Extracto
La quimioterapia es un tratamiento primario para el cáncer, pero su eficacia es a menudo limitada por los efectos adversos de los fármacos citotóxicos. administración dirigida de fármacos puede reducir la toxicidad no específica de la quimioterapia por dirigir selectivamente fármacos contra el cáncer para las células tumorales. proteína MUC1 es un objetivo atractivo para poseer la administración de fármacos específicos de tumor a su sobreexpresión en la mayoría de adenocarcinomas. En este estudio, una novela MUC1 aptámero se explota como el ligando de direccionamiento para llevar a la doxorubicina (Dox) a las células cancerosas. Hemos desarrollado un aptámero de ADN 86-base (MA3) que une a un epítopo de péptido de MUC1 con un
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d de 38,3 nM y reactividad cruzada mínima a la albúmina. Uso de cáncer de pulmón A549 y células MCF-7 de cáncer de mama como modelos MUC1-expresión, MA3 se encontró que se unen preferentemente a las células MUC1-positivo, pero no MUC1-negativas. Un complejo de aptámero-doxorrubicina (Apt-Dox) fue formulado por intercalando doxorrubicina en la estructura del ADN de MA3. Apt-Dox se encontró capaz de llevar a la doxorubicina en células tumorales MUC1-positivo, mientras que reduce significativamente el consumo de drogas por las células MUC1-negativas. Por otra parte, Apt-Dox conservó la eficacia de la doxorubicina frente a células tumorales MUC1-positivo, pero redujo la toxicidad para las células MUC1-negativos (P & lt; 0,01). Los resultados sugieren que el aptámero MUC1 puede tener utilidad potencial como ligando de direccionamiento para la entrega selectiva de agente citotóxico para tumores MUC1 que expresa
Visto:. Hu Y, Duan J, Zhan Q, F Wang, Lu X, Yang XD (2012) Novela MUC1 aptámero entrega selectiva agente citotóxico para las células cancerosas in vitro. PLoS ONE 7 (2): e31970. doi: 10.1371 /journal.pone.0031970
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Septiembre, 2011; Aceptado: January 19, 2012; Publicado: 22 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Hu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos del Ministerio chino de Ciencia y Tecnología (2011CB933504, 2011CB911004, 2011CB911003) y la Fundación de Ciencias Naturales de china (81071870)
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la quimioterapia es un tratamiento para el cáncer esencial, especialmente para la enfermedad metastásica en etapa tardía. Sin embargo, la eficacia de la quimioterapia es a menudo limitada por los efectos adversos de los agentes citotóxicos que se emplean en la mayoría de los regímenes terapéuticos. Un problema importante asociado con fármacos citotóxicos es que causan daños tanto a las células cancerosas y tejido normal, la generación de efectos adversos graves que a menudo limitan la intensidad y la duración de la quimioterapia. En consecuencia, a menudo es difícil para los fármacos citotóxicos para eliminar todas las células cancerosas en el cuerpo, resultando en el fracaso del tratamiento y de mal pronóstico. Tal falla subraya la necesidad de desarrollar una terapia cada vez más potente, con una toxicidad reducida. Un enfoque para lograr el objetivo se dirige la terapia del cáncer, en la que los fármacos anticancerosos se entregan de forma selectiva a las células cancerosas, por lo que la citotoxicidad contra tumor se mejora mientras que los efectos adversos reducidos. terapia del cáncer dirigida mantiene la promesa en la mejora de la eficacia contra el cáncer. Se ha informado de que los portadores de aptámero guiada que contienen paclitaxel pueden mejorar significativamente la eficacia contra el cáncer de próstata en modelos animales [1]. Los anticuerpos monoclonales también se han unido por enlace covalente a los medicamentos para la terapia dirigida contra el cáncer [2]. Un estudio de emtansina trastuzumab (T-DM1), un conjugado del anticuerpo humanizado anti-HER2 y una droga química, se encuentra actualmente en ensayos clínicos de fase III [3].
