma manual por dos patólogos. membrana definido y /o tinción citoplásmica fue necesario tener en cuenta un caso como EGFR o HER2 /neu positivo, mientras que se necesitaba tinción nuclear de al menos 10% de las células de cáncer para la positividad de p53 (Figura S1).
Genomic La extracción de ADN
Del cinco al ocho de 10 micras de espesor, fijado con formalina, secciones de tejidos cancerosos incluidas en parafina se utilizan para extraer el ADN genómico. Las secciones se desparafinaron dos veces durante 5 minutos en xileno, rehidratadas secuencialmente en 100, 96 y 70% de etanol durante 30 segundos cada uno, se tiñeron con hematoxilina durante 30 segundos, se enjuagaron con agua y se incubaron durante la noche en 1 M NaSCN a 37 ° C para eliminar cruzada campo de golf. Las láminas fueron lavadas dos veces durante 10 minutos en 1 x PBS a temperatura ambiente, y completamente seca al aire. Como se indica por un patólogo experimentado, el tejido canceroso se raspó de la superficie del portaobjetos de vidrio con un escalpelo para obtener al menos 70% de células tumorales y luego se transfiere a 2,0 ml tubos de microcentrífuga. El ADN genómico fue extraído utilizando el kit de ADN WaxFree (TrimGen, Maryland) que implementa el protocolo estándar descrito por el fabricante con la incubación durante la noche en el paso 14 del protocolo. ADN genómico extraído se cuantificó con Epok espectrofotómetro y se analizó por electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para visualizar la distribución de tamaño de ADN.
Para aquellos pacientes que exhiben novela KRAS exón 4 mutaciones, también se extrajeron el ADN genómico a partir de tejido no canceroso colorrectal tal como se describe encima. El tejido no canceroso se obtuvo de un margen de resección libre de tumor de la muestra colectomía del mismo paciente.
se aplicó la amplificación por PCR del exón 4
Secuenciación KRAS para detectar KRAS exón 4 mutaciones como kits para detección de A146T - que es la mutación del exón 4 informado de que se comúnmente involucrados en el cáncer de colon [11] - [12] - no estaban disponibles comercialmente. Un enfoque PCR anidada similar a la adoptada por Fadhil, et al [13] se llevó a cabo para amplificar y llevar a cabo análisis de fusión para el exón 4 del gen KRAS con el fin de comprobar si hay éxito las reacciones de PCR y especificidad. La primera ronda de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 25 l. Cada reacción contenía 1 × QIAGEN Multiplex PCR Master Mix, 0,5 × Q-solución, 2 pares de cebadores (Tabla 1) que cubre puntos de acceso en KRAS exón 4 con 0,3 M de concentración final de cada cebador y 10 ng de ADN molde. PCR se realizó utilizando el ciclador térmico de Veriti de ABI (Life Technologies) durante 15 minutos a 95 ° C, 40 ciclos cada uno de 30 segundos a 94 ° C, 90 segundos a 55 ° C y 90 segundos a 72 ° C, seguido de 10 minutos a 72 ° C. Después de la adición de 2 l (5 x) colorante de carga, 10 l de cada muestra amplificada se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa TBE etidio 2% teñido con bromuro de visiualized y con el sistema GelDoc de Biorad.
de alta resolución análisis de la curva de fusión (HRM) se realizó mediante reacción de PCR anidada en un volumen final de 15 l, que contenía 1 × HRM Master Mix (Qiagen) y 1 par de cebadores específicos para el exón 4 (Tabla 1) con cada cebador a 0,7 M de concentración final . La plantilla consistía en 1,5 l de una dilución 1:100 del producto de la primera reacción de ronda de PCR. reacción de PCR anidada se realizó tal como se describe en el manual de instrucciones del kit de gestión de recursos humanos Tipo-it (Qiagen).
