Extracto
Antecedentes
El levamisol, un imidazo (2,1-b) derivado de tiazol , se ha informado que es un agente antitumoral potencial. En el presente estudio, hemos investigado el mecanismo de acción de uno de los análogos identificados recientemente, 4a (2-bencil-6- (4 'fluorofenil) -5-tiocianato-imidazo [2,1-b] [1] , [3], [4] tiadiazol).
Materiales y Métodos
La producción y la expresión de varias proteínas apoptóticas ROS se midieron después del tratamiento 4a en líneas celulares de leucemia. modelos animales Tumor se utilizaron para evaluar el efecto de 4a en comparación con levamisol sobre la progresión del adenocarcinoma de mama y la supervivencia. Se realizó inmunohistoquímica y occidental Blot estudios para entender el mecanismo de acción 4a ambos
ex vivo
y
in vivo
.
Resultados
Nos han determinado la IC
50 valor de 4a en muchas líneas celulares de leucemia y el cáncer de mama y encontraron células CEM más sensible (IC
50 5 M). Los resultados mostraron que el tratamiento 4a conduce a la acumulación de ROS. Western blot mostró regulación al alza de las proteínas pro-apoptóticas t-BID y BAX, tras el tratamiento con 4a. Además, la activación dependiente de la dosis de p53 junto con FAS, FAS-L, y la escisión de la caspasa-8 sugieren que induce la muerte del receptor mediada vía apoptótica en células CEM. Más importante aún, se observó una reducción en el crecimiento del tumor y el aumento significativo de la supervivencia tras la administración oral de 4a (20 mg /kg, seis dosis) en ratones. En comparación, se encontró 4a a ser más potente que su análogo parental Levamisol basado en ambos
ex vivo
y
in vivo
estudios. Además, inmunohistoquímica y occidental Blot estudios indican que el tratamiento 4a llevó a la derogación de la proliferación de células tumorales y la activación de la apoptosis por la vía extrínseca, incluso en modelos animales.
Conclusión
Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que 4a podría utilizarse como un agente quimioterapéutico potente
Visto:. Hegde M, Karki SS, Thomas E, Kumar S, Panjamurthy K, Ranganatha SR, et al. (2012) Novela Levamisol derivados induce la ruta extrínseca de apoptosis en células cancerosas e inhibe la progresión del tumor en ratones. PLoS ONE 7 (9): e43632. doi: 10.1371 /journal.pone.0043632
Editor: Rafael Moreno-Sánchez, Instituto Nacional de Cardiología, México |
Recibido: 13 Febrero, 2012; Aceptado: 23 de julio de 2012; Publicado: 10 Septiembre 2012
Copyright: © Hegde et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo auspiciado por el Fondo de lady Tata Memorial Trust, Reino Unido, y el Instituto indio de Ciencia puesta en marcha de subvención para SCR. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no hay ningún interés en competencia
Introducción
el cáncer es una enfermedad difícil de tratar, y sólo muy pocos medicamentos eficaces están disponibles. El desarrollo de moléculas terapéuticas de cáncer nuevos, eficaces, selectivos y menos tóxicos ha sido un objetivo difícil. La comprensión de los mecanismos moleculares implicados en los cánceres conducirá al descubrimiento de nuevos agentes contra el cáncer. Los cambios en los niveles de expresión de ARN y proteínas debido a mutaciones diferentes han sido estudiados en muchos tipos de cáncer, incluyendo leucemia y linfoma [1] - [4]. Recientemente, ha habido extensos esfuerzos para caracterizar el mecanismo de translocaciones cromosómicas y deleciones resultantes en la leucemia y el linfoma [5], [6]. Muchas fusiones de genes también se han identificado en los cánceres de próstata y cánceres de mama [7]. Las proteínas más discutidos responsables de la leucemia y el linfoma en el pasado reciente son los recombinación activación de genes (trapos, la enzima responsable de la diversidad de anticuerpos) [5], [6] y desaminasa inducida por activación (AID, la enzima responsable de la hipermutación somática y la clase recombinación de cambio) [5], [8]. Sin embargo, están aún por identificar las enzimas responsables de la elaboración de fusiones de genes.