Un sistema de administración dirigida de fármacos típica suele consistir de un medicamento contra el cáncer y un ligando de direccionamiento, que puede se une específicamente a los marcadores tumorales que expresan abundantemente en las células del cáncer [4]. Un marcador tumoral ideal para la terapia dirigida debe ser una proteína de membrana que se sobreexpresa en la superficie de las células cancerosas, con relativamente baja expresión en el tejido normal. MUC1 es una glicoproteína transmembrana grande y bien caracterizadas que pueden servir potencialmente como la diana para la terapia contra el cáncer. Su expresión se incrementa en al menos 10 veces en la mayoría de los adenocarcinomas malignos, incluyendo el cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de colon, lo que es un marcador tumoral atractivo para la terapia dirigida [5]. Además del marcador tumoral, el ligando de metas de tumor es también un elemento importante para la terapia del cáncer dirigida. Un ligando de direccionamiento ideal debe tener alta afinidad de unión para el marcador de tumor, con una buena especificidad y baja inmunogenicidad [6]. Últimamente, nuevos agentes de direccionamiento, incluyendo aptámeros [7], péptidos cortos [8] y otras moléculas pequeñas [9], se han convertido en la nueva generación de orientación moléculas. Los aptámeros son oligonucleótidos monocatenarios que pueden unirse a moléculas diana con alta afinidad y especificidad. En comparación con los anticuerpos monoclonales, aptámeros poseen ventajas distintivas como ligando dirigido: alta afinidad por la unión a la mayoría de las moléculas, la síntesis de un coste limitado, de baja inmunogenicidad, y el pequeño tamaño que le permite penetrar tumores sólidos [10]. Debido a estas ventajas, los aptámeros se han empleado como nuevos ligandos de orientación en los sistemas de administración de fármacos contra el cáncer de próstata [11], [12], [13] y la leucemia [14]. Para el marcador tumoral de MUC1, Ferreira et al han desarrollado varios aptámeros que pueden unirse a las células del tumor MUC1-positivas [15]. También se ha demostrado que los aptámeros MUC1 se podrían emplear para entregar selectivamente agente fototerapia a las células cancerosas
in vitro
[16].
Los fármacos citotóxicos son los principales componentes de la mayoría de los regímenes de quimioterapia para el cáncer tratamiento. Por tanto, es importante para explorar si MUC1 aptámero puede ser utilizado directamente para entregar selectivamente agente citotóxico a las células cancerosas. Hasta ahora, sin embargo, ningún estudio ha sido reportado en la literatura. Aquí, en este estudio, hemos desarrollado un novedoso MUC1 aptámero, y se evaluó su capacidad para la entrega de doxorubicina a las células cancerosas
in vitro
. En concreto, se seleccionaron un aptámero de ADN 86-base (MA3 denominado) contra un epítopo de péptido de MUC1, y evaluamos su afinidad de unión a las células MUC1-positivos y negativos. Para explorar la especificidad de unión del aptámero, también se evaluó su unión a la albúmina, que es la proteína más abundante en el plasma, y puede unirse no específicamente a aptámeros e interferir con su función de orientación. La doxorubicina es uno de los fármacos anticancerígenos más ampliamente utilizados, y puede inhibir la proliferación de las células cancerosas a través de intercalarse en la estructura del ADN en los núcleos celulares. Un complejo de aptámero-doxorrubicina (Apt-Dox) fue formulada mediante la incorporación de doxorrubicina en la estructura del aptámero MA3. Ahora informe que Apt-Dox puede entregar de forma selectiva a las células doxorrubicina MUC1-positivo
in vitro
.
Materiales y Métodos
Reactivos
cebadores de oligonucleótidos se sintetizados por Invitrogen (Shangai, china). Los péptidos de% de pureza de al menos 95 fueron sintetizados por Genetech SBS (Beijing, China). albúmina de suero bovino (BSA) se adquirió de Tbdscience (Tianjin China). microesferas de urea-formaldehído magnéticas monodispersas se adquirieron de línea de base Chromtech (Tianjin China). La tripsina se adquirió de Amresco (US). perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina se adquirieron de Promega (US). 1-etil-3- (3-dimethyllaminopropyl) carbodiimida (EDC) se adquirió de Sigma (EE.UU.).