HRM se utiliza para evaluar las características de ADN de doble cadena (dsDNA) de disociación (fusión). composición de pares de bases GC y la influencia contenido comportamiento de los diferentes fragmentos de ADN de doble cadena fusión. Durante HRM, dsDNA se expone a aumentar gradualmente la temperatura en presencia de un colorante fluorescente (por ejemplo EvaGreen). El colorante fluorescente emite fluorescencia solamente cuando se unen al ADN de doble cadena. La fluorescencia se monitoriza durante la transición de ADN de doble cadena en el ADN de cadena sencilla (ssDNA), que disminuye a medida que se funde dsDNA. Trazado de cambios en la fluorescencia después de la generación de fragmentos específicos de ADN durante la PCR da lugar a picos individuales correspondientes a amplicones específicos [14].
secuenciación del ADN
Después de gestión de recursos humanos, productos de la PCR exitosas y específicas que muestran un pico de fusión fueron la columna se purificó usando el kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Los productos de PCR se eluyeron con tampón de elución 30 l y se diluyeron 1:10 con agua. Diluidos productos de la PCR se utilizaron como plantilla para la secuenciación de ciclo a través de kit v1.1 Big Dye Terminator (Applied Biosystems). secuenciación bidireccional (es decir, hacia adelante y hacia atrás) se realizó mediante reacción de secuenciación de ciclo (10 l de volumen final) que consta de 1 × premezcla terminador, 1 x tampón de secuenciación, 0,4 M de cualquiera de M13-F o M13-R cebadores (Tabla 1) y 4 l de plantilla diluida. Las reacciones se ejecutan en Veriti (Life Technologies) de acuerdo con el siguiente protocolo: Un ciclo de 95 ° C durante 15 minutos; 30 ciclos de 95 ° C durante 10 segundos, 55 ° C durante 5 segundos, 72 ° C durante 4 minutos. Las reacciones de secuenciación se purificaron con el Kit de ABI BigDye Xterminator Purificación (Life Technologies) y se carga en un analizador genético 3500 (Life Technologies). Los datos de secuenciación se analizaron mediante análisis de secuenciación v5.4 y v2.7 softwares SeqScape (Life Technologies).
ensayos de terminación variar (STA)
STA se basa en métodos de extensión del cebador donde 3 oligonucleótidos (2 para la amplificación y 1 para la detección de mutaciones) se utilizan para detectar una mutación específica. Sin embargo, STA utiliza la incorporación de múltiples nucleótidos marcados con el cebador de detección en comparación con la incorporación de un único nucleótido marcado en otros métodos basados en el cebador de extensión. El cebador de detección hibrida una base antes del sitio diana y luego se extiende sólo cuando sitio diana está mutado. Extensión del cebador de detección con múltiples nucleótidos marcados intensifica la señal y aumenta la longitud de los fragmentos de PCR que permite la discriminación de mutación de tipo salvaje a través de pico de color y tamaño de los fragmentos después de la electroforesis capilar [15].
Se utilizó II kits de detección de mutaciones Mutector (TrimGen, Maryland) para identificar mutaciones en los codones 12, 13 y 61 del gen KRAS que son las mutaciones de KRAS informado a participar más frecuentemente en el cáncer colorrectal [11] - [12], así como mutaciones específicas del gen EGFR en lugares característicos en los exones 18-21, incluyendo ciertas mutaciones puntuales, deleciones e inserciones que identifican a los pacientes que tienen más probabilidades de responder a la terapia del cáncer de pulmón seleccionadas, incluidas la tirosina quinasa inhibidores erlotinib y gefitinib. Los Kits Mutector II detección de mutaciones implementar la tecnología STA para la detección simultánea y diferenciación de las mutaciones que ocurren en el mismo sitio de destino. Mutector II Mutación Detección Kit GP05-CM detecta y diferencia los 12 mutaciones que se producen en los codones 12 y 13 mientras que Mutector II Mutation Detection Kit GP06 está diseñado para 5 mutaciones que ocurren en el codón 61. Mutector II Mutation Detection Kit GP07-02 detecta mutaciones en lugares característicos en los exones 18-21 del gen EGFR. tecnología STA mejora significativamente la sensibilidad. Detecta tan bajo como 1% mutaciones somáticas en comparación con 15 a 20% a través de Sanger de secuenciación [15]. Brevemente, 50 ng gDNA se amplificó por PCR usando reactivos proporcionados a través de las condiciones de PCR descritas por el fabricante. Los productos de PCR se limpiaron y las mutaciones en los codones 12, 13 y 61 se enriquecieron por separado por mutación reacción de extensión de cebador específico. Las muestras que contienen mutaciones enriquecidos se limpiaron de colorantes fluorescentes en exceso, se diluye 5-10 veces con agua. Tres microlitros de los productos de extensión de cebadores diluidos se mezclaron con tampón de carga proporcionada en el kit y el fragmento de tamaño a través de electroforesis capilar en 3500 Genetic Analyzer de ABI (Life Technologies). La electroforesis capilar condiciones y la configuración del instrumento de recolección de datos que se están ejecutando explicada con detalle en el manual de instrucciones Mutector II Kit mutación.