Las últimas dos décadas han visto un cambio dramático en los paradigmas de tratamiento del cáncer. Por ejemplo, imatinib (Gleevac), un fármaco desarrollado específicamente contra la tirosina quinasa activada en la leucemia mielógena crónica, es uno de tales avances importantes [9]. Además, muchos otros compuestos también han sido identificados y clínicamente probado. Si bien, el éxito de los ensayos clínicos en la identificación de nuevos agentes y modalidades de tratamiento ha sido significativa, los tratamientos actuales tienen muchas limitaciones. Esto incluye los efectos secundarios inducidos por las drogas y adquirido resistencia a los fármacos [10]. Por lo tanto, la necesidad de que el desarrollo de agentes terapéuticos contra el cáncer eficaces con propiedades farmacocinéticas bien definidos es de gran importancia.
En la actualidad, existen diferentes maneras por las cuales un medicamento es probado por su eficacia como un agente contra el cáncer . A este respecto, varias vías de apoptosis se han estudiado ampliamente para muchos compuestos de entender su modo de citotoxicidad [11]. los puntos de control del ciclo celular inducidos por moléculas pequeñas también se han investigado [12], [13].
levamisol es un inmunomodulador en diferentes células de cáncer, incluyendo cáncer colorrectal, cáncer de mama, melanoma y leucemia [14]. Anteriormente, se ha demostrado que afecta a la proliferación celular en diferentes tipos de cáncer [15] y modula la fosforilación relevante tanto para la progresión del ciclo celular y la apoptosis. Los estudios también han demostrado que se puede utilizar para las infestaciones helmínticas anticuerpos y varias enfermedades autoinmunes [16], [17]. Además, se ha demostrado que el levamisol tiene actividad contra el cáncer en combinación con fluorouracilo (5-FU) como terapia adyuvante para el tumor de nodo metástasis (TNM) etapa III de carcinoma de colon (C de Dukes) [18].
El imidazo (2,1-b) tiazol derivados de levamisol se han reportado como agentes antitumorales potenciales [19]. Más tarde, la actividad antitumoral de 5-formil-6-arylimidazo- [2,1-b] También se informó de sulfonamidas -1,3,4-tiadiazol [20]. Sobre la base de estos prometedores resultados, se sintetizó una serie de análogos que contienen flúor en la posición 4 de 6-fenilo en imidazo- [2,1-b] -1,3,4-tiadiazol y identificado 4a como el compuesto de plomo [21]. Sin embargo, el mecanismo por el cual se induce la citotoxicidad no se conocía. Además, nunca se puso a prueba en modelos animales para su efecto sobre la progresión del tumor. En el presente estudio, mostramos que 4a ejerce su efecto sobre las células tumorales mediante la activación de la vía extrínseca de la apoptosis. También se encontró que 4a inhibe la progresión del tumor en los ratones con eficacia y aumenta la vida útil significativamente.
Materiales y Métodos
Productos químicos y reactivos
Todos los productos químicos utilizados en la presente estudio fueron de grado analítico y adquirió de Sigma-Aldrich, EE.UU.. Los anticuerpos se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology, EE.UU..
Síntesis de 4a
Síntesis y caracterización de 2-bencil-6- (4 'fluorofenil) -5-tiocianato-imidazo [2, 1-b] [1], [3], [4] tiadiazol, 4a se ha descrito anteriormente [21]. Levamisol (clorhidrato Tetramisole, Cat. No. L9756) se adquirió de Sigma-Aldrich, EE.UU..
Cultivo de células
líneas celulares humanas, CEM (leucemia de células T), K562 (mielógena crónica leucemia) REH (leucemia de células B) y NALM6 (leucemia de células B), se cultivaron en RPMI1640 (Sera Lab, Reino Unido) que contiene 10% de FBS (Gibco BRL, EE.UU.), 100 U de penicilina G /ml y 100 mg de estreptomicina /ml (Sigma-Aldrich, EE.UU.) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. EAC (cáncer de mama) línea celular fue adquirido de Centro Nacional para la ciencia de la célula, Pune y cultiva en DMEM que contenía FBS al 10% como se ha descrito anteriormente.