Las líneas celulares
cáncer de mama humano (MCF-7), el cáncer de hígado humano (HepG2), cáncer de pulmón humano (A549), y las células normales del hígado humano (L02) se obtuvieron del Centro de células de la Academia china de Ciencias médicas (Pekín, china). Las células se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y una mezcla de penicilina /estreptomicina. Las células fueron cultivadas a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO
2. Todos los experimentos se realizaron en las células en fase de crecimiento exponencial.
Inmovilización de blanco en perlas magnéticas
El objetivo para la selección de aptámeros es un péptido 9-AA (peptide1) con la secuencia de APDTRPAPG. La conjugación de la diana a perlas magnéticas se llevó a cabo a través de la reticulación de -COOH y -NH2. Dos g de peptide1 se mezcló con 5 × 10∧5 perlas magnéticas carboxiladas, y se incubaron con 200 EDC l (40 mM) a temperatura ambiente con agitación suave durante 2 h. Las perlas magnéticas se lavaron a continuación tres veces con tampón de Hanks, y se almacenaron a 4 ° C. Se empleó un método similar para conjugar las perlas con otras sustancias, incluyendo BSA y un 29-AA largos péptidos con la secuencia de GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP (peptide2).
biblioteca SELEX y cebadores
Una biblioteca de ADN de partida que consiste en oligonucleótidos 86-mer con 40 secuencias de bases centrales de largo aleatorios se sintetizó. La secuencia de la biblioteca es 5'AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-N40-CACAGACACACTACACACGCACA3 ', donde N representa un nucleótido aleatorizado de cualquiera de A, G, C o marcado con FITC T. Un cebador 5' (5'-FITC-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-3 ') y una cebador 3 '(5'-B-TGTGCGTGTGTAGTGTGTCTGTG-3' marcado con biotina) se utilizaron en la PCR para la síntesis de doble marcado, las moléculas de ADN de doble cadena, que luego se mezcló con perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina durante 10 min a temperatura ambiente. Después de la desnaturalización en condición alcalina (NaOH 0,1 M), el sentido de FITC-conjugado de ADN de una sola hebra (ssDNA) se separó de la hebra de ssDNA antisentido marcado con biotina con perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina y se utiliza para la selección de aptámeros.
selección in vitro de los aptámeros de unión a diana
Los procedimientos de selección fueron los siguientes. La piscina ssDNA (200 pmol) se calentó primero a 95 ° C durante 5 min y después se enfrió inmediatamente a 0 ° C en tampón (tampón Hanks) de unión por 15 min antes de la unión a diana. Para reducir la interferencia de fondo, 0,1 mg de ADN de esperma de salmón /ml y 1 mg /ml se añadieron de BSA al tampón de unión. En la ronda de selección inicial, las perlas recubiertas de peptide1 se suspendieron en 200 l de tampón de unión que contenía 200 pmol de ssDNA al azar. Después de incubar la mezcla a 37 ° C durante 30 min con agitación suave, los oligonucleótidos no unidos se eliminaron lavando cuatro veces con 500 l de tampón de unión. Posteriormente, los oligonucleótidos de talón unida mezclas fueron amplificados por PCR con FITC o cebadores marcados con biotina (25 ciclos de 40 segundos a 94 ° C, 30 seg a 65 ° C, 40 seg a 72 ° C, seguido de 10 min a 72 ° C, la polimerasa Taq y dNTPs se obtuvieron de Takara). El ADN de doble cadena resultante de PCR se separó en ssDNA a través de procedimiento descrito anteriormente. El sentido seleccionado ssDNA separado de la cadena de ADN antisentido biotinilado por perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina se utilizó para la siguiente ronda de SELEX. Después de varias rondas de selección, la combinación de ADNss seleccionada se amplificó por PCR utilizando cebadores no modificados y se clonó en Escherichia coli con el kit de clonación TA para la secuenciación de ADN.
Citometría de flujo análisis
Para controlar el enriquecimiento de candidatos aptámero después de la selección, la combinación de ADNss marcado con FITC se incubó con perlas magnéticas recubiertas de peptide1 en 200 l de tampón de selección que contiene 10% de FBS a 37 ° C durante 30 min. Las perlas se lavaron dos veces con 0,5 ml de tampón de unión y luego se suspendieron en 0,2 ml de tampón de unión. La fluorescencia FITC se determinó con un citómetro FACSCalibur (Accuri C6, US). La biblioteca ssDNA aleatorio marcado con FITC se utilizó para generar la señal de control.