predicción funcional y modelado molecular de nuevas mutaciones KRAS
El impacto funcional de la no -synonymous (proteína que altera la estructura) exón 4 mutaciones se evaluó mediante POLYPHEN-2 (polimorfismo fenotipificación v2) [16] y SIFT (clasificación de intolerante herramientas tolerantes) [17]. También utilizamos el evaluador de mutación [18] para predecir el impacto funcional de las mutaciones basado en la conservación evolutiva del aminoácido afectado, homólogos de proteínas. Además, se aplicó el modelado molecular para predecir el impacto funcional de las nuevas mutaciones detectadas. La estructura de la proteína K-ras utilizado para el modelado se obtuvo de la Protein Data Bank (PDB ID: 3gft). Modelado de mutaciones se llevó a cabo y se visualizaron usando PyMOL [19] - [20]. PyMOL muestra información sobre todos interferencia estérica entre el aminoácido mutado y otras cadenas laterales de aminoácidos y la configuración con la menor interferencia estérica se selecciona manualmente. Las cadenas laterales mutantes fueron modelados en posiciones de la proteína usando rotámeros con más bajo en conflicto Van der Waals radios y la configuración con la menor interferencia estérica con otras cadenas laterales de aminoácidos. El tipo salvaje y la estructura de la proteína mutante se superpusieron para resaltar los cambios conformacionales predichos causadas por cada mutación.
El análisis estadístico
El análisis de datos se realizó con el programa SPSS para Windows versión 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Los resultados fueron tabulación cruzada para examinar las relaciones entre las variables. El análisis estadístico para las variables categóricas se realizó mediante χ-cuadrado para la prueba de asociación y la prueba exacta de Fisher, según corresponda. Donde se examinaron dos variables independientes continuas, se utilizaron t-test y análisis de varianza. Un valor de p inferior a 0,05 se consideró significativo en todos los análisis estadísticos.
Resultados
mutaciones KRAS Novel
mutaciones del gen KRAS se detectaron en el tejido de cáncer de 24 a cabo de 56 casos estudiados (42,85%). De éstos, 11 (19,64%) tenían exón 4 mutaciones localizadas entre los codones 134 y 150, mientras que 13 (23,21%) tenían mutaciones en el exón 2, que afecta a los codones 12 y 13. Las mutaciones no se detectaron en el codón 61 del exón 3. La distribución de mutaciones en nuestra cohorte se muestra en la Tabla S2.
Los 11 casos con el exón 4 aberraciones albergado 8 mutaciones diferentes (Tabla 2) de las cuales una se informó anteriormente (p.Ala146Thr, una mutación sin sentido) y 7 eran novela según lo revelado por la base de datos COSMIC consultado el 19/09/2014. Confirmamos todos los nuevos secuencia de las variaciones detectadas en nuestra cohorte mediante la secuenciación de la cadena opuesta. Todas las muestras mostraron una variación de secuencia idéntica en la cadena opuesta. La señal débil en la muestra 33 (Figura 1) podría atribuirse a reducir el contenido de tejido tumoral; el otro (hacia adelante) hebra también mostró una débil señal de la variación de la secuencia (c.404G & gt; A) también. Sin embargo, la secuenciación del tejido no canceroso de la paciente no mostró señal alguna por variación c.404G & gt; A indica que la señal en la muestra está por encima del límite de detección del protocolo de secuenciación. Una de las nuevas mutaciones (G138G) se detectó en tres pacientes y otro (Q150X), detectado en otros dos pacientes. Cuatro de las siete mutaciones eran mutaciones de sentido erróneo que alteran la secuencia de aminoácidos de la proteína (A134V, R135K, E143K y R149G), mientras que dos mutaciones eran sinónimos (G138G y K147K) y uno, un sentido truncar mutación (Q150X). Se observaron los sin sentido y sin sentido exón 4 mutaciones en siete pacientes (12,5% del total). La Figura 1 es un electroferograma de los exón 4 sin sentido y sin sentido mutaciones KRAS que truncadas o alteraron la secuencia de aminoácidos de la proteína KRAS, respectivamente. Las muestras 32 y 45 contenían también otra mutación (p.Gly12Asp) en el codón 12 del exón 2 como se revela por análisis de STA, que fue detectado con frecuencia en pacientes con cáncer colorrectal (Figura 2). Se encontró que los nuevos exón 4 mutaciones KRAS ser somática desde las secciones de tejido no canceroso colorrectal de pacientes que albergaban estas mutaciones mostraron la secuencia de tipo salvaje (Figura 1).