El azul tripán colorante de exclusión ensayo
El efecto de 4a sobre la viabilidad de leucémica (CEM, K562, REH, NALM6) y células de cáncer de mama (EAC) se determinaron por el ensayo de exclusión Trypan azul colorante [22]. Las células se cultivaron (0,75 × 10
5 células /ml) durante 24 h y el compuesto se añadió en el intervalo de 1 a 100 mM para determinar la IC
50 valor. Se usaron células tratadas con DMSO como control del vehículo. Las células se recogieron a intervalos de 24 horas durante cinco días y el número de células viables se determinó después de la tinción con azul de tripano. Para Levamisol, se utilizó agua como control del vehículo. En caso de EAC, una línea celular adherente, la viabilidad se midió a las 48 y 72 h después del tratamiento de 4 bis. Cada experimento se repitió un mínimo de dos veces y las barras de error se calcularon y se representó gráficamente.
ensayo MTT
Se realizó el ensayo MTT como se describió anteriormente [23]. células CEM, K562, REH o NALM6 (0,75 × 10
5 células /ml) fueron tratadas con 4 bis (para CEM y REH células 1, 5, 10 y 20 micras; para K562 1, 5, 10, 20, 40 y 100 mM; para NALM6, 1,5,10, 20, 40 mM), se incubaron durante 48 y 72 h y se sometieron a ensayo de MTT. Las células tratadas con DMSO o agua se utilizó como controles de vehículo para 4a, respectivamente. Experimento se repitió un mínimo de dos tiempos independientes, cada uno con reacciones duplicadas y las barras de error se indican.
liberación de LDH ensayo
liberación de LDH en los medios de comunicación tras el tratamiento 4a (1, 5, 10 y 20 M) en células CEM después de 48 y 72 h de tratamiento se midió usando el protocolo estándar [24]. El porcentaje de liberación de LDH se calculó como:. La liberación de LDH en (liberación de LDH en los medios de liberación de LDH + intracelular) media /× 100%
La detección de la producción de ROS intracelular por citometría de flujo
El nivel de la producción total de ROS intracelular se midió mediante el uso de células sonda fluorescente permeable 2,7-dichlorodihydro diacetato de fluoresceína (H
2DCFDA) en células CEM y REH [25]. células CEM fueron tratadas con 5 y 10 mM de 4a y células REH con 10 M durante 5, 10, 15, 30 y 60 min, se recogieron, se lavaron y la intensidad de fluorescencia se analizó mediante citometría de flujo. Las células tratadas con H
2O se utilizaron
2 como control positivo para la compensación de las muestras experimentales.
análisis de transferencia de Western
lisado celular se preparó siguiendo el tratamiento con 4a en CEM (0 , 0,5, 1, y 5 M durante 48 h). La transferencia Western se realizó como se describió anteriormente [23]. Brevemente, ~ 40 g de muestra de proteína se sometieron a electroforesis en 8-12% SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore, EE.UU.) y se sondaron con anticuerpos secundarios respectivos primarias y biotinilados. Los anticuerpos primarios utilizados fueron BCL2, BCL-xL, BAX, t-BID, p53, p-p53 [Ser 392], PUMA, AKT, pAKT [Ser 473], FAS, FAS-L, FADD, SMAC /DIABLO, CASPASA -3, caspasa 8 y el citocromo C. Las transferencias se desarrollaron usando reactivos quimioluminiscentes (Immobilon ™ occidental, Millipore, India) y escaneados por el sistema de documentación de gel (LAS 3000, Fuji, Japón). Blots fueron despojados posteriormente según el protocolo estándar y volvieron a sondar con el anticuerpo contra-tubulina [23].
Separación de fracciones mitocondrial y citosólica de 4a tratada células CEM
células CEM fueron tratados con 5 M 4a durante 48 h, cosechadas y utilizadas para el aislamiento de fracciones mitocondriales y citosólicas utilizando el kit de extracción mitocondrial (IMGENEX, EE.UU., Cat. No. 10082k) según las instrucciones del fabricante. Se usaron células tratadas con DMSO como control. Las fracciones resultantes se utilizaron para el análisis de transferencia de Western contra anti-citocromo C. actina se utilizó como control de carga.
In vivo experimentos
Declaración de Ética.
Los ratones se mantuvieron como por los principios y directrices del comité de ética de cuidado de los animales del Instituto indio de Ciencias de conformidad con la Ley Nacional de la India sobre el cuidado y uso de animales. El diseño experimental del presente estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Ética Animal (Ref. CAF /Ética /125/2007/560), Instituto Indio de Ciencia, Bangalore, India.