La afinidad de unión de aptámeros se determinó incubando perlas magnéticas peptide1 recubierto con concentraciones variables de aptámero marcado con FITC en 200 l de tampón de unión en 37 ° C durante 30 min. Las perlas se lavaron dos veces con 0,5 ml de tampón de unión, en suspensión en 0,2 ml de tampón de unión, y se sometieron a citometría de flujo análisis. La biblioteca de ADNss no seleccionado marcado con FITC se utilizó como control negativo para determinar la unión no específica. Todos los experimentos de ensayo de unión se repitieron tres veces. La intensidad de fluorescencia media de diana marcada por aptámeros se utilizó para calcular para la unión restando la intensidad media de fluorescencia de la unión no específica de no seleccionada biblioteca de ADN [17] específico. Las constantes de equilibrio de disociación (
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d) de la interacción aptámero-peptide1 se obtuvieron mediante el ajuste de la dependencia de la intensidad de fluorescencia de la unión específica de la concentración de los aptámeros a la ecuación Y = B max X /(Kd + X).
para evaluar la unión de aptámeros de objetivo específico, el aptámero marcado con FITC se incubó separadamente con peptide1-, peptied2-, o perlas magnéticas recubiertas con BSA. Las perlas se lavaron dos veces con 0,5 ml de tampón de unión, se suspendieron en 0,2 ml de tampón de unión, y se analizaron por citometría de flujo. Para evaluar la unión a células aptámero, las células se rasparon de la botella de cultivo y se lavaron con tampón de Hanks. El aptámero marcado con FITC se incubó con 10∧5 de cualquiera de las células MCF-7, A549, HepG2 o L02 células en tampón de unión a 37 ° C durante 30 min. Las células fueron lavadas tres veces con tampón de Hanks y se analizaron con cytometrey flujo.
Células y transfección siRNA
Las células A549 se sembraron en placas de 6 pocillos a 1-3 × 10
5cells /así, cultivadas en medio libre de antibióticos durante la noche, y se transfectaron con MUC1 siRNA o controlar siRNA [18] utilizando Lipofectamine 2000 en Opti-MEM I reducido medio de suero de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen Life Technology, Inc.). Después de 72 horas, se recogieron las células y se tiñeron con FITC marcado aptámero para citometría de flujo ensayo, y los lisados celulares se prepararon para el análisis de inmunotransferencia.
análisis de transferencia de Western
Los lisados se prepararon a partir de células subconfluentes. Cantidades iguales de proteína fueron separadas por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las inmunotransferencias se sondaron con anticuerpo anti-MUC1. Se detectaron los inmunocomplejos con peroxidasa de rábano conjugada secundaria de anticuerpos y mejorar la quimioluminiscencia (ECL).
Carga del aptámero con doxorrubicina
Los aptámeros se calentaron primero a 95 ° C durante 5 minutos y luego se enfría de inmediato a 0 ° C en agua durante 15 min. Los aptámeros se incubaron en una solución acuosa de doxorubicina (3 nM) durante 1 h en una placa de 96 pocillos negro en varios dox relaciones molares aptámero /. El espectro de fluorescencia de la doxorubicina se examinó entonces por un analizador de Synergy4 (? Ex = 488 nm, λEm = 500-700 nm). Marcado con FITC Apt-Dox o Apt-Dox se incubaron con células A549 en tampón de unión a 37 ° C durante 30 min. Después, las células se lavaron tres veces con tampón de Hanks y se analizaron con cytometrey flujo.
La captación celular de doxorubicina
La captación celular específica de Apt-Dox por celular A549 MUC1-positivo se estudió mediante el escaneo de fluorescencia confocal La microscopía (Perkin Elmer Ultraview, EE.UU.) y citometría de flujo. células HepG2 se utilizó como un control MUC1-negativas. Las células se dejaron adherir a un cubre de vidrio durante 24 h. Las células fueron incubadas con 1,5 M de Dox o aptámero-Dox durante 2 horas a 37 ° C. Después de ser lavado dos veces con tampón Hanks, las células se fijaron con 4% de formaldehído durante 10 min y se analizaron por microscopía confocal de barrido de fluorescencia.
Para citometría de flujo análisis, las células se rasparon de la botella de cultivo y se lavaron dos veces con tampón de Hanks. Las células se incubaron con 1,5 mM Dox o aptámero-Dox durante 4 horas a 37 ° C, y se lavaron dos veces con tampón Hanks. Las células fueron fijadas con 4% de formaldehído durante 10 min y se analizaron con cytometriy flujo.