Todas las mutaciones se confirmaron ilustradas a través de la secuenciación del capítulo adelante. Número de la muestra y la nomenclatura de mutación según las directrices de vehículos pesados se destacan por encima de cada mutación. Las flechas apuntan a la ubicación del cambio de pares de bases
El panel inferior es para la muestra 32 que muestra el segundo pico rojo (GGT & gt; GAT). Y el 3er pico negro (tipo salvaje)
el impacto funcional de las mutaciones no sinónimas en la proteína KRAS se evaluó utilizando herramientas bioinformáticas y los resultados se presentan en la Tabla 3. Por ejemplo, las mutaciones E143K y Q150X se prevé que tenga un impacto perjudicial y alta en la proteína mientras que el R135K se prevé que sea tolerada o para tener un impacto neutro sobre la proteína. Además se utilizó el modelado molecular para evaluar el impacto funcional de estas nuevas mutaciones KRAS y los resultados se muestran en la Figura 3. El ajuste de los datos de modelado molecular de la predicción POLYPHEN-2 y filtrar, así como los datos de conservación (Tabla 3). Por ejemplo, la mutación R135K se prevé que sea benigno y modelado también mostró poco efecto sobre la estructura de la proteína predijo. Las mutaciones restantes se predicen para provocar cambios sustanciales en la estructura de la proteína en línea con el efecto perjudicial predicho por POLYPHEN-2.
de tipo salvaje (WT) KRAS se muestra en color azul y las proteínas mutantes se muestran en amarillo . Las cadenas laterales de aminoácidos se muestran en verde para los residuos WT y en rojo para los residuos mutantes. a) WT K-RAS que muestra la cadena lateral de A134 (verde). b) La superposición de WT y mutante KRAS A134V que muestra los cambios conformacionales predichos causados por la mutación A134V (tenga en cuenta los cambios en la hélice y la lámina beta). c) La superposición de WT y mutante KRAS R135K que muestra los cambios conformacionales predichos causados por la mutación R135K (tenga en cuenta los cambios en las cadenas de la hélice y bucle), pero no afecta el bolsillo de unión de GTP. d) La superposición de WT y mutante E143K KRAS que muestra predijeron cambios conformacionales causadas por la mutación E143K (tenga en cuenta los cambios en el bucle cerca del bolsillo de unión a GTP). e) La superposición de WT y mutante T144I KRAS que muestra predijo cambios conformacionales causadas por la mutación T144I (tenga en cuenta los cambios en el bolsillo de unión de GTP y los cambios en la orientación del GTP unido; es verde y rojo peso es mutante). f) La superposición de WT y mutante R149G KRAS que muestra predijeron cambios conformacionales causadas por la mutación R149G (tenga en cuenta los cambios en la hélice y las cadenas de bucle cerca del bolsillo de unión GTP). g) La superposición de WT y mutante KRAS Q150X mostrando predijeron cambios conformacionales causadas por la mutación Q150X (tenga en cuenta los cambios en la cadena de bucle).
Las mutaciones puntuales especificados por el kit de detección de mutaciones de EGFR en los exones 18, 20 y 21 del gen EGFR no se detectaron en ninguno de los 56 casos estudiados. indel mutaciones en los exones 19 y 20 tampoco se detectaron.