Animales
ratones albinos suizos, 6-8 semanas de edad, con un peso 18-22 g fueron adquiridos de instalación para animales en el centro, Instituto indio de Ciencia (IIS) de Bangalore, India, y se mantuvieron en la casa de los animales, Departamento de Bioquímica, iisc. Los animales fueron alojados en jaulas de polipropileno y proporcionan la dieta de pellets estándar (Agro Corporación Pvt. Ltd., India) y agua ad libitum. La dieta estándar de pellets compone de proteína de 21%, 5% de lípidos, 4% de fibra bruta, 8% de cenizas, 1% de calcio, 0,6% de fósforo, 3,4% de glucosa, 2% de vitamina, y 55% de extracto libre de nitrógeno (hidratos de carbono). Los ratones se mantuvieron en condiciones controladas de temperatura y humedad con un ciclo de 12 h de luz /oscuridad.
Preparación de carcinoma ascítico de Ehrlich (EAC) las células
.
Se recogieron las células de la CAO de la cavidad peritoneal de ratones donantes portadores de tumores de 20 a 22 g de peso corporal y se suspendieron en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Un número fijo de células viables (1 x 10
6 células /22 g b. En peso) se implantaron en la cavidad peritoneal de cada ratón receptor y permite que se multipliquen. Se retiraron las células tumorales, se diluye en solución salina, se contaron y se reinyecta (1 × 10
6 células /animal) en el tejido del muslo derecho de los animales de experimentación para el desarrollo de tumores sólidos.
Evaluación de la actividad antitumoral de 4a en el ratón
Para estudiar y comparar la actividad antitumoral de 4a, 32 ratones albinos suizos fueron utilizados en el presente estudio, (dos lotes de 16 animales cada uno). Fuera de 16 ratones, cuatro fueron utilizados como control sin tratar (normal). Resto de los ratones fueron inyectados con EAC para inducir tumor sólido, y se dividió en tres grupos, cada uno con cuatro animales para el control tumoral (grupo dos), Levamisol tratado (grupo de tres) y se trató 4a (grupo de cuatro). El grupo dos recibió agua como control de vehículo, el grupo de tres recibieron la administración oral de levamisol (20 mg /kg, b. En peso) y el grupo de cuatro recibido administración oral de 4a (6 dosis de 20 mg /kg) en cada día alternativo utilizando gavages gástricas a partir del 12
º día de la inyección de las células tumorales.
los diámetros de tumor en desarrollo se midieron en el caso del grupo de dos, tres y cuatro animales mediante el uso de pies de rey una vez en cinco días. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula V = 0.5ab
2, donde "a" y "b" indican el diámetro mayor y menor, respectivamente [26]. Al final de 25
º y 45
días del período experimental, un animal de cada grupo fue sacrificado por dislocación y los tejidos del cuello uterino de la normal (grupo uno), tumor (grupo de dos), Levamisol tratado (grupo de tres ) y 4a tratados (grupo de cuatro), los animales fueron recogidos y almacenados.
Para comprobar la longevidad inducida por tumor en ratones 4a, se estudiaron 24 animales, dos lotes con 12 cada uno. De 12, seis sirvieron como control del tumor y otros fueron tratados con 4a como se explicó anteriormente. El porcentaje de aumento de la esperanza de vida se calculó y se comparó con la de los animales de control. El patrón de muerte para los controles y animales tratados 4a fue grabado y% de aumento en la vida útil se calculó utilizando la [(T-C) /C] fórmula × 100, donde "T" indica el número de días que los animales tratados 4a sobrevivieron y 'C 'indica el número de días que los animales sobrevivieron tumorales [26] - [28].
Evaluación de la toxicidad de 4a en ratones normales
ratones albinos suizos fueron tratados con levamisol (4a y 6 dosis, en días alternos) y se evaluaron los efectos secundarios en dos momentos diferentes (20
º y 50
º día). De los 36 ratones, 18 cada uno se utilizaron a 20
º y 50
º día. En ambos casos, 6 animales sirvieron como control, mientras que 6 fueron tratados con Levamisol (20 mg /kg) o 4a (20 mg /kg). El peso corporal de cada animal se monitorizó durante todo el experimento y el peso promedio calculado en 20
º y 50
TH días para el control, 4a y ratones administrados Levamisol y se representaron con barras de error. Con el fin de evaluar el efecto de 4a y levamisol en las funciones fisiológicas, se recogió sangre en 20
º y 50
TH días como se describió anteriormente [29]. Se separó el suero y pruebas de función hepática y renal se realizaron para cada animal, para determinar los niveles de fosfatasa alcalina (ALP), creatinina, urea y el recuento de la sangre se llevó a cabo usando plasma como se describe anteriormente [29]. Los valores se presentan como media ± SEM.