MTS viabilidad de las células de ensayo
Para evaluar la citotoxicidad de Apt-Dox o Dox contra A549 y las células HepG2, ambas líneas celulares se cultivaron primero en placas de 96 pocillos, y después co-incubaron a 37 ° C con Apt-Dox, Dox, o aptámero a una concentración de 3 M durante 4 h. Las células se lavaron con tampón de Hanks por dos veces, y se cultivaron durante otras 48 h. Posteriormente, se utilizó el ensayo MTS (Promega, EE.UU.) para determinar la viabilidad de las células según el protocolo estándar descrito por el fabricante.
Estadísticas
El análisis estadístico se realizó mediante el Sistema de Análisis Estadístico (SAS, versión 9.2 ). ANOVA de una vía con menor diferencia significativa de Fisher (LSD) comparaciones post hoc en el intervalo de confianza del 99% se utilizó para las comparaciones estadísticas. Todos los datos se presentan como un valor medio con su desviación estándar indicada (media ± DE).
Resultados
selección de aptámeros y caracterización
Se realiza el núcleo de la proteína extracelular de MUC1 de número variable de una secuencia de repetición en tándem altamente conservada compuesta de 20 aminoácidos (TAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGS) [19]. Entre la repetición en tándem, la secuencia de APDTRPAPG había sido identificado como el péptido epítopo inmunodominante más [20], y fue utilizado como diana para la selección de aptámeros MUC1 en investigaciones anteriores [15]. Aquí, en este estudio, que también se utiliza esta péptidos como el objetivo en nuestro proceso SELEX. Los péptidos diana se conjuga covalentemente a perlas magnéticas utilizando EDC como catalizador. Durante cada ronda de selección, las perlas se incubaron con combinación de ADNss marcado con FITC, y el enriquecimiento de los aptámeros se controló por citometría de flujo. En comparación con el ADN al azar de la piscina biblioteca, una cantidad cada vez mayor de ssDNA obligado a dirigirse recubierto de perlas magnéticas después de cada ronda de selección (Fig. 1). Los aptámeros se clonaron posteriormente, y 50 clones fueron analizados para una caracterización adicional. Entre estos clones, uno apatmer denomina MA3 mostró relativamente alta unión a los péptidos MUC1 objetivo. La secuencia de ADN de la MA3 aptámero es 5′AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGGACTGCAACCTATGCTATCGTTGATGTCTGTCCAAGCAACACAGACACACTACACACGCACA3′.
Compared con la piscina de ADN al azar de partida (histograma sombreado), citometría de flujo reveló un aumento en la intensidad de fluorescencia de aptámeros unido al péptido MUC1 (APDTRPAPG) después de la rondas de selección tercera (la curva gris) y hacia atrás (la curva de negro).
especificidad de unión es importante para la evaluación del rendimiento de aptámeros. Desde la albúmina es la proteína más abundante en la sangre, se analizó la unión del aptámero MA3 a la albúmina. perlas de albúmina o péptidos MUC1 recubiertos se incubaron con MA3 marcado con FITC, y se analizaron por citometría de flujo. Se utilizó ADN no seleccionado al azar de la biblioteca de la piscina como control. Tal como se presenta en la Figura 2, el aptámero MA3 genera una unión significativa a los péptidos de MUC1 (Fig. 2A), sino una unión a BSA similar a la generada por el ADN aleatorio (Fig. 2B) relativamente débil. Los resultados sugieren que, entre los péptidos de MUC1 y la albúmina, el aptámero MA3 exhibe una especificidad de orientación hacia la primera. Como comparación, se llevaron a cabo experimentos similares para otro aptámero MUC1, S2.2, que tenía la más baja
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d entre todos los aptámeros MUC1 publicados [15], [16]. Los resultados mostraron que mientras S2.2 podría unirse a péptidos MUC1 (Fig. 2C), sino que también une a la albúmina a un cierto grado (Fig. 2D). Los datos indicaron que, en comparación con S2.2, MA3 tenía una reactividad cruzada inferior a la albúmina.
perlas de MUC1-péptido (A) tratados con MA3. cuentas (B) de BSA tratados con MA3. (C) perlas de MUC1-péptido tratados con S2.2. perlas (D) de BSA tratados con S2.2. Los histogramas rellenos representan las señales fluorescentes de control generadas por el ADN al azar marcado con FITC de la piscina de la biblioteca.