Los principales hallazgos clínicos, patológicos e inmunohistoquímicos de los casos reportados se muestran en la Tabla 4. Las Tablas 5 y 6 muestran una prevalencia del sexo femenino en los casos con la novela KRAS mutaciones en comparación con los casos con otras mutaciones KRAS y casos negativos de mutación KRAS (70%, 42,8% y 43,75%, respectivamente). También muestran menor prevalencia de metástasis en los ganglios linfáticos y la expresión de p53, aunque las diferencias no son estadísticamente significativas (p-valor que oscila entre 0,078 y 1,0). No hemos encontrado EGFR o expresión de la proteína HER2, o mutaciones del gen EGFR en cualquiera de los 10 casos. Tampoco hubo diferencias significativas entre los tres grupos en relación con la edad del paciente, y el tamaño del tumor, profundidad y grado.
Tres de los cinco pacientes que albergan las mutaciones deletéreas había más avanzado enfermedad con un aumento de la profundidad del tumor y la metástasis de ganglios linfáticos (casos 32, 45 y 51), mientras que otros dos presentaban enfermedad localizada (casos 41 y 48).
Los dos casos con el exón 2 mutación concomitante (casos 32 y 45) mostró mayor tamaño del tumor y la profundidad en comparación con la mayoría de los otros casos con mutaciones nuevas y también tenía metástasis en los ganglios linfáticos.
Discusión
la activación del oncogén KRAS ha sido implicado en la carcinogénesis colorrectal, siendo mutado en el 30-40% de los adenocarcinomas [5] - [8], una prevalencia comparable a la observada en el presente estudio (42,85%). El transcrito de ARNm del gen KRAS se compone de 5765 bases que codifican para 188 aminoácidos. Los exones 1, 2, 3, 4, y 5 contienen 181, 122, 179, 160, y 5123 bases, respectivamente [21]. La mayoría de las mutaciones somáticas se produce en los codones 12 y 13 (situado en el exón 2). Otras mutaciones menos frecuentes se producen en el exón 3 (codones 59/61) y el exón 4 (codones 117/146) [22] - [23]. Aproximadamente un tercio de los cánceres colorrectales mutaciones en el G12 y G13 codones albergado mientras que el exón 4 mutaciones codón 117 y 146 se detectaron en sólo hasta 5,5% de los tumores [24]. Nuestro estudio mostró una prevalencia mucho menor del exón 2 mutaciones (23,21%) y una prevalencia mucho mayor del exón 4 mutaciones (19,64%) con el exón 4 mutaciones localizadas entre los codones 134 y 150 en lugar de la participación de los codones 117 y 146.
mutaciones del exón 4 del gen KRAS están subestimadas ya que todos los esfuerzos de los ensayos clínicos se centraron en el exón 2 (los codones 12 y 13) y el exón 3 (codón 61) mutaciones [22] - [25]. Las siete nuevas mutaciones KRAS reportados en el presente artículo se produjeron en el exón 4 y localizados entre los codones 134 y 150. Por lo tanto, se aconseja que incluyen codones 134-150 como un punto de acceso para el análisis mutacional del gen KRAS de rutina en pacientes con cáncer colorrectal, en lugar de centrarse únicamente en los codones 117 y 146. Hemos detectado sin sentido y sin sentido exón 4 mutaciones en el 12,5% de los casos que es superior a lo que se había informado anteriormente, que ascendieron a 10%, pero también incluyó el exón 3 y las ANR, además de exón 4 mutaciones [24]. Se encontró que todas las mutaciones novedosas ser somática ya que todas las secciones de tejido no canceroso colorrectal a partir de los 10 casos que albergaban las mutaciones mostraron la secuencia de tipo salvaje.