Western blot para la 4a tratada células tumorales sólidas y líquidas
tumor sólido se desarrolló como se describe anteriormente [29]. Después de 6 dosis de 4a, se recogió tumor y el extracto se preparó utilizando RIPA método buffer [23]. El tumor líquido fue desarrollado por la inyección de células de EAC (2 × 10
6 células) de ratones donantes a la cavidad peritoneal de los animales de experimentación. Después de la inyección EAC (5
TH días), los animales fueron tratados con 4a (20 mg /kg; 4 dosis cada día alternativos) y se aislaron las células de la CAO de la cavidad peritoneal. Las células de linaje de macrófagos fueron separados de las células de EAC no adherentes por aspiración suave y se lavaron con 1 x PBS. La viabilidad celular se comprobó mediante el ensayo de exclusión del colorante azul de tripano y 92% de células resultaron ser vivo en ambos grupos experimentales y controles. células EAC se lisaron en tampón RIPA, el extracto se preparó como se describe anteriormente [30] y se utiliza para el análisis de transferencia Western.
La evaluación histológica
Se recogieron tumor y los tejidos del hígado de ratones normales y experimentales y procesada según los protocolos estándar. Brevemente, los tejidos se embebieron en cera de parafina, se seccionaron a 5 a 10 micras en un micrótomo rotatorio (Leica Biosystems, Alemania) y se tiñeron con hematoxilina y eosina [31], [32]. Se recogieron los tejidos del cerebro, procesan y se tiñeron con azul Luxol rápido para estudiar la desmielinización. Cada sección se evaluó por microscopía de luz y las imágenes se capturaron (Zeiss, Alemania).
inmunohistoquímica (IHC) análisis
La tinción de anticuerpos se llevó a cabo en, tejidos embebidos en parafina fijadas con formalina, que se seccionaron a un espesor de 5 micras. Las láminas fueron des-con parafina utilizando xileno, rehidratada y se trata con 3% de H
2O
2 en PBS. La recuperación del antígeno se llevó a cabo usando tampón de citrato de sodio 0,01%, seguido de bloqueo en PBST que contiene 0,1% de BSA y 10% de FBS. incubación del anticuerpo primario (Ki67, BID o 53BP1) se llevó a cabo durante la noche a 4 ° C. Los portaobjetos se lavaron y se incubaron con anticuerpo secundario biotinilado (1 h). Diapositivas luego fueron lavados, se incubaron en estreptavidina-HRP (1:1000). Los portaobjetos se lavaron de nuevo (PBS que contiene 0,1% de Tween 20) y el color fue desarrollado usando DAB + H
2O
2, por contraste con hematoxilina y se montaron en DPX (Sigma-Aldrich, EE.UU.). Las imágenes fueron capturadas utilizando microscopio de luz (Zeiss, Alemania). Cambio en la intensidad de la tinción de anticuerpos después del tratamiento 4a se determinó utilizando el software ImageJ [33].
Se realizó un análisis estadístico
Los valores se expresan como media ± SEM para el control y las muestras experimentales y análisis estadístico usando ANOVA de una vía seguido por la prueba de Dunnett y cada valor se comparó con el control y la significación se menciona. Para este análisis, se utilizó el software GraphPad Prism 5.1. Los valores se consideraron como estadísticamente significativa, si el valor de p fue igual o inferior a 0,05.