Para evaluar cuantitativamente la afinidad de unión del aptámero para MUC1, perlas recubiertas con péptidos MUC1 se incubaron con FITC marcada con MA3 de diversas concentraciones (Fig. 3A). Utilizando el análisis de regresión no lineal, se encontró que el aptámero tener un
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d de 38,3 nM. A fin de evaluar si el aptámero MA3 se uniría a la estructura de MUC1, que también examinó su unión a un péptido 29-AA (GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP) que contiene toda la secuencia de repetición en tándem (TAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGS) que compone el núcleo de la proteína MUC1 extracelular. Los péptidos 29-AA se conjugaron covalentemente a perlas magnéticas, que se incubaron con MA3 marcado con FITC y se analizaron por citometría de flujo. Se utilizó ADN aleatorio marcado con FITC de la piscina biblioteca como control. Como se muestra en la Fig. 3B, MA3 genera una señal de fluorescencia que fue significativamente más potente que el ADN al azar, lo que indica que el aptámero también podría unirse a una estructura que contiene toda la secuencia de repetición MUC1 tándem. Puesto que el dominio extracelular de la proteína del núcleo MUC1 se compone sobre todo de las repeticiones en tándem, es posible que el aptámero MA3 puede reconocer la estructura MUC1 expuesto en la superficie de las células tumorales que expresan MUC1-.
(A) Ensayo cuantitativo de la afinidad entre marcado con FITC MA3 y el epítopo MUC1 (APDTRPAPG). (B) La citometría de flujo análisis de unión entre marcado con FITC MA3 y el péptido MUC1 26-AA (GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP). El histograma lleno es la fluorescencia de fondo de control generada por el ADN marcado con FITC azar del fondo de la biblioteca.
MA3 aptámero se une selectivamente a las células tumorales que expresan MUC1-
Para evaluar si el aptámero MA3 se uniría a células de cáncer de MUC1 que expresa, marcado con FITC MA3 se incubó con ya sea la (A549 o MCF7) MUC1-positivas [21], [22] o la MUC1-negativo (HepG2 o L02) líneas de células [21], [23]. Las células fueron luego analizadas por citometría de flujo, usando las células incubadas con el ADN al azar marcado con FITC como control. Los perfiles de citometría de flujo se presentan en la Figura 4. Para las líneas celulares de MUC1-positivo A549 y tratamiento MCF7, MA3 señales de fluorescencia generadas que fueron significativamente más potente que la del tratamiento de ADN aleatorio (Fig. 4A y B). Sin embargo, para las líneas celulares de MUC1-negativo HepG2 y L02, el tratamiento resultó en MA3 señales de fluorescencia que eran similares a la del tratamiento de ADN aleatorio (Fig. 4C y D). Los resultados indicaron que el aptámero MA3 podría unirse preferentemente a las células de cáncer de MUC1-positiva, y que el aptámero puede reconocer la estructura de MUC1 en estas células.
Los histogramas se generaron después de incubar MA3 marcado con FITC con A549 (A ), células MCF7 (B), HepG2 (C), y L02 (D), respectivamente. Los histogramas rellenos representan las señales de fluorescencia de control generadas por azar de ADN marcado con FITC de la piscina biblioteca.
MUC1 expresión influye en la unión del aptámero a las células tumorales
Para investigar más a fondo el unión del aptámero a las células tumorales MUC1-positivo, la expresión de la proteína MUC1 en A549 y las células HepG2 se evaluaron mediante transferencia Western con el anticuerpo anti-MUC1. Tal como se presenta en la Figura 5A, mientras que las células A549 expresan la proteína MUC1 en cantidad suficiente, las células HepG2 no lo hicieron, lo que sugiere que el A549 era de hecho una línea celular de MUC1-positivas y que HepG2 fue una línea celular de MUC1-negativo. Los resultados están de acuerdo con varios estudios publicados, que analizó ampliamente la expresión de la MUC1 en diversas líneas celulares y claramente identificados como MUC1 A549-positivo y HepG2 como la línea celular de MUC1-negativas [18], [24].
(A) transferencias Western de extractos de proteínas de las células A549, células HepG2, células A549 tratadas con ARNsi de control, y las células A549 tratadas con MUC1 siRNA, respectivamente. La actina también se transfirió para servir como control. (B y C) La citometría de flujo evaluación de la apatamer de unión a las células A549 tratadas con MUC1 siRNA (B) o ARNsi de control (C). Los histogramas rellenos representan las señales de fluorescencia de control generadas por azar de ADN marcado con FITC de la piscina biblioteca.