El impacto funcional de las nuevas mutaciones no sinónimas en la proteína KRAS era evaluó a través de herramientas bioinformáticas y modelado molecular (Tablas 2 y amp; 3, Figura 3). La mutación R135K dio como resultado la sustitución de Arg por Lys cargado de manera similar que se prevé para hacer pequeños cambios en las interacciones entre los residuos adyacentes. herramientas bioinformáticas mostraron que la mutación R135K se prevé que tenga un efecto neutro sobre la proteína. Del mismo modo, el modelado molecular mostró un pequeño cambio en la estructura de la proteína causada por esta mutación (Figura 3). En contraste, la mutación E143K se predice que tienen un efecto perjudicial sobre la proteína mediante herramientas bioinformáticas (Tabla 3) y por el modelado molecular (Figura 3). Esta mutación dio como resultado la sustitución de la Glu cargada negativamente para el Lys de carga positiva (Tabla 2) que es probable que cause cambios importantes en las interacciones de los residuos de aminoácidos adyacentes. La Figura 3 muestra que la mutación E143K causó cambios sustanciales en la estructura de la proteína KRAS especialmente en el bucle cerca del bolsillo de unión a GTP. La mutación R149G se prevé que sea neutral, pero el modelado molecular demostró que esta mutación provocó cambios en la hélice y las cadenas de bucle cerca del bolsillo de unión de GTP. Esto es probable que sea debido a los cambios en las interacciones entre los residuos de aminoácidos causados por la sustitución de la Arg con carga positiva para la Gly no polar (Tabla 2). Además, esta mutación se encuentra cerca del motivo SAK conservada y un estudio reciente mostró que una cercana mutación (K147E) da lugar a una proteína RAS auto-activación que pueden actuar independientemente de las señales ascendentes y muestran una menor afinidad por la RAF quinasa [26]. La mutación Q150X introdujo un codón de parada prematuro y se predice que tienen un efecto sobre la estabilidad del ARNm a través de la descomposición mediada por el antisentido que resulta en la reducción de expresión de la proteína truncada. A lo mejor de nuestro conocimiento, la mutación Q150X detectado en el presente estudio es la segunda mutación KRAS truncar ser reportados en el cáncer colorrectal en la literatura. Una mutación KRAS (CAG & gt; TAG) determinar una señal de parada prematura en el codón 22 (Gln22Stop) se ha encontrado previamente en un paciente con cáncer colorrectal metastásico por Palmirotta, et al [27]. No se encontraron genes BRAF y p53 que ser modificado y la inestabilidad de microsatélites no estaba presente. El paciente, sin embargo, se encontró que no responde a un tratamiento anti-EGFR. Es interesante que nuestros dos pacientes portadores de la mutación EGFR truncar eran negativas por IHC. También tenían ninguna mutación del gen EGFR. Varios preclínica [28] y clínica [29] Los estudios han mostrado que la aparición de mutaciones de KRAS en el cáncer colorrectal es un parámetro predictivo independiente de EGFR dirigidos resistencia a la terapia. Por último, aunque los sinónimos novela exón 4 mutaciones reportadas en el presente estudio (incluyendo la mutación G138G que se detectó en tres pacientes) no alteraron la composición de aminoácidos de proteínas, aún pueden ser importantes en la tumorogénesis. Hay una creciente evidencia de que las mutaciones sinónimas (a menudo denominado erróneamente como "silenciosa") pueden afectar a la transcripción, el empalme, el transporte de ARNm y la traducción, cualquiera de los cuales podría alterar el fenotipo, lo que hace la mutación sinónimo no silenciosa [30].
Hemos detectado una de las nuevas mutaciones en tres casos (G138G) y otro en dos casos más (Q150X). Nuestro tamaño de la muestra es bastante pequeña para llevar a cabo el análisis de frecuencia y la comparación de los estudios publicados más grandes. Sin embargo, el hecho de que estas nuevas mutaciones se observaron en 5/56 casos indica que más estudios deben llevarse a cabo.
EGFR es sobreexpresado en muchos tipos de cáncer, especialmente el cáncer colorrectal, y parece reflejar más agresivo histológico y comportamientos clínicos [31]. También se ha demostrado que la proteína p53 sobre la expresión puede ayudar en la predicción de potencialmente diseminación metastásica a los ganglios linfáticos en el cáncer colorrectal [32]. Con base en esa información, la baja prevalencia de metástasis en los ganglios linfáticos y la expresión de p53 en los pacientes portadores de las mutaciones nuevas, junto con la ausencia de expresión de la proteína EGFR y HER2 y mutaciones del gen EGFR puede generalmente sugieren una vía de bajo grado en el desarrollo del cáncer colorrectal en los pacientes, que son probablemente también resistentes a anti-EGFR y anti-HER2 terapia. Esta especulación está de acuerdo con el hallazgo de que las mutaciones en el exón 4 de KRAS predicen para un resultado clínico más favorable en pacientes con cáncer de colon [24]. Irónicamente, cuatro de los siete nuevos exón 4 mutaciones detectadas en el presente estudio se prevé que sea perjudicial para la proteína KRAS según lo revelado por modelado molecular.