Resultados
4a induce citotoxicidad en células de cáncer
Con anterioridad, mientras que el cribado una serie de derivados levamisol, hemos identificado 4a como el compuesto de plomo (Fig. 1A) [21]. En el presente estudio, hemos utilizado una variedad de líneas de células leucémicas (CEM, K562, REH y NALM6) y una línea celular de cáncer de mama de ratones, carcinoma ascítico de Ehrlich (EAC) para evaluar su potencial para inducir la citotoxicidad. En primer lugar, IC
50 de 4a en las células CEM, K562, NALM6 y REH se determinó usando ensayos de azul de tripano y MTT (Fig. 1). Las células tratadas con DMSO se utilizaron como control del vehículo. Los resultados mostraron que el tratamiento 4a afectada significativamente la viabilidad celular a concentraciones más bajas en CEM, NALM6 y REH (Fig. 1B, C). Curiosamente, las células K562 mostraron menos sensibilidad hacia el tratamiento 4a (Fig. 1B, C). Sobre la base de los dos ensayos de MTT azul de tripano y, la IC
50 valor se estima en aproximadamente 5, 70, 10 y 8 M en células CEM, K562, NALM6 y REH, respectivamente después de 48 h de tratamiento 4a. Curiosamente, en comparación con 4a, el tratamiento Levamisol en células CEM mostró menor sensibilidad (Fig. 2A, B). 4a exhibe citotoxicidad significativa en las células de EAC (IC
50, 33 M), mientras que las células eran insensibles a levamisol, en el intervalo de concentraciones de prueba (Fig. 2C, D). Además, el ensayo de LDH se realizó para el daño celular inducido por ensayo 4a en células CEM. Las células se trataron con 4a durante 48 y 72 h, respectivamente, se recogieron y se sometieron a medición de la LDH. Los resultados mostraron un aumento dependiente de la dosis en la liberación de LDH (Fig. S1).
A. La estructura de 4a. B. 4a indujo citotoxicidad como se determina por el ensayo de azul de tripano. células CEM, K562, NALM6 y REH se cultivaron (0,75 × 10
5 células /ml) y se midió la citotoxicidad después de la adición de una concentración creciente de 4a como se indica. Las células se contaron a intervalos de 24 h hasta que las células fase estacionaria alcanzado y se representaron. Se usaron células tratadas con DMSO como control del vehículo. El error estándar se calcula en base a mínimo de dos experimentos independientes. C. Determinación de la proliferación celular usando un ensayo MTT después de la adición de 4a a CEM, K562, NALM6, y las células REH (48 y 72 h). Los resultados mostrados son de un mínimo de dos experimentos independientes, cada uno se llevó a cabo por duplicado y los resultados se expresan como% de la proliferación celular. En todos los paneles de "C" es sinónimo de DMSO de control tratado con vehículo.
A. La estructura de levamisol, el compuesto parental de 4a. B. Determinación de la proliferación celular usando el ensayo de MTT en células CEM tratadas con Levamisol o 4a. En caso de levamisol, las concentraciones usadas fueron 1, 5, 10 y 20 mM, mientras que fue de 10 micras para 4a. El error estándar se calculó sobre la base de dos experimentos independientes. C, D. La citotoxicidad de 4a y levamisol en las células de EAC, medido por el ensayo de azul de tripano. se cultivaron células de EAC (0,75 × 10
5 células /ml) y se trató con 1, 5, 10, 20 y 40 M de 4a o levamisol. La viabilidad de las células se determinó por el ensayo de azul tripán a las 48 y 72 h. El error estándar se calculó sobre la base de tres experimentos independientes.
4a induce especies reactivas de oxígeno intracelulares (ROS)
La sobreproducción de ROS después de la adición de un compuesto es un indicador de la respuesta celular que conduce a daño en el ADN y la apoptosis. Se encontró que el tratamiento 4a indujo la producción de ROS en el caso de CEM (5 y 10 mM), así como REH (10 mM) en las células 10 y 15 min (Fig. 3 A, B, Fig. S2). Además, el aumento en el tiempo de incubación no mejoró el nivel de ROS. Las células tratadas con H
2O se utilizaron
2 como control positivo, mientras que las células tratadas DMSO sirvieron como control del vehículo (Fig. 3). Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la producción de ROS es un paso intermedio que participan en la citotoxicidad inducida 4a.
A, B. CEM (A) y REH (B) células tratadas con 4 bis (5 mM y 10 mM, respectivamente) para diferentes puntos de tiempo se utilizaron para el ensayo de la formación de ROS intracelular por citometría de flujo análisis. La concentración seleccionada para el estudio se basó en sus respectivos IC
50 valores. se utilizaron H
2O
2 células tratadas como control positivo mientras que las células solamente se utilizaron como control negativo. Se usaron células tratadas con DMSO como control del vehículo. población celular que muestra ROS se muestra junto con media error estándar (n = 2).
4a modula la expresión de las proteínas apoptóticas
Con el fin de estudiar el mecanismo por el cual 4a induce la muerte celular , se estudiaron los niveles de expresión de diferentes proteínas apoptóticas después del tratamiento 4a. Las células CEM se eligieron para el estudio, ya que mostró la máxima sensibilidad a la 4a. células CEM se trataron con concentraciones crecientes de 4 bis (0,5, 1 y 5 mM, durante 48 h), lisado de células se prepararon y utilizaron para estudios de Western Blot. Los resultados mostraron que el tratamiento 4a llevó a un notable aumento en los niveles de p53, así como fosfo-p53 (Fig. 4A). Desde p53 es un activador conocido de la apoptosis, se probó la expresión de varias proteínas de la familia BCL2 que tienen funciones pro /anti-apoptóticas (Fig. 4A, B). De acuerdo con nuestros resultados anteriores, se observó un aumento en la expresión de proteínas pro-apoptóticos PUMA, BAX, y la escisión de BID (Fig. 4A, B). Curiosamente, también se observó la regulación al alza de las proteínas anti-apoptóticas, BCL2 y BCL-xL, en particular en 0.5 y 1 M concentraciones (Fig. 4B). Además, el tratamiento 4a condujo al aumento en la expresión de proteínas de señalización de la muerte de los receptores, FAS, FAS-L y FADD, lo que indica que la citotoxicidad inducida por 4a podría estar mediado a través de la apoptosis mediada por receptores de muerte (Fig. 4C).
lisado de células CEM se preparó después del tratamiento con 4a (0, 0,5, 1 y 5 M durante 48 h). células tratadas con DMSO se utilizaron como control (0 M). estudios de transferencia de Western se realizaron con anticuerpos primarios y secundarios específicos para la expresión de (A) fosfo p53, p53, PUMA, fosfo AKT, AKT (B) BCL2, BCL-xL, BAX y t-BID; se utilizó (C) FAS, FAS-L, FADD, y SMAC /DIABLO (D) la caspasa-3, caspasa 8 y el citocromo C α-tubulina como control de carga. La cuantificación de las bandas en cada transferencia se muestra en panel de la izquierda se muestra como diagrama de barras con el error estándar basado en dos experimentos independientes siguientes normalización con respectiva TUBULINA E. liberación de citocromo C de la mitocondria después del tratamiento con 4a. Mitocondrial, así como fracciones citosólicas se separaron de las células CEM después de 48 h de tratamiento con 4 bis (5 M), se usaron células tratadas con DMSO como control (C), la transferencia Western se realizó con anti-citocromo C. actina se utilizó como control de carga .
se sabe vía PI3K /AKT para ser activado en la mayoría de LLA-T. También se sabe que juega un papel crítico en el control de la supervivencia y apoptosis. Aumento de la p-AKT se desplaza hacia la supervivencia de las células al interferir con p53 mediada por la vía de la apoptosis. Por lo tanto, estábamos interesados en el control de los niveles de AKT después de tratamiento con el compuesto. Los resultados mostraron regulación positiva de AKT después de la adición de 4a (Fig. 4A). A pesar de aumento en los niveles de p-AKT, la muerte celular inducida por fármacos, lo que sugiere que la relación de las señales proapoptóticos y antiapoptóticos en el celular se rompió
.
SMAC /Diablo es una proteína mitocondrial de mamíferos que funciona como un componente de regulación durante la apoptosis. Hemos probado su expresión tras el tratamiento 4a y los resultados mostraron una regulación al alza de la expresión de la proteína (Fig. 4C). Un aumento dependiente de la dosis en el nivel del citocromo C también se observó (Fig. 4D) [34]. También se verificaron por la liberación de citocromo C al citoplasma y los resultados mostraron un claro aumento en el nivel del citocromo C citosólico tras el tratamiento con 4a (Fig. 4E).
caspasa 8 es otra proteína activada durante el vía extrínseca de la apoptosis. Los resultados mostraron la escisión de la caspasa-8 tras el tratamiento 4a (Fig. 4D). Esto confirma además la activación de la apoptosis mediada por la muerte del receptor. Caspasa 8 activada también escinde procaspasa-3 y de acuerdo con esto, encontramos activación de procaspasa-3 en comparación con los controles, después del tratamiento 4a, de una manera dependiente de la dosis (Fig. 4D).
inhibe tratamiento 4a la progresión del tumor en ratones
EAC derivada de adenocarcinoma de mama es un carcinoma agresivo y de rápido crecimiento comúnmente utilizado para la evaluación del efecto de nuevas moléculas pequeñas en la progresión tumoral. Sobre la base de estudios piloto, se usó 20 mg /kg de peso corporal de 4a para el tratamiento en animales portadores de tumores (datos no mostrados). Después de 12
º día de la inyección de EAC (tumor pequeño tamaño era visible), los animales fueron tratados con seis dosis cada día alterno. Se encontró que el tratamiento con 4a en animales portadores de tumor resultó en una reducción significativa del tamaño del tumor en comparación con el de sin tratar, así como Levamisol animales tumor tratado (20 mg /kg) (Fig. 5A). Se encontró que el 80% de los ratones sobrevivieron después del tratamiento con 4a, mientras que el 50% de los ratones no tratados tumorales estaban muertos entre 30 a 40 días de desarrollo de tumor (Fig. 5A, B y los datos no se muestra). El aspecto macroscópico de tejido muslo que contiene tumor, el hígado y el bazo de control negativo, control del tumor sin tratar y ratones tratados 4a mostró una diferencia morfológica proporcional (Fig. 5C y datos no presentados).
tumor sólido se indujo en Swiss ratones albinos mediante la inyección de células de la CAO. Seis dosis de 4a y Levamisol (20 mg /kg) cada uno administrado a ratones portadores de tumores en cada día alterno desde 12
º día de la inyección de células EAC. A. Efecto de 4a y levamisol en la progresión del tumor en diferentes puntos temporales. Los datos mostrados se basa en dos lotes independientes de experimentos que contienen cuatro animales cada uno. Las barras de error indican la SD a partir de experimentos independientes. B. Kaplan-Meier de supervivencia de los ratones tratados con 4a. De cada 24 tumores inducidos animales albinos suizos, 12 fueron tratados con 4a (20 mg /kg) y el gráfico de la supervivencia se trazó, prueba estadística log-rank mostró P & lt; 0,005 (**). En caso de control, se encontró que la mediana de supervivencia para ser 59 días y en caso de tratarse 4a no está definido (valor mostró un máximo de 250 días). C. aspecto bruto de los ratones tratados 4a y tumorales sin tratar y de sus órganos seleccionados a 25
días del tratamiento. a. ratón sin tumor, b. ratón portador de un tumor, c. teniendo ratón después del tratamiento con 4a, d tumor. tejido muslo de ratón normal, e. tumor, f. el tejido del muslo de un ratón tratado, g. hígado de ratón normal, h. hígado de un ratón del tumor, i. hígado de un ratón tratado 4a, j. de bazo de un ratón normal, k. de bazo de un ratón con tumor, l. bazo de un ratón tratado.
Más importante aún, se encontró que el tratamiento con 4a, los animales con tumores mostraron una diferencia significativa en la tasa de supervivencia en comparación con el control del tumor sin tratar (Fig. 5B). Mientras que los animales de control sobrevivieron durante sólo un máximo de 70 días después del desarrollo del tumor, la mayoría de los ratones tratados con 4a sobrevivieron durante más de 250 días que indican un aumento de ~ 4 veces en la duración de la vida (Fig. 5B). Por lo tanto, nuestros resultados demuestran que el tratamiento 4a redujo significativamente la carga tumoral y el aumento de la esperanza de vida de los animales.
La evaluación histológica se realizó también en dos momentos diferentes (25
º y 45
º día ) de tratamiento. Las secciones de tejido tumoral de un ratón tratado 25 días mostraron muchos núcleos teñidos con hematoxilina con poca tinción citoplásmica que indican la proliferación celular activa, mientras que en el caso de los controles, hay otras células que no sean los núcleos de los músculos esqueléticos fueron teñidas (Fig. S3A). tejidos tumorales tratadas 4a mostraron una reducción significativa en las células en proliferación (Fig. S3A). Muestras de tejido de muslo después de 45
º día de tratamiento mostraron insignificante número de células proliferantes y eran más comparable con la de los tejidos normales, mientras que las células proliferantes eran abundantes en ratones portadores de tumores, donde se aplicó ningún tratamiento (Fig. S3 A). Para analizar si el tratamiento 4a tenía ningún efecto adverso sobre otros tejidos, las secciones de hígado se analizaron mediante hematoxilina y eosina (Fig. S3C, D). Nuestros resultados mostraron hipertrofia de los hepatocitos en tanto portador de un tumor y 4a ratones tratados. Sin embargo, fue restaurada de nuevo a normal sólo en los casos en que el tumor retrocedido después del tratamiento con el compuesto 4a, a diferencia de los ratones no tratados en los hepatocitos irregulares aún se observaron (Fig. S3C, D).