Para evaluar la influencia de la expresión de MUC1 en el aptámero de unión a las células MUC1-positivo, se utilizó MUC1 siRNA que se había demostrado previamente capaz de derribar la expresión de MUC1 [18]. El siRNA se transfectó en las células A549 MUC1-positivo, y se confirmó con el western blot que podría regular negativamente la expresión de MUC1 (Fig. 5A). las células A549 se trataron con MUC1 siRNA o un control de siRNA, se incubaron con aptámero marcado con FITC, y se evaluaron por citometría de flujo. Tal como se presenta en la figura 5B y C, la unión a las células aptámero se redujo significativamente después de la regulación por disminución de la expresión de MUC1 (Fig. 5B), mientras que la unión a las células tratadas con ARNsi de control no se vieron afectados (Fig. 5C). Los resultados sugieren que la expresión de MUC1 en células diana influenciada la afinidad del aptámero a estas células, y que la pérdida de la proteína MUC1 podrían reducir la unión significantl aptámero
y
.
Carga del aptámero con Dox
con el fin de ofrecer Dox a las células tumorales MUC1-positivo, un aptámero-doxorrubicina compleja (Apt-Dox) se formó intercalando doxorrubicina en la estructura del ADN del aptámero MA3. Para evaluar si Dox era de hecho incorporado en MA3, hicimos uso del fenómeno que la fluorescencia de Dox se apagaría después de intercalarse en el ADN [25]. En concreto, hemos llevado a cabo estudios entre MA3 y Dox, y la espectroscopia de fluorescencia de unión empleada para evaluar la señal fluorescente generada por la doxorrubicina. Como se muestra en la Figura 6A, se observaron disminuciones secuenciales en el espectro de fluorescencia nativa de Dox cuando una concentración fija de Dox se incubó con una relación molar creciente de aptámero MA3. Cuando el aptámero /dox relación molar llegó a 0,1, el espectro de fluorescencia de Dox estaba en el nivel más bajo y no cambió más, lo que indica que la mayor parte dox había incorporado en la estructura del ADN de MA3 en esta relación de aptámero /dox.
(a) fluorescencia espectros de solución de doxorrubicina se mezcló con el aumento de relaciones molares del aptámero MA3 (de arriba a abajo: 0, 0,001, 0,003, 0,005, 0,01, 0,03, 0,1, y 1). (células B) A549 tratados con aptámero MA3 marcado con FITC. (células C) A549 tratados con marcado con FITC Apt-Dox. Los histogramas rellenos representan las señales de fluorescencia de control generadas por el ADN al azar marcado con FITC de la piscina de la biblioteca.
Para investigar si la intercalación de doxorrubicina en aptámero interferiría con la afinidad del aptámero a las células tumorales MUC1-positivos , la unión de Apt-Dox complejo a las células A549 se evaluó con citometría de flujo, y en comparación con la de MUC1 aptámero solo. Como se muestra en la figura 6B y C, Apt-Dox complejo (Fig. 6C) tenía una afinidad para las células A549 que era similar a MUC1 aptámero solo (Fig. 6B). Los resultados sugieren que la intercalación de doxorrubicina en MUC1 aptámero no interfirió significativamente con la unión del aptámero a las células tumorales MUC1-positivo.
aptámeros como vehículos para la entrega selectiva de doxorrubicina a las células cancerosas positivas MUC1
La absorción no selectiva de DOX libre por el cáncer y las células normales es una causa principal de sus efectos adversos contra el tejido normal. Cuando Dox se intercala en la estructura del ADN del aptámero MUC1 (Apt-Dox), el complejo puede unirse preferentemente a las células de cáncer de MUC1-positivo. Para probar este postulado, las propiedades de fluorescencia de la doxorubicina se utilizaron para evaluar la absorción del fármaco por las células, ya sea MUC1-positivo (A549) o MUC1-negativo (HepG2). Las células se incubaron por separado con conexión Dox o Apt-Dox y se analizaron por microscopía confocal. Los resultados mostraron que la fluorescencia roja de la droga fue igualmente fuerte en las dos líneas celulares tratados con DOX libre (Fig. 7A y B), indicando que la absorción de DOX libre por estas células era no selectivo. En contraste, cuando las células fueron tratadas con Apt-Dox, la fluorescencia en las células A549 MUC1-positivas fue significativamente mayor que en las células HepG2 MUC1-negativos (Fig. 7C y D), y que la absorción del fármaco por las células HepG2 fue notablemente disminuido. Los resultados sugieren que Apt-Dox exhibió celular especificidad y podría ser tomado de forma selectiva por las células MUC1-positivos. Curiosamente, la distribución intracelular del fármaco en las células A549 fue principalmente limitada a los núcleos con conexión Dox, sino que se extendió a citoplasma en la fijación de Apt-Dox, lo que sugiere que los mecanismos de absorción de libre Dox y Apt-Dox pueden ser diferentes.
(a-D) imágenes de microscopía confocal de barrido láser de A549 y células HepG2 después de la incubación con doxorubicina libre (a y B) o apt-Dox (C y D) durante 2 horas. (E y F) La citometría de flujo perfiles de histograma de A549 (E) y células HepG2 (F) después de la incubación con cualquiera de doxorrubicina libre (curvas negras) o Dox APT-(curvas grises). Los histogramas rellenos son las señales de control generadas por las células no tratadas.
Para estudiar más a fondo si Apt-Dox podría ser tomado de forma selectiva por las células positivas MUC1, citometría de flujo también fue empleado para controlar la fluorescencia generada por la doxorubicina después de incubar las dos líneas celulares con conexión Dox o apt-Dox. Para las células A549 MUC1-positivas, las señales fluorescentes generadas por el libre Dox o apt-Dox fueron similares (Figura 7E.); mientras que para las células HepG2 MUC1-negativo, la señal fluorescente generada por Apt-Dox era notablemente menor que la generada por el libre Dox (Fig. 7F). De nuevo los resultados sugirieron que Apt-Dox podría ser tomado de forma selectiva por las células cancerosas positivas MUC1. En conjunto, nuestros microscopía y citometría de flujo Los datos indican que el aptámero MA3 puede servir como un vehículo para la administración dirigida de Dox a las células cancerosas MUC1-positivo.
Apt-Dox reducido selectivamente citotoxicidad para las células de cáncer de MUC1-negativos
Dado que la absorción de la doxorrubicina se redujo en las células MUC1-negativos tratados con Apt-Dox, es posible que la citotoxicidad de estas células también se reduciría. Para probar el postulado,
in vitro
citotoxicidad causada por Apt-Dox o libre Dox se comparó en HepG2 y líneas de células A549. Tal como se presenta en la Figura 8A, para las células HepG2 MUC1-negativas, la citotoxicidad generada por Apt-Dox era de hecho disminuyó en comparación con la generada por libre Dox (P & lt; 0,01). Sin embargo, para las células A549 MUC1-positivo, no se detectó diferencia entre la citotoxicidad generada por Apt-Dox o Dox libre (Fig. 8B). Los resultados sugieren que Apt-Dox tiende a reducir el daño a las células MUC1-negativo al tiempo que conserva la eficacia de la doxorubicina frente a células MUC1-positivo. Cabe señalar que aptámero solo era no tóxico hacia las dos líneas celulares, lo que indica que el aptámero en sí era relativamente segura a las células y que la citotoxicidad fue causada principalmente por la doxorrubicina.
El HepG2 (A) y A549 (B se evaluaron las células) con un ensayo estándar MTS después de 48 h de incubación adicional (media ± SD, n = 6).
Discusión
la eficacia de la quimioterapia a menudo limitadas por la efectos adversos de los agentes citotóxicos que dañan el cáncer y las células normales. Una estrategia para reducir los efectos adversos de la quimioterapia se dirige la administración de fármacos a las células cancerosas. MUC1 se considera un objetivo valioso para la quimioterapia contra el cáncer ligando guiada debido a su sobre-expresión en la mayoría de adenocarcinomas. Aquí, en este estudio, utilizando la técnica SELEX y un péptido epítopo de MUC1 como objetivo, hemos desarrollado un novedoso MUC1 aptámero (MA3) con un
K
d de 38,3 nM. Se encontró que MA3 podía unirse específicamente a células de cáncer de MUC1-positiva, con reactividad cruzada mínima a la albúmina (Fig. 1,2,3,4). Además, un complejo de aptámero-fármaco (Apt-Dox) se formó intercalando doxorrubicina en la estructura del ADN del aptámero MA3 (Fig. 